專利名稱：截短的人乳頭瘤病毒16型l1蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒16型L1蛋白，及由其組成的類病毒顆粒，含該類病毒顆粒的疫苗及其在預防宮頸癌中的用途。

背景技術：
人乳頭瘤病毒HPV(Human Papillomavirus)屬乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬，為無包膜DNA病毒。病毒基因組為雙鏈閉環DNA，大小約為7.2～8kb，具有8個開放框。基因組按功能的不同可以分為三個區域①早期區(E)，約4.5kb，編碼E1、E2、E4～E76個與病毒復制，轉錄及轉化有關的非結構蛋白；②晚期區(L)，約2.5kb，編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2；③長調控區(LCR)，位于L區末端與E區起始端之間，長約800～900bp，不編碼任何蛋白，含DNA復制、表達調控元件。病毒顆粒直徑為45～55nm，核衣殼呈20面體對稱，有72個殼微粒，由L1及L2組成。
目前已知的HPV約有90多種亞型，在人群中主要引起皮膚，粘膜的疣狀病變。根據其與腫瘤發生的關系又可分為3組①低或無致癌風險組，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌風險組，包括HPV 31、33、35、51、52；③高度癌風險組，包括HPV16、18、45、58。
HPV分子流行病學調查證實，高危型HPV感染是宮頸癌發生的重要啟動因子。在所有宮頸癌標本中HPV DNA檢出率高達80％以上，其中HPV16約占60％，其它高危型如HPV18，31，45，58)約占25％-30％(Clifford，G.，S.Franceschi，et al.Vaccine 2006.24 Suppl3S26-34.)。
宮頸癌是一種常見見的女性惡性腫瘤，其發病率僅次于乳腺癌，是嚴重威脅女性健康的殺手。據統計每年世界范圍內約有490,000例左右的新發病例，約有270,000人死于該疾病(Boyle，P.，and J.Ferlay.Ann Oncol 2005，16481-8.)。在所有宮頸癌病例中，發生于發展中國家的占了約83％，在這些國家中，宮頸癌甚至能夠占到女性惡性腫瘤的15％。而在發達國家，這個數字僅占到1.5％。在撒哈拉以南地區，中南亞，拉丁美洲，東亞均為宮頸癌的高發區。我國也屬于宮頸癌高發區。在陜西略陽縣，已婚婦女中宮頸癌的發病率高達1026/100000。因此，安全有效的HPV疫苗，特別是針對HPV16，18等高危型別的疫苗，是有效預防宮頸癌，改善廣大婦女健康狀況的有效途徑。
HPV L1蛋白為主要衣殼蛋白，分子量為55～60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多種表達系統中表達的HPV L1蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態結構與天然病毒顆粒相似的類病毒顆粒(Virus-LikeParticle，VLP)。該種類病毒顆粒為二十面體立體對稱結構，由72個L1蛋白的五聚體組成。其保留了病毒顆粒的天然表位，具有較強的免疫原性，可誘導針對同型HPV病毒的中和抗體。(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992 Proc Natl Acad Sci USA 89(24)12180-4.)并且，類病毒顆粒并不帶有病毒核酸，并無潛在致癌危險，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成為HPV疫苗發展的主要方向。
HPV VLP疫苗研制的關鍵是能夠大量高效制備VLP樣品。目前較為常用的表達系統可以分為真核表達系統及原核表達系統。
常用的真核表達系統有痘病毒表達系統、昆蟲桿狀病毒表達系統、酵母表達系統。在真核表達系統中所表達的HPV L1蛋白天然構象破壞少，能自發的形成VLP，往往只需進行簡單的密度梯度離心即可得到純化的VLP，為純化工作提供極大的便利。但是由于真核表達系統的表達量低，培養成本高，給大規模工業化生產帶來了極大困難。目前已上市HPV疫苗Gardasil

采用了釀酒酵母表達系統，其表達量低，生產成本高，因此該產品價位偏高，影響其廣泛應用。
原核表達系統中利用大腸桿菌表達系統表達HPVL1蛋白已有報道。例如有報道利用大腸桿菌表達HPV16 L1蛋白(Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)3081-9)。但是由于大腸桿菌所表達的HPV L1蛋白大多失去其天然構象，不能產生針對HPV的保護抗體。或者上述蛋白雖然通過包含體純化，復性等步驟也可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).JVirol Methods 53(1)75-90)，但是在復性過程中蛋白損失量大，得率低，難以在大規模生產上應用。HPV L1蛋白雖然也可以在大腸桿菌中以正確構象可溶性地表達，溶解于菌體的裂解上清中，但是表達量較低，而且上清中雜蛋白種類多且量大，要從中純化出目的蛋白難度相當大。雖然也有文獻報道通過GST融合表達的方式可以增加上清中L1蛋白的表達量，而且有助目的蛋白的純化(Li，M.，T.P.Cripe，etal.(1997).J Virol 71(4)2988-95.)，但融和蛋白的切割往往需要價格昂貴的酶，依然無法應用于大規模生產。
因此，本領域仍然需要具有低成本，能夠誘導產生針對HPV保護性抗體的HPVL1蛋白及由其組成的類病毒顆粒，從而使大規模工業化生產宮頸癌疫苗成為可能。


發明內容
本發明的目的是提供一種新的HPV16 L1蛋白，及由其組成的類病毒顆粒及含該類病毒顆粒的疫苗。
本發明人經研究出人意料地發現，在大腸桿菌表達系統能得到可以誘導針對HPV16中和抗體的截短HPV16L1蛋白，該截短的HPV16 L1蛋白經純化后得到高產率，純度至少50％的HPV L1蛋白。純化后的HPVL1蛋白經進一步處理得到可誘導針對HPV16保護性抗體的類病毒顆粒，本發明基于以上發明現已完成。
因此，本發明第一方面涉及一種(與野生型HPV16 L1蛋白相比)N端截短了4、6、8、10、20、30、或40個氨基酸的HPV16 L1蛋白。優選該截短蛋白具有序列1，2，3，4，5，6或7，特別是序列6。
本發明再一方面涉及編碼本發明截短蛋白的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。
本發明再一方面涉及包含上述載體的細胞。
本發明還涉及包含上述截短蛋白或多核苷酸或載體或細胞的組合物。
本發明再一方面涉及一種HPV16類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒含有N端截短了4、6、8、10、20、30、或40個氨基酸的HPV16 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，5，6或7的HPV16 L1蛋白，或由N端截短了4、6、8、10、20、30、或40個氨基酸的HPV16 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，5，6或7的HPV16 L1蛋白組成或形成。
本發明再一方面涉及一種獲得HPV16 L1蛋白的方法，其包括在大腸桿菌表達系統中表達截短的HPV16 L1基因片段，然后將含有該截短蛋白的裂解上清進行純化處理。
在一個優選實施方案中，獲得HPV16 L1蛋白的方法包括 a)在大腸桿菌表達系統中表達截短的HPV16 L1基因片段， b)將表達了截短HPV16 L1蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600mM中破碎，分離得到上清液， c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀， d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50％的截短HPV16 L1蛋白。
更一般性地，本發明還涉及一種獲得HPV L1蛋白例如本發明HPV16 L1蛋白的方法，其包括 a)在大腸桿菌表達系統中表達編碼HPV L1蛋白的HPV L1基因， b)將表達了HPV L1蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600mM中破碎，分離得到上清液， c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀， d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50％的HPV L1蛋白。
本發明還涉及一種預防宮頸癌疫苗，其包括本發明的HPV16 L1蛋白類病毒顆粒，優選地，所述HPV16 L1蛋白類病毒顆粒以預防宮頸癌有效量存在。優選該疫苗還包含至少一種選自HPV18L1蛋白類病毒顆粒，HPV11L1蛋白類病毒顆粒，HPV6L1蛋白類病毒顆粒，HPV31L1蛋白類病毒顆粒，HPV33L1蛋白類病毒顆粒，HPV45L1蛋白類病毒顆粒，HPV52L1蛋白類病毒顆粒，HPV58L1蛋白類病毒顆粒的類病毒顆粒；優選地，這些類病毒顆粒各自獨立地以預防宮頸癌或者相應HPV亞型感染有效量存在。該疫苗通常還包含疫苗用賦形劑或載體。
優選地，所述疫苗含有HPV16類病毒顆粒和HPV18類病毒顆粒，特別是，含有具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV16類病毒顆粒，和含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV18類病毒顆粒。更優選所述疫苗還含有HPV6類病毒顆粒和HPV11類病毒顆粒，特別是含有具有SEQ IDNO10所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV6類病毒顆粒，和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV11類病毒顆粒。
在一個特別優選的實施方案中，所述疫苗包含含有具有SEQ IDNO6所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV16類病毒顆粒，含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV18類病毒顆粒，含有具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV6類病毒顆粒，和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV11類病毒顆粒。優選地，這些類病毒顆粒各自獨立地以預防宮頸癌或者相應HPV亞型感染有效量存在。
本發明進一步涉及本發明HPV16 L1蛋白或其類病毒顆粒在制備用于預防宮頸癌疫苗中的用途。
本發明還涉及一種預防宮頸癌的方法，其包括將含預防有效量的本發明HPV16 L1蛋白疫苗給予需預防宮頸癌的人。
本發明還涉及一種獲得HPV16 L1蛋白類病毒顆粒的方法，其包括 e)將純度至少50％的截短HPV16 L1蛋白進一步通過色譜層析純化， f)將e)步驟中得到的HPV16 L1蛋白去除還原劑。
本發明還涉及一種制備用于預防宮頸癌疫苗的方法，其包括將上述類病毒顆粒與任選的一種或多種選自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58的HPV型別的類病毒顆粒及疫苗用載體或者賦形劑混和。
本發明中相關術語的說明及解釋 根據本發明，術語“大腸桿菌表達系統”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根據本發明，術語“載體”一詞指的是，可將某編碼蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可以通過轉化，轉導或者轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。舉例來說，載體包括質粒；噬菌體；柯斯質粒等等。
根據本發明，術語“截短HPV16 L1蛋白基因片段”是指在野生型HPV16 L1蛋白基因(cDNA)的5’端或3’端去掉編碼一個或者多個氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV16 L1蛋白基因全長序列舉例但不限于NCBI數據庫中如下序列AY686583.1，DQ469930.1，DQ155283.1，AF393502.1等。
“截短HPV16 L1蛋白”是指在野生型HPV16 L1蛋白的N端和/或C端去掉一個或者多個氨基酸后的蛋白質，其中野生型HPV16 L1蛋白的例子有但不限于NCBI數據庫中AY686583.1，DQ469930.1，DQ155283.1，AF393502.1等所編碼的全長L1蛋白。
根據本發明，術語“疫苗用賦形劑或載體“是指選自一種或多種，包括但不限于pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調節劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于Tween-80。佐劑舉例但不限于氫氧化鋁，氟氏完全佐劑。離子強度增強劑舉例但不限于氯化鈉。
根據本發明，術語“色譜層析“包括但不限于離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。
根據本發明，本發明的截短HPV16 L1蛋白優選如下獲得將表達有截短HPV16 L1蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100-600mM，優選200-500mM的緩沖液中進行破碎，分離破碎溶液，得到上清液，用水或低濃度鹽(通常低于破碎用的鹽濃度)降低所得上清液中鹽濃度至鹽濃度100Mm-0M，分離鹽濃度低至100Mm-0的上清液中的沉淀；將沉淀在含還原劑及鹽濃度150-2000mM優選200mM以上的溶液中重新溶解，分離，得到純度至少為50％，優選至少70％，更優選至少80％的截短HPV16 L1蛋白溶液。
根據本發明，在本發明獲得的截短HPV16 L1蛋白的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內維持pH值穩定的溶液，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。
根據本發明，所述原核宿主細胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質機破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項或者多項方法來實現； 根據本發明，在本發明獲得的截短HPV16 L1蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于是中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽，硫酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一種或幾種。優選NaCl。所用的還原劑包括但不限于DTT，2-巰基乙醇。所用量包括但不限于10mM-100mM。
根據本發明，本發明的截短HPV16 L1蛋白類病毒顆粒如下獲得將上述純度至少50％的截短HPV16 L1蛋白溶液通過例如色譜層析進一步分離，得到純化的截短HPV16 L1蛋白溶液。去除純化的截短HPV16L1蛋白溶液中的還原劑，得到截短HPV16 L1的類病毒顆粒。去除還原劑的方式包括但不限于本領域已知技術，例如，透析，超濾或者層析等。
根據本發明，本發明的截短HPVL1蛋白優選具有序列6。
根據本發明，本發明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，優選注射。
