專利名稱：豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoC的PCR檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬源大腸桿菌中抗銅基因/^oC的PCR檢測方法，屬檢測技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來抗菌劑(包括抗生素，硫酸銅)被作為生長促進(jìn)劑添加到飼料中， 在增加動物養(yǎng)殖效益的同時導(dǎo)致高頻率的抗生素抗性細(xì)菌的出現(xiàn)，這些抗性細(xì)菌 攜帶的抗性基因可以被轉(zhuǎn)移到在人類致病菌，這是對人類健康的潛在威脅。 Aarestrup等推測禁止使用抗生素作為生長促進(jìn)劑添加到豬飼料中后，在養(yǎng)豬場抗 生素抗性細(xì)菌仍然保持高發(fā)生率的原因可能是由于銅仍然被添加到豬飼料中作 為生長促進(jìn)劑，它們選擇抗生素抗性細(xì)菌并維持了它們的發(fā)生率(Aarestrup, F. M., H. Hasman, L. B. Jensen, e, /. 2002. Antimicrobial resistance among enterococci from pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)。 國 外已經(jīng)報道從養(yǎng)豬場分離到抗銅的腸球菌(￡WeraCOm^/aec/,)帶有抗銅基因 ^rB(Aarestrup, F. M, H. Hasm'an, L. B. Jensen, " a/. 2002. Antimicrobial resistance among enterococci from pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)，和抗銅的大腸桿菌(￡. co//)帶有抗銅基因po)ABCDRSE (Silver, S., Lee, B. T. O.， Brown, N. L. W a/ (1993). Bacterial plasmid resistance to copper, cadmium and zinc. In C7^w/欣少o/Copper Z/wc 7Hfl我pp. 38-53. Edited by A. J. Welch. London: The Royal Socirty of Chemistry.),這些抗銅基因都位于接合質(zhì)粒 上。Hasman &Aarestrup進(jìn)一步對分離到的抗銅腸球菌(￡./flec/wm)進(jìn)行研究 發(fā)現(xiàn)抗銅基因ZcrB、抗糖肽類抗生素的基因簇vawA和抗大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的基 因w附B位于同一個接合質(zhì)粒上(Hasman, H., and F. M. Aarestrup. 2002. /crB, a gene conferring transferable copper resistance in ^y^ez-ococcwsy^ec/ww: occurrence, transferability, and linkage to macrolide and glycopeptide resistance. AntimicrobialAgents and Chemotherapy 46:1410-1416.)。
目前我國的豬飼養(yǎng)業(yè)仍然在飼料中添加抗生素和銅鹽、鋅鹽作為生長促進(jìn) 劑，這必然對豬肉產(chǎn)品安全造成威脅。快速檢測豬源大腸桿菌中是否存在抗性基 因?qū)