根據本發明，本發明疫苗優選單位劑型使用，其中單位劑型中截短HPV16 L1蛋白類病毒顆粒的量為5μg-80μg，優選20μg-40μg。
有益效果 目前HPV類病毒顆粒的制備所采用的表達系統可以分為真核表達系統和原核表達系統。
在真核表達系統中所表達的HPV L1蛋白天然構象破壞少，能自發的形成VLP，往往只需進行簡單的純化過程即可獲得具有正確構象的VLP。但目前真核表達系統所采用的桿狀病毒表達系統及酵母表達系統均有表達量低，培養成本高等缺陷，給大規模工業化生產帶來了極大困難。
在原核表達系統中，大腸桿菌表達系統具有培養成本低，表達量大的優點。但在大腸桿菌表達系統中表達的HPV L1蛋白往往失去正確天然構象，以包含體形式表達于沉淀中。目前對表達于包含體中蛋白進行復性依然是一個世界性難題。復性困難，效率低下，使得從包含體中獲得有正確構象的VLP在大規模生產中難以實施，只能局限于小規模的實驗室研究中。雖然HPV L1也可以正確構象可溶性形式表達于大腸桿菌裂解上清中，但是表達量低下，而且要從大腸桿菌裂解上清中種類繁多的可溶性蛋白純化出HPV L1蛋白也相當困難，往往需要借助融合表達及親和層析等手段進行純化，以上手段往往需要昂貴的酶，難以進行工業化生產。
本發明在大腸桿菌表達系統中表達N端截短HPV16 L1蛋白，并且采用溫和的手段選擇性沉淀表達在大腸桿菌裂解上清中的HPV16 L1蛋白，進一步采用含鹽緩沖液重溶HPV16 L1蛋白，使得在保持HPV16 L1蛋白正確構象前提下使其純度有了顯著提高且重溶后的目的蛋白可以直接進行離子交換層析及疏水交換層析純化獲得純蛋白。通過以上步驟獲得純化后的截短HPV16 L1截短蛋白可以組裝為類病毒顆粒，具有良好的免疫原性，可以誘導高滴度的針對HPV16的中和抗體，預防HPV16對人體的感染，是一種良好的疫苗形式。此外，本發明中采用的截短HPV16 L1蛋白在保留全長HPV16 L1蛋白的抗原性及顆粒組裝能力的同時，易于在大腸桿菌表達系統中表達，所采用的純化方法無需使用昂貴的酶，成本低廉。而且目的蛋白在純化過程中構象沒有經過劇烈的變性復性過程，損失小，可應用于大規模工業化生產。
在參考下列詳述和附圖后，本發明的這些和其它方面將是顯然的。此處公開的所有參考文獻在此均完整引用作為參考。



圖1顯示了在本發明實施例2不同步驟中HPV16N30C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。M分子量Marker；1破菌上清；2無鹽沉淀產物；3重懸后沉淀；4重懸后上清。結果顯示，HPV16N30C-L1蛋白在通過沉淀，復溶的步驟之后，純度從之前的約10％左右提高到了約70％左右。
圖2顯示了實施例3中所得經HPV16N30C-L1的HIC(疏水相互作用色譜)純化并通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示HPV16N30C-L1純度結果。1Butyl柱上柱前；2，3Butyl柱穿透；4，51mol/L NaCl洗脫；6，800mmol/L NaCl洗脫；7，500mmol/L NaCl。經過ButylSepharose 4 Fast Flow疏水柱純化，800mmol/L NaCl洗脫500mmol/LNaCl洗脫的HPV16 L1蛋白純度達到98％以上。
圖3顯示了實施例4中中所得的HPV16N30C-L1類病毒顆粒透射電鏡觀察(放大100,000倍，Bar＝0.1μm)結果。視野中可見大量半徑為25nm左右的類病毒顆粒，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致。
圖4顯示了實施例4中所得的HPV16N30C-L1類病毒顆粒的動態光散射觀測結果。結果顯示，HPV16N30C-L1類病毒顆粒的水化分子動力學半徑為25.86nm，顆粒組裝百分比為95.7％。
圖5顯示了實施例5中HPV16N30C-L1類病毒顆粒接種羊后不同階段血清中和抗體滴度。圖中箭頭所示為免疫時間。在初免一周后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，中和抗體的滴度即能達到106-107的較高水平。
圖6顯示了實施例5中HPV16N30C-L1類病毒顆粒接種兔后不同階段血清中和抗體滴度。圖中箭頭所示為免疫時間。在初免一周后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，中和抗體的滴度即能達到106的較高水平。
圖7顯示了實施例5中HPV16/18二價疫苗接種恒河猴后不同時間的血清中的HPV16總IgG抗體滴度。免疫程序為0,4W(周)。第一次免疫后，總IgG抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到20,000倍。
圖8顯示了實施例5中HPV16/18二價疫苗接種恒河猴后不同時間的血清中的HPV16中和抗體滴度。免疫程序為0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到20,000倍。
圖9顯示了實施例5中HPV16/18二價疫苗接種恒河猴后不同時間的血清中的HPV18總IgG抗體滴度。免疫程序為0,4W(周)。第一次免疫后，總IgG抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到20,000倍。
圖10顯示了實施例5中HPV16/18二價疫苗接種恒河猴后不同時間的血清中的HPV18中和抗體滴度。免疫程序為0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到20,000倍。
圖11顯示了實施例5中HPV6/11/16/18四價疫苗接種小鼠后不同時間的血清中HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗體滴度變化情況。免疫程序為0,2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到1×105-1×106。
序列列表
序列1(SEQ ID NO1)
1 MFIYILVITC YENDVNVYHI FFQMSLWLPS EATVYLPPVP VSKVVSTDEY VARTNIYYHA
61 GTSRLLAVGH PYFPIKKPNN NKILVPKVSG LQYRVFRIHL PDPNKFGFPD TSFYNPDTQR
121LVWACVGVEV GRGQPLGVGI SGHPLLNKLD DTENASAYAA NAGVDNRECI SMDYKQTQLC
181LIGCKPPIGE HWGKGSPCTN VAVNPGDCPP LELINTVIQD GDMVDTGFGA MDFTTLQANK
241SEVPLDICTS ICKYPDYIKM VSEPYGDSLF FYLRREQMFV RHLFNRAGAV GDNVPDDLYI
301KGSGSTANLA SSNYFPTPSG SMVTSDAQIF NKPYWLQRAQ GHNNGICWGN QLFVTVVDTT
361RSTNMSLCAA ISTSETTYKN TNFKEYLRHG EEYDLQFIFQ LCKITLTADI MTYIHSMNST
421ILEDWNFGLQ PPPGGTLEDT YRFVTSQAIA CQKHTPPAPK EDPLKKYTFW EVNLKEKFSA
481DLDQFPLGRK FLLQAGLEAK PKFTLGKRKA TPTTSSTSTT AKRKKRKL
序列2(SEQ ID NO2)
1 MYILVITCYE NDVNVYHIFF QMSLWLPSEA TVYLPPVPVS KVVSTDEYVA RTNIYYHAGT
61 SRLLAVGHPY FPIKKPNNNK ILVPKVSGLQ YRVFRIHLPD PNKFGFPDTS FYNPDTQRLV
121WACVGVEVGR GQPLGVGISG HPLLNKLDDT ENASAYAANA GVDNRECISM DYKQTQLCLI
181GCKPPIGEHW GKGSPCTNVA VNPGDCPPLE LINTVIQDGD MVDTGFGAMD FTTLQANKSE
241VPLDICTSIC KYPDYIKMVS EPYGDSLFFY LRREQMFVRH LFNRAGAVGD NVPDDLYIKG
301SGSTANLASS NYFPTPSGSM VTSDAQIFNK PYWLQRAQGH NNGICWGNQL FVTVVDTTRS
361TNMSLCAAIS TSETTYKNTN FKEYLRHGEE YDLQFIFQLC KITLTADIMT YIHSMNSTIL
421EDWNFGLQPP PGGTLEDTYR FVTSQAIACQ KHTPPAPKED PLKKYTFWEV NLKEKFSADL
481DQFPLGRKFL LQAGLEAKPK FTLGKRKATP TTSSTSTTAK RKKRKL
序列3(SEQ ID NO3)
1 MLVITCYEND VNVYHIFFQM SLWLPSEATV YLPPVPVSKV VSTDEYVART NIYYHAGTSR
61 LLAVGHPYFP IKKPNNNKIL VPKVSGLQYR VFRIHLPDPN KFGFPDTSFY NPDTQRLVWA
121CVGVEVGRGQ PLGVGISGHP LLNKLDDTEN ASAYAANAGV DNRECISMDY KQTQLCLIGC
181KPPIGEHWGK GSPCTNVAVN PGDCPPLELI NTVIQDGDMV DTGFGAMDFT TLQANKSEVP
241LDICTSICKY PDYIKMVSEP YGDSLFFYLR REQMFVRHLF NRAGAVGDNV PDDLYIKGSG
301STANLASSNY FPTPSGSMVT SDAQIFNKPY WLQRAQGHNN GICWGNQLFV TVVDTTRSTN
361MSLCAAISTS ETTYKNTNFK EYLRHGEEYD LQFIFQLCKI TLTADIMTYI HSMNSTILED
421WNFGLQPPPG GTLEDTYRFV TSQAIACQKH TPPAPKEDPL KKYTFWEVNL KEKFSADLDQ
481FPLGRKFLLQ AGLEAKPKFT LGKRKATPTT SSTSTTAKRK KRKL
序列4(SEQ ID NO4)
1 MITCYENDVN VYHIFFQMSL WLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL
61 AVGHPYFPIK KPNNNKILVP KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV
121GVEVGRGQPL GVGISGHPLL NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP
181PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD
241ICTSICKYPD YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST
301ANLASSNYFP TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS
361LCAAISTSET TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN
421FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP
481LGRKFLLQAG LEAKPKFTLG KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL
序列5(SEQ ID NO5)
1 MYHIFFQMSL WLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK
61 KPNNNKILVP KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL
121GVGISGHPLL NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS
181PCTNVAVNPG DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD
241YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP
301TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET
361TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT
421LEDTYRFVTS QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG
481LEAKPKFTLG KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL
序列6(SEQ ID NO6)
1 MLPSEATVYL PPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK KPNNNKILVP
61 KVSGLQYRVF RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL GVGISGHPLL
121NKLDDTENAS AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG
181DCPPLELINT VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD YIKMVSEPYG
241DSLFFYLRRE QMFVRHLFNR AGAVGDNVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP TPSGSMVTSD
301AQIFNKPYWL QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET TYKNTNFKEY
361LRHGEEYDLQ FIFQLCKITL TADIMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS
421QAIACQKHTP PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG LEAKPKFTLG
481KRKATPTTSS TSTTAKRKKR KL*
序列7(SEQ ID NO7)
1 MPVPVSKVVS TDEYVARTNI YYHAGTSRLL AVGHPYFPIK KPNNNKILVP KVSGLQYRVF
61 RIHLPDPNKF GFPDTSFYNP DTQRLVWACV GVEVGRGQPL GVGISGHPLL NKLDDTENAS
121AYAANAGVDN RECISMDYKQ TQLCLIGCKP PIGEHWGKGS PCTNVAVNPG DCPPLELINT
181VIQDGDMVDT GFGAMDFTTL QANKSEVPLD ICTSICKYPD YIKMVSEPYG DSLFFYLRRE
241QMFVRHLFNR AGAVGENVPD DLYIKGSGST ANLASSNYFP TPSGSMVTSD AQIFNKPYWL
301QRAQGHNNGI CWGNQLFVTV VDTTRSTNMS LCAAISTSET TYKNTNFKEY LRHGEEYDLQ
361FIFQLCKITL TADVMTYIHS MNSTILEDWN FGLQPPPGGT LEDTYRFVTS QAIACQKHTP
421PAPKEDPLKK YTFWEVNLKE KFSADLDQFP LGRKFLLQAG LKAKPKFTLG KRKATPTTSS
481TSTTAKRKKR KL*
序列8(SEQ ID NO8)
1 CATATGCTTC CTAGTGAGGC CACTGTCTAC TTGCCTCCTG TCCCAGTATC TAAGGTTGTA
61 AGCACGGATG AATATGTTGC ACGCACAAAC ATATATTATC ATGCAGGAAC ATCCAGACTA
121CTTGCAGTTG GACATCCCTA TTTTCCTATT AAAAAACCTA ACAATAACAA AATATTAGTT
181CCTAAAGTAT CAGGATTACA ATACAGGGTA TTTAGAATAC ATTTACCTGA CCCCAATAAG
241TTTGGTTTTC CTGACACCTC ATTTTATAAT CCAGATACAC AGCGGCTGGT TTGGGCCTGT
301GTAGGTGTTG AGGTAGGTCG TGGTCAGCCA TTAGGTGTGG GCATTAGTGG CCATCCTTTA
361TTAAATAAAT TGGATGACAC AGAAAATGCT AGTGCTTATG CAGCAAATGC AGGTGTGGAT
421AATAGAGAAT GTATATCTAT GGATTACAAA CAAACACAAT TGTGTTTAAT TGGTTGCAAA
481CCACCTATAG GGGAACACTG GGGCAAAGGA TCCCCATGTA CCAATGTTGC AGTAAATCCA
541GGTGATTGTC CACCATTAGA GTTAATAAAC ACAGTTATTC AGGATGGTGA TATGGTTGAT
601ACTGGCTTTG GTGCTATGGA CTTTACTACA TTACAGGCTA ACAAAAGTGA AGTTCCACTG
661GATATTTGTA CATCTATTTG CAAATATCCA GATTATATTA AAATGGTGTC AGAACCATAT
721GGCGACAGCT TATTTTTTTA TCTACGAAGG GAACAAATGT TTGTTAGACA TTTATTTAAT
781AGGGCTGGTG CTGTTGGTGA TAATGTACCA GACGATTTAT ACATTAAAGG CTCTGGGTCT
841ACTGCAAATT TAGCCAGTTC AAATTATTTT CCTACACCTA GTGGTTCTAT GGTTACCTCT
901GATGCCCAAA TATTCAATAA ACCTTACTGG TTACAACGAG CACAGGGCCA CAATAATGGC
961ATTTGTTGGG GTAACCAACT ATTTGTTACT GTTGTTGATA CTACACGCAG TACAAATATG
1021 TCATTATGTG CTGCCATATC TACTTCAGAA ACTACATATA AAAATACTAA CTTTAAGGAG
1081 TACCTACGAC ATGGGGAGGA ATATGATTTA CAGTTTATTT TTCAACTGTG CAAAATAACC
1141 TTAACTGCAG ACATTATGAC ATACATACAT TCTATGAATT CCACTATTTT GGAGGACTGG
1201 AATTTTGGTC TACAACCTCC CCCAGGAGGC ACACTAGAAG ATACTTATAG GTTTGTAACA
1261 TCCCAGGCAA TTGCTTGTCA AAAACATACA CCTCCAGCAC CTAAAGAAGA TCCCCTTAAA
1321 AAATACACTT TTTGGGAAGT AAATTTAAAG GAAAAGTTTT CTGCAGACCT AGATCAGTTT
1381 CCTTTAGGAC GCAAATTTTT ACTACAAGCA GGATTGGAGG CCAAACCAAA ATTTACATTA
1441 GGAAAACGAA AAGCTACACC CACCACCTCA TCTACCTCTA CAACTGCTAA ACGCAAAAAA
1501 CGTAAGCTGT AA 下面結合實施例對本發明進一步舉例描述。這些實施例是非限制性的。
實施例1具有序列6的截短HPV16 L1蛋白的表達 用做模板之HPV16 L1基因片段的制備 以從福建省廈門市子宮頸癌病人陰道分泌物中提取的DNA為模板，16H5521F5’-TAT AgT TCC Agg gTC TCC AC-3’(SEQ ID NO12)為正向引物，16H7190R5’-ACA ACA AAC AAC ACT AAT TCA A-3’(SEQID NO13)為反向引物，在PCR儀(Biometra，T3)按照如下條件進行PCR反應 94℃變性5min
72℃延伸10min 擴增得到特異的1.6kb左右大小的產物即為制備編碼本發明中截短HPV-16L蛋白DNA片段的模板。
截短HPV16 L1基因的非融合表達載體的構建 以前一步驟所獲得1.6kb大小的DNA片段用做再次PCR反應的模板。以16N30F5’-ggA TCC CAT ATg CTT CCT AgT gAg gCC ACT gTC-3’為正向引物，其5’端引入限制性內切酶BamHI和NdeI位點，NdeI位點序列為CAT ATG，ATG為大腸桿菌系統中的起始密碼子；16CR5′-CTC gAg TTA CAg CTT ACg TTT TTT gC-3′為反向引物，其5’端引入限制性內切酶XhoI位點。在PCR熱循環儀(Biometra T3)按照如下條件進行PCR反應 94℃變性5min
72℃延伸10min 擴增得到1.5kb左右大小特異的DNA片段。將該PCR產物與商售的pMD18-T載體(TAKARA公司生產)連接，經BamHI/HindIII酶切鑒定，得到插入截短HPV16 L1基因的陽性克隆pMD 18-T-HPV16N30C-L1。
在上海博亞生物工程公司，利用M13(+)/(-)引物，測得pMD18-T-HPV16N30C-L1質粒中插入的目的核苷酸序列為序列8，其編碼的氨基酸序列即為序列6該序列對應的蛋白質為為N端被截短30個氨基酸、C端未被截短的HPV16 L1蛋白，命名為HPV16N30C-L1。
將上述的pMD 18-T-HPV16N30C-L1質粒，經BamHI/XhoI酶切，獲得截短的HPV16N30C-L1基因片段。再將該片段與經NdeI/XhoI酶切的非融合表達載體pT0-T7(羅文新等，生物工程學報，2000，1653-57)相連接，NdeI/XhoI酶切鑒定得到插入L1蛋白基因的陽性表達克隆pT0-T7-HPV16N30C-L1。取1μL的pT0-T7-HPV16N30C-L1質粒(0.15mg/ml)轉化40μL的氯化鈣法制備的感受態大腸桿菌ER2566(購自新英格蘭生物實驗室公司)，涂布于卡那霉素(終濃度25mg/mL，下同)抗性的固體LB培養基，37℃靜置培養10-12小時至單菌落清晰可辨。挑取單個菌落，挑取單菌落至含4mL卡那霉素抗性的液體LB培養基之試管，37℃220轉/分振蕩培養10小時，從中取1mL菌液于-70℃凍干保存。
HPV16N30C-L1的大量表達 從-70℃中取出帶有重組質粒pT0-T7-HPV16-L1的大腸桿菌凍干菌種，用少量無菌水溶解，接入卡那霉素抗性的50mL LB培養基中。200rpm、37℃培養大約8小時，而后將其轉接入10瓶500mL LB培養基中，每瓶接入5mL菌液，200rpm、30℃搖瓶培養過夜，作為種子液。
LB培養基配方 蛋白胨10g 酵母抽提物5g NaCl10g 將以上成分份溶解于1000mL去離子水中，用NaOH調節pH值至7.2，121℃滅菌30min，冷卻至50℃。
采用上海保興生物公司50L發酵罐進行大規模培養。校正發酵罐PH電極，配制30L LB培養基裝入發酵罐，原位121℃滅菌30min，校正溶氧電極，以滅菌后未通氣前為零點，以發酵時通氣后未接種前初始攪拌速度100rpm時為100％。
補料準備配制濃度為30％(20g蛋白胨、10g酵母膏溶至100ml)的蛋白胨和酵母膏混合物，50％葡萄糖(50g溶至100ml)，121℃滅菌20min。
次日將10瓶種子液共5L接入發酵罐中，設定溫度37℃，PH值7.0，手動調節攪拌速度及通氣量，維持溶氧在40％以上。
流加補料將50％葡萄糖和30％蛋白胨和酵母膏混合物按溶質質量比2∶1的比例混合。
流加速度如下 100％為25mL/min 第一小時5％； 第二小時10％； 第三小時20％； 第四小時40％； 第五小時以后60％。
當菌濃度達到OD600nm大約10左右時將培養溫度降至25℃，加入4g IPTG誘導培養4小時。終濃度大約為60左右(OD600nm)下罐，離心收集菌體，獲得表達有HPV16N30C-L1蛋白的菌體重大約3kg。
實施例2純度約70％的HPV16N30C-L1的獲得 按1g菌體對應10mL裂解液(20mM Tris緩沖液pH7.2，300mM NaCl)的比例重懸菌體，采用APV均質機(An Invensys Group產品)以600bar壓力破碎菌體5次。JA-14轉頭13500rpm(30000g)，離心15min，留取上清，通過10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，此時上清中HPV16N30C-L1的純度約為10％。采用CENTRASETTE 5切向流裝置(PALL產品)對上清進行透析，所用膜包截留分子量為30kDa，透析液為10mM磷酸緩沖液pH 6.0緩沖液，透析體積為三倍上清體積，運行時壓力為0.5psi，流速為500mL/min，切向流速為200mL/min。透析充分后，JA-10轉頭(Beckman J25高速離心機)9500rpm(12000g)，20min離心收獲沉淀，用1/10上清體積的10mM磷酸緩沖液pH7.5，10mM DTT，300mM NaCl重懸沉淀，攪拌30min。JA-14轉頭(Beckman J25高速離心機)，13500rpm(30000g)，離心20min，離心得上清，使用0.22μm孔徑濾膜過濾樣品，以該樣品進行下一步的陽離子交換色譜純化。取150μL過濾后樣品，加入6X Loading Buffer 30μL。混勻，于80℃水浴10min后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以120V電壓電泳120min。隨后以考馬斯亮蘭染色顯示電泳條帶，電泳結果見圖1。通過SDS-PAGE分析可知HPV16N30C-L1蛋白在通過沉淀、復溶的步驟之后，目的蛋白得到了純化和富集，純度從之前的約10％左右提高到了約70％左右。
實施例3HPV16N30C-L1的色譜純化 HPV16N30C-L1的陽離子交換色譜純化 儀器系統GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生產的AKTA explorer 100型制備型液相色譜系統。
層析介質SP Sepharose 4 Fast Flow。
柱體積5.5cm×20cm。
緩沖液20mM磷酸緩沖液pH7.5，10mM DTT 20mM磷酸緩沖液pH7.510mM DTT 2M NaCl。
流速25mL/min 檢測器波長280nm。
樣品為實施例2中10mM磷酸緩沖液pH7.5，10mM DTT，300mM NaCl重懸上清。
洗脫程序為400mM NaCl洗脫雜蛋白，500mM NaCl洗脫目的蛋白，收集500mM NaCl洗脫產物，共獲得HPV16-L1純化樣品1000mL。
HPV16N30C-L1的HIC(疏水相互作用色譜)純化 儀器系統GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生產的AKTAexplorer 100型制備型液相色譜系統。
層析介質Butyl Sepharose 4 Fast Flow。
柱體積5.5cm×20cm 緩沖液10mM磷酸緩沖液pH7.5，10mM DTT，2M NaCl。
洗脫液10mM磷酸緩沖液pH7.5，10mM DTT。
流速20mL/min。
檢測器波長280nm。
樣品為SP Sepharose 4 Fast Flow洗脫產物。
洗脫程序為1M NaCl洗脫雜蛋白，800mM與500mmol/L NaCl濃度洗脫目的蛋白。
收集800mM與500mM NaCl濃度時的洗脫產物，獲得純化的HPV16N30C-L1樣品1300mL。取800mM與500mM NaCl濃度時的洗脫產物各150μL，加入6X Loading Buffer 30u L混勻，于80℃水浴10min后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中120V電壓電泳120min。隨后以考馬斯亮蘭染色顯示電泳條帶，電泳結果見圖2。由電泳結果可知，目的蛋白濃度約為0.5mg/ml，SDS-PAGE考染純度大于98％。
實施例4HPV16N30C-L1類病毒顆粒的組裝 儀器系統為PALL生產的CENTRASETTE 5切向流系統；膜包截留分子量為30kDa；樣品為實施例3所得HPV16N30C-L1 1500ml。
樣品的濃縮調節系統切向流速為50mL/min，濃縮樣品至總體積為800mL。
樣品的復性以10L復性緩沖液(50mM PB pH 6.0，2mM CaCl2，2mMMgCl2，0.5M NaCl，0.003％Tween-80)充分交換樣品緩沖液。切向流裝置運行時壓力為0.5psi，切向流速度為10mL/min，待復性緩沖液交換完后，改為儲存緩沖液(20L PBS20mM PB pH 6.5，0.5M NaCl)進行交換，交換體積為20L。運行時壓力為0.5psi，切向流速為25mL/min。待所有液體交換完畢后，使用PALL 0.20μm濾器無菌過濾樣品，得到HPV16N30C-L1類病毒顆粒。
實施例5HPV16N30C-L1 VLP的形態學檢測及其免疫原性測定 HPV16N30C-L1類病毒顆粒透射電鏡觀察 儀器為日本電子公司生產的100kV透射電鏡，放大倍數為100,000倍。HPV16N30C-L1類病毒顆粒經2％磷鎢酸pH7.0負染，固定于噴炭的銅網上進行觀察。結果如圖3，可見實施例4所得樣品大量半徑為25nm左右的類病毒顆粒，大小均勻，呈現為空心形態。
HPV16N30C-L1類病毒顆粒動態光散射觀察 儀器為美國Protein Solutions公司生產的DynaPro MS/X型動態光散射儀(含溫度控制器)，使用算法為Regulation算法。樣品為實施例4所得樣品。樣品經0.22μm濾膜過濾后進行測量。測量結果見圖4。結果顯示HPV16N30C-L1 VLP的水化分子動力學半徑為25.86nm。
HPV16假病毒中和細胞模型的建立 由于HPV難以在體外進行培養，而且HPV宿主特異性強，難以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合適的動物模型。因此，為了能對HPV疫苗的免疫保護性進行快速評估，需要建立有效體外中和實驗模型。
假病毒(pseudovirions)體外感染模型利用了HPV VLP可非特異包裝核酸的特性，通過在細胞內表達HPV的L1和L2蛋白，通過包裹細胞內的游離體病毒DNA或外源導入的報告質粒組成HPV假病毒。(Yeager，M.D，Aste-Amezaga，M.et al(2000)Virology(278)570-7)具體方法有重組病毒表達系統法及多質粒共轉染方法。
本發明采用的多質粒共轉染方法，并且針對HPV系統采取了如下的改進建立了對293FT細胞的優化的磷酸鈣轉染方法，可獲得高達90％以上的轉染效率，有利于進行較大規模的生產。獲得了密碼子優化的HPV結構蛋白的表達質粒，其可在哺乳動物細胞中高效表達HPV L1和L2基因，有利于高效組裝假病毒。
HPV假病毒的構建 用CsCl密度梯度離心方法分別純化帶有HPV16 L1基因的質粒p16L1h、帶有HPV16L2基因的質粒p16L2h、及帶有綠色熒光蛋白基因的質粒pN31-EGFP(以上質粒由NIH的John T.Schiller教授饋贈)。CsCl密度梯度離心純化質粒的方法參照《分子克隆第三版》。簡言之將質粒轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落接種到500mL LB培養基中，37℃搖瓶培養16小時。9000g離心5min，收集菌體。每1000mL菌液收獲的菌體，依次加入40mL溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH＝8.0))和2mL RNase A(1μg/μL)，40mL溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，48mL溶液III(5M乙酸鉀60.0mL，冰乙酸11.5mL，去離子水28.5mL)。在冰上放置10min后，15000g，4℃離心20min，取上清與0.6倍體積的異丙醇混合，15000g離心30min，棄去上清，用70％乙醇洗沉淀1次，用TE溶解沉淀，測定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA對應1.01g CsCl)，再溶入100uL 10mg/mL的溴化乙錠溶液，用Beckman NVT65轉子，62000rpm，20℃離心10hr。用注射器針頭收集閉環DNA區帶，用等體積的異戊醇重復抽提4次。加入3倍體積的水和8倍體積的無水乙醇，20000g，4℃離心30min，收集DNA沉淀。75％酒精洗滌1次，用1mL TE溶解DNA沉淀。測定DNA溶液的濃度，分裝成小份儲存于-20℃。
純化后的p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP用磷酸鈣方法共轉染培育于10cm細胞培養皿中的293FT細胞(Invitrogen)。磷酸鈣轉染方法將p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP各40ug加入1mL的HEPES溶液(每50mL去離子水含有pH＝7.3的1M Hepes 125uL，4℃儲存)和1mL的0.5mol/L CaCl2溶液的混合溶液，混合后逐滴加入2mL 2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，1.5mMNa2HPO4(0.213g)，溶解于1000mL去離子水，pH＝6.96，-70℃儲存)中，室溫下靜置1min后將混合液加入培養有293FT細胞的10cm細胞培養皿中，6hr后棄去原培養液，加入10mL完全培養液(invitrogen公司產品)。轉染48hr后，棄去培養基，用PBS洗2次，將細胞刮下收集細胞，細胞計數，每108個細胞用1mL裂解液(0.25％Brij58，9.5mM MgCl2)重懸。裂解完成后，5000g離心10min，收集上清，加入5M NaCl(終濃度為850mM)，即為假病毒液，分裝為小份后置于-20℃保存。
將293FT細胞(Invitrogen)鋪于96孔細胞培養板中(1.5×104/孔)。5hr后進行中和實驗，將待測的血清樣品分別用10％DMEM進行連續倍比稀釋，然后取50μL分別與50μL稀釋于10％DMEM的上文制備的假病毒液(moi＝0.1)混合。4℃孵育1h后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養板中，37℃培養72h后先用熒光觀察確定各樣品大概的中和滴度，再用流式細胞儀(EPICS XL，美國Beckman Coulter公司)檢測各孔細胞的感染率，計算單抗或多抗血清的準確中和滴度。感染率為細胞樣品在陽性區中的細胞數量百分率減去未感染的對照細胞樣品在陽性區的數量百分率。
感染抑制率＝(1-阻斷孔的感染率/未阻斷孔的感染率)×100％。
抗體中和滴度的定義為達到高于50％感染抑制率的最大稀釋倍數。經50倍稀釋后能達到50％以上感染抑制率的單抗或多抗被視為具有中和能力。
HPV16 VLP疫苗免疫動物的免疫保護性評價 小鼠ED50檢測將實施例4所制備的HPV16N30C-L1類病毒顆粒吸附于氫氧化鋁佐劑上.而后使用疫苗稀釋液將其稀釋至0.100μg/mL，0.033μg/mL，0.011μg/mL，0.004μg/mL，以1∶3比例進行稀釋成4個濃度，每組分別以1mL上述濃度腹腔注射BALB/c小鼠各10只，于注射后第四和五周分別采集血清進行HPV抗體的EIA檢測和假病毒細胞中和實驗法檢測，最后一次采血時處死小鼠。另外設立空白組，含10只BALB/c小鼠。
EIA檢測結果按照其陰性均值(若陰性均值小于0.05，以0.05來計算)+0.16作為CUTOFF值。所有BALB/c小鼠在注射前均為HPV抗體陰性。檢測結果見表1。
表1EIA檢測HPV16N30C-L1類病毒顆粒在BALB/c小鼠中的ED50結果
根據Reed-Muench法進行ED50的計算，疫苗注射后觀察4、5周，采血檢測ED50。HPV16N30C-L1類病毒顆粒4W、5W的ED50分別為0.019μg、0.011μg。因此在該劑量免疫可以產生較高的免疫抗體，其有效性顯著小于0.1μg的免疫劑量。
假病毒細胞中和實驗法檢測結果為陰性對照的細胞發光數不小于20％，且陽性對照不發光，實驗方為有效。按照細胞發光數小于陰性對照細胞發光數的50％為陽性判斷陰陽性。檢測結果見表2。
表2，假病毒細胞中和實驗法檢測HPV16N30C-L1類病毒顆粒在BALB/c小鼠中的ED50結果
根據Reed-Muench法進行ED50的計算，疫苗注射后觀察4、5周，采血檢測ED50。HPV16N30C-L1類病毒顆粒4W、5W的ED50分別為0.019μg、0.011μg。因此在該劑量免疫可以產生較高的免疫抗體，其有效性顯著小于0.1μg的免疫劑量。
兔普通級，雌性，6～8周齡，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養。實施例4所制備的HPV16N30C-L1類病毒顆粒初免與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫則與等量福氏不完全佐劑混合進行制備，免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為100ug/只，此后分別于4，10周各加強一次，加強免疫劑量為50ug/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，保存待檢。
羊普通級，雌性，6～8周齡，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養。實施例4所制備的HPV16N30C-L1類病毒顆粒初免與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫則與等量福氏不完全佐劑混合進行制備，免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為1mg/只，此后分別于4，10，18周各加強一次，加強免疫劑量為0.5mg/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，保存待檢。
以上述假病毒中和細胞模型實驗評估上述抗血清的中和效價，如圖5和6所示。結果表明，本發明實施例4獲得的HPV16N30C-L1類病毒顆粒混合配制成為疫苗，具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的中和抗體，可作為預防HPV感染的疫苗。
HPV16/18二價疫苗免疫恒河猴的免疫保護性評價 恒河猴普通級，雌性，2歲，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養。實施例4所制備的HPV16N30C-L1類病毒顆粒吸附于氫氧化鋁佐劑上，類似方法制備的HPV18N65C-L1類病毒顆粒也吸附于氫氧化鋁佐劑上，再將兩者2∶1(重量比)混合，制成HPV16/18二價疫苗，其中每劑量(0.5ml)含有40μg的HPV16N30C-L1類病毒顆粒和20μg的HPV18N65C-L1類病毒顆粒，含有氫氧化鋁0.6mg。免疫方式為上肢三角肌注射，分5μg、10μg、20μg三個HPV16劑量，每個劑量3只恒河猴，候選動物在免疫前均被確定為HPV16總IgG抗體和中和抗體呈陰性，免疫程序為0,4周。飼養9周，每周采血一次，血樣于37℃放置1.5小時后，10,000rpm離心5分鐘，收集血清進行HPV16和HPV18的總IgG抗體和中和抗體滴度的檢測，兩個型別的抗體檢測方法相類似。
結果如圖7和圖8所示，本發明的HPV16N30C-L1類病毒顆粒可誘導恒河猴在免疫后的第9周產生高達20,000的總IgG抗體和中和抗體滴度，顯示了良好的免疫原性，可作為預防HPV16感染的疫苗。同樣地，如圖9和圖10所示，二價疫苗中的HPV18N65C-L1類病毒顆粒可誘導恒河猴在免疫后的第9周產生高達20,000的抗HPV18總IgG抗體和中和抗體滴度，顯示了良好的免疫原性，亦可作為預防HPV18感染的疫苗。
上述的HPV18N65C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列為(SEQ IDNO9) Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr 20 25 30 His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg 35 40 45 Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala 50 55 60 Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 65 70 75 80 Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val 85 90 95 Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 100 105 110 Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser 115 120 125 Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val 130 135 140 Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro 145 150 155 160 Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro 165 170 175 Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu 180 185 190 Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser 210 215 220 Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His 245 250 255 Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu 260 265 270 Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr 275 280 285 Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe 290 295 300 Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val 305 310 315 320 Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser 325 330 335 Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln 340 345 350 Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr 355 360 365 Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp 370 375 380 Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp 385 390 395 400 Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr 405 410 415 Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro 420 425 430 Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp 435 440 445 Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg 450 455 460 Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro 465 470 475 480 Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys 485 490 495 Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys 500 HPV6/11/16/18四價疫苗免疫小鼠的免疫保護性評價 免疫動物4-5周齡SPF級BALB/c小鼠4只，按本發明實施例4所述類似方法制備HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV18N65C-L1，類病毒顆粒。將上述4種類病毒顆粒HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1按1∶2∶2∶1(重量比)的比例混合，使得混合后的上述四種類病毒顆粒的濃度為40，80，80，40μg/ml。而后再加入等體積的福氏完全佐劑與之混合均勻。加強免疫則與等量福氏不完全佐劑混合進行制備。免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1類病毒顆粒各10μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1類病毒顆粒各20μg/只。此后分別于2周加強一次，加強免疫劑量為HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1類病毒顆粒各20μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1類病毒顆粒各40μg/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，按實施例5所述方法分別檢測免疫小鼠中針對HPV6，HPV11，HPV16，HPV18假病毒顆粒的中和抗體滴度。檢測結果如圖11所示，結果表明，由本發明實施例1-4所述方法獲得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四種類病毒顆粒混合而制備的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18四價疫苗具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的針對HPV6，HPV11，HPV16，HPV18的中和抗體，可作為預防HPV6/HPV11/HPV16/HPV18感染的有效疫苗(除了實施例中所采用的福氏佐劑外，該疫苗也可由本發明所制備的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四種類病毒顆粒與商用或自制的氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑混合而成)。
上述的HPV6N5C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列為(SEQ IDNO10) Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val 1 5 10 15 Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys 35 40 45 Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg 50 55 60 Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp 65 70 75 80 Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr 85 90 95 Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly 100 105 110 His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys 130 135 140 Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His 145 150 155 160 Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met 180 185 190 Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn 195 200 205 Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro 210 215 220 Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe 225 230 235 240 Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala 245 250 255 Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser 260 265 270 Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser 275 280 285 Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp 290 295 300 Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln 305 310 315 320 Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu 325 330 335 Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys 340 345 350 Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln 355 360 365 Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr 370 375 380 Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro 385 390 395 400 Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala 405 410 415 Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr 420 425 430 Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser 435 440 445 Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly 450 455 460 Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val 465 470 475 480 Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg 485 490 495 上述的HPV11N4C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列為(SEQ IDNO11) Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys 15 10 15 Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile 35 40 45 Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr 50 55 60 Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro 65 70 75 80 Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys 85 90 95 Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser 100 105 110 Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly 115 120 125 Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp 130 135 140 Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn 165 170 175 Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly 180 185 190 Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln 195 200 205 Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys 210 215 220 Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu 225 230 235 240 Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn 245 250 255 Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys 260 265 270 Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr 275 280 285 Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro 290 295 300 Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly 305 310 315 320 Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met 325 330 335 Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp 340 345 350 Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile 355 360 365 Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile 370 375 380 His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser 385 390 395 400 Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser 405 410 415 Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp 420 425 430 Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe 435 440 445 Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln 450 455 460 Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro 465 470 475 480 Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr 485 490 495 Lys Lys 上述的HPV18N65C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列顯示如上(SEQ ID NO9)。
上述一系列實驗結果表明，本發明實施例4獲得的HPV16N30C-L1類病毒顆粒(除了實驗中用到的福氏佐劑外，也可以是商用或自制的氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑)混合配制成為疫苗，具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的中和抗體，可作為預防HPV感染的疫苗。
實施例6 依據本發明實施例1-5所采用的技術，制備具有序列1，2，3，4，5，7的截短HPV16 L1蛋白，以上截短蛋白均可組裝為類病毒顆粒。
序列表
<110>廈門大學
<120>截短的人乳頭瘤病毒16型L1蛋白
<130>IDC080053
<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>528
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Phe I1e Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn
1 5 10 15
Val Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala
20 25 30
Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp
35 40 45
Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg
50 55 60
Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn
65 70 75 80
Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe
85 90 95
Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser
100 105 110
Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val
115 120 125
Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro
130 135 140
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln
165 170 175
Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp
180 185 190
Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys
195 200 205
Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val
210 215 220
Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys
225 230 235 240
Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp
245 250 255
Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr
260 265 270
Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly
275 280 285
Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
290 295 300
Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly
305 310 315 320
Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu
325 330 335
Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu
340 345 350
Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys
355 360 365
Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys
370 375 380
Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
385 390 395 400
Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser
405 410 415
Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro
420 425 430
Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala
435 440 445
Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu
450 455 460
Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala
465 470 475 480
Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly
485 490 495
Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro
500 505 510
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520 525
<210>2
<211>526
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr
1 5 10 15
His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val
20 25 30
Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr
35 40 45
Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu
50 55 60
Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys
65 70 75 80
Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile
85 90 95
His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr
100 105 110
Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val
115 120 125
Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu
130 135 140
Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala
145 150 155 160
Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln
165 170 175
Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys
180 185 190
Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro
195 200 205
Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr
210 215 220
Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu
225 230 235 240
Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile
245 250 255
Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg
260 265 270
Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val
275 280 285
Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr
290 295 300
Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met
305 310 315 320
Val Thr Ser Asp Ala Gln 1le Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg
325 330 335
Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val
340 345 350
Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala
355 360 365
Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr
370 375 380
Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys
385 390 395 400
Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn
405 410 415
Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly
420 425 430
Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala
435 440 445
Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys
450 455 460
Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu
465 470 475 480
Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu
485 490 495
Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr
500 505 510
Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520 525
<210>3
<211>524
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Met Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr His Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu
20 25 30
Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala
35 40 45
Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val
50 55 60
Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu
65 70 75 80
Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu
85 90 95
Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro
100 105 110
Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg
115 120 125
Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys
130 135 140
Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys
165 170 175
Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser
180 185 190
Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu
195 200 205
Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe
210 215 220
Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro
225 230 235 240
Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met
245 250 255
Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu
260 265 270
Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp
275 280 285
Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn
290 295 300
Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr
305 310 315 320
Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln
325 330 335
Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val
340 345 350
Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser
355 360 365
Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg
370 375 380
His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile
385 390 395 400
Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr
405 410 415
Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr
420 425 430
Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln
435 440 445
Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr
450 455 460
Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln
465 470 475 480
Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys
485 490 495
Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520
<210>4
<211>522
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Met Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Asp Val Asn Val Tyr His Ile Phe Phe
1 5 10 15
Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro
20 25 30
Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr
35 40 45
Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His
50 55 60
Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro
65 70 75 80
Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp
85 90 95
Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr
100 105 110
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln
115 120 125
Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp
130 135 140
Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn
145 150 155 160
Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile
165 170 175
Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys
180 185 190
Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile
195 200 205
Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala
210 215 220
Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp
225 230 235 240
Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser
245 250 255
Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met
260 265 270
Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val
275 280 285
Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala
290 295 300
Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp
305 310 315 320
Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His
325 330 335
Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp
340 345 350
Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser
355 360 365
Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu
385 390 395 400
Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu
405 410 415
Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu
420 425 430
Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His
435 440 445
Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp
450 455 460
Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro
465 470 475 480
Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys
485 490 495
Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser
500 505 510
Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
515 520
<210>5
<211>512
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Met Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala
1 5 10 15
Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp
20 25 30
Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg
35 40 45
Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn
50 55 60
Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe
65 70 75 80
Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val
100 105 110
Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro
115 120 125
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala
130 135 140
Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln
145 150 155 160
Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp
165 170 175
Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys
180 185 190
Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val
195 200 205
Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys
210 215 220
Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr
245 250 255
Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly
260 265 270
Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
275 280 285
Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly
290 295 300
Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu
305 310 315 320
Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu
325 330 335
Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys
340 345 350
Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys
355 360 365
Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
370 375 380
Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser
385 390 395 400
Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro
405 410 415
Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala
420 425 430
Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu
435 440 445
Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala
450 455 460
Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly
465 470 475 480
Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro
485 490 495
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500 505 510
<210>6
<211>502
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser
1 5 10 15
Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr
20 25 30
His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro
35 40 45
Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly
50 55 60
Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe
65 70 75 80
Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val
85 90 95
Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val
100 105 110
Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn
115 120 125
Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile
130 135 140
Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro
145 150 155 160
Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His
245 250 255
Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu
260 265 270
Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr
275 280 285
Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe
290 295 300
Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile
305 310 315 320
Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
325 330 335
Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr
340 345 350
Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp
355 360 365
Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile
370 375 380
Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn
385 390 395 400
Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg
405 410 415
Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala
420 425 430
Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu
435 440 445
Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys
450 455 460
Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly
465 470 475 480
Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys
485 490 495
Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500
<210>7
<211>492
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Met Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro
195 200 205
Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met
210 215 220
Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu
225 230 235 240
Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu
245 250 255
Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn
260 265 270
Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr
275 280 285
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290 295 300
Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val
305 310 315 320
Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser
325 330 335
Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg
340 345 350
His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile
355 360 365
Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr
370 375 380
Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr
385 390 395 400
Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln
405 410 415
Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr
420 425 430
Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln
435 440 445
Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys
450 455 460
Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser
465 470 475 480
Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
485 490
<210>8
<211>1512
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
catatgcttc ctagtgaggc cactgtctac ttgcctcctg tcccagtatc taaggttgta60
agcacggatg aatatgttgc acgcacaaac atatattatc atgcaggaac atccagacta 120
cttgcagttg gacatcccta ttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt 180
cctaaagtat caggattaca atacagggta tttagaatac atttacctga ccccaataag 240
tttggttttc ctgacacctc attttataat ccagatacac agcggctggt ttgggcctgt 300
gtaggtgttg aggtaggtcg tggtcagcca ttaggtgtgg gcattagtgg ccatccttta 360
ttaaataaat tggatgacac agaaaatgct agtgcttatg cagcaaatgc aggtgtggat 420
aatagagaat gtatatctat ggattacaaa caaacacaat tgtgtttaat tggttgcaaa 480
ccacctatag gggaacactg gggcaaagga tccccatgta ccaatgttgc agtaaatcca 540
ggtgattgtc caccattaga gttaataaac acagttattc aggatggtga tatggttgat 600
actggctttg gtgctatgga ctttactaca ttacaggcta acaaaagtga agttccactg 660
gatatttgta catctatttg caaatatcca gattatatta aaatggtgtc agaaccatat 720
ggcgacagct tattttttta tctacgaagg gaacaaatgt ttgttagaca tttatttaat 780
agggctggtg ctgttggtga taatgtacca gacgatttat acattaaagg ctctgggtct 840
actgcaaatt tagccagttc aaattatttt cctacaccta gtggttctat ggttacctct 900
gatgcccaaa tattcaataa accttactgg ttacaacgag cacagggcca caataatggc 960
atttgttggg gtaaccaact atttgttact gttgttgata ctacacgcag tacaaatatg 1020
tcattatgtg ctgccatatc tacttcagaa actacatata aaaatactaa ctttaaggag 1080
tacctacgac atggggagga atatgattta cagtttattt ttcaactgtg caaaataacc 1140
ttaactgcag acattatgac atacatacat tctatgaatt ccactatttt ggaggactgg 1200
aattttggtc tacaacctcc cccaggaggc acactagaag atacttatag gtttgtaaca 1260
tcccaggcaa ttgcttgtca aaaacataca cctccagcac ctaaagaaga tccccttaaa 1320
aaatacactt tttgggaagt aaatttaaag gaaaagtttt ctgcagacct agatcagttt 1380
cctttaggac gcaaattttt actacaagca ggattggagg ccaaaccaaa atttacatta 1440
ggaaaacgaa aagctacacc caccacctca tctacctcta caactgctaa acgcaaaaaa 1500
cgtaagctgt aa 1512
<210>9
<211>504
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr
20 25 30
His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg
35 40 45
Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala
50 55 60
Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe
65 70 75 80
Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val
85 90 95
Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val
100 105 110
Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser
115 120 125
Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val
130 135 140
Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu
180 185 190
Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser
195 200 205
Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser
210 215 220
Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His
245 250 255
Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu
260 265 270
Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr
275 280 285
Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe
290 295 300
Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val
305 310 315 320
Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
325 330 335
Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln
340 345 350
Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr
355 360 365
Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp
370 375 380
Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp
385 390 395 400
Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr
405 410 415
Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro
420 425 430
Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp
435 440 445
Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg
450 455 460
Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro
465 470 475 480
Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys
485 490 495
Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys
500
<210>10
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val
1 5 10 15
Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala
20 25 30
Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys
35 40 45
Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg
50 55 60
Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp
65 70 75 80
Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr
85 90 95
Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly
100 105 110
His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys
130 135 140
Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His
145 150 155 160
Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp
165 170 175
Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met
180 185 190
Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn
195 200 205
Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro
210 215 220
Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe
225 230 235 240
Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala
245 250 255
Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser
260 265 270
Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser
275 280 285
Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp
290 295 300
Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln
305 310 315 320
Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu
325 330 335
Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys
340 345 350
Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln
355 360 365
Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr
370 375 380
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385 390 395 400
Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala
405 410 415
Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr
420 425 430
Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser
435 440 445
Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly
450 455 460
Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val
465 470 475 480
Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg
485 490 495
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<211>498
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
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20 25 30
Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile
35 40 45
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50 55 60
Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser
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115 120 125
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Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly
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Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn
165 170 175
Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly
180 185 190
Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln
195 200 205
Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys
210 215 220
Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu
225 230 235 240
Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn
245 250 255
Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys
260 265 270
Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr
275 280 285
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Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly
305 310 315 320
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325 330 335
Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp
340 345 350
Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile
355 360 365
Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile
370 375 380
His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser
385 390 395 400
Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser
405 410 415
Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp
420 425 430
Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe
435 440 445
Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln
450 455 460
Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro
465 470 475 480
Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr
485 490 495
Lys Lys
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tatagttcca gggtctccac 20
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
acaacaaaca acactaattc aa 2權利要求
1.N端截短了4、6、8、10、20、30、或40個氨基酸的HPV16L1蛋白。
2.權利要求1的蛋白，其具有序列1、2、3、4、5、6、或7，優選序列6。
3.編碼權利要求1-2任一項的蛋白的多核苷酸。
4.包含權利要求3的多核苷酸的載體。
5.包含權利要求4的載體的細胞。
6.包含權利要求1或2的蛋白的組合物。
7.一種HPV16類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒含有權利要求1或2的蛋白或者由權利要求1或2的蛋白形成。
8.一種制備HPV L1蛋白例如權利要求1或2的蛋白的方法，其包括
a)在大腸桿菌表達系統中表達編碼HPV L1的HPV L1基因，
b)將表達了HPV L1蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600mM中破碎，分離得到上清液，
c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，
d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50％的HPV L1蛋白。
9.一種用于預防宮頸癌的疫苗，其包括(1)權利要求7的HPV16類病毒顆粒，(2)可有可無的至少一種(例如2、3、4種)選自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58型別的HPV類病毒顆粒(例如HPV L1類病毒顆粒)，及(3)疫苗用賦形劑或載體；
優選地，所述疫苗含有HPV16類病毒顆粒和HPV18類病毒顆粒，特別是，含有具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白質的HPV16類病毒顆粒和含有具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白質的HPV18類病毒顆粒，更優選還含有HPV6類病毒顆粒和HPV11類病毒顆粒，特別是含有具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白質的HPV6類病毒顆粒和含有具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質的HPV11類病毒顆粒。
10.權利要求1-2任一項的蛋白或權利要求7的類病毒顆粒在制備用于預防宮頸癌的疫苗中的用途。
11.一種預防宮頸癌的方法，其包括將含預防有效量的權利要求1-2任一項的HPV16 L1蛋白或權利要求7的類病毒顆粒的疫苗或預防有效量的權利要求9的疫苗給予需要預防宮頸癌的人。
12.獲得HPV16 L1蛋白類病毒顆粒的方法，其包括
e)將純度至少50％的權利要求1或2的HPV16 L1蛋白進一步通過色譜層析純化，
f)將e)步驟中得到的HPV16 L1蛋白去除還原劑。
13.制備用于預防宮頸癌疫苗的方法，其包括將權利要求7的類病毒顆粒與任選的一種或多種選自HPV6，11，18，31，33，45，52，和58的HPV型別的類病毒顆粒及疫苗用載體或者賦形劑混和。
全文摘要
本發明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒16型L1蛋白，及由其組成的類病毒顆粒，含該類病毒顆粒的疫苗及其在預防宮頸癌中的用途。
文檔編號C12N5/10GK101293918SQ20081009381
公開日2008年10月29日 申請日期2008年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者穎 顧, 李少偉, 魏閔希, 鮮陽凌, 羅文新, 夏寧邵 申請人:北京萬泰生物藥業股份有限公司, 廈門大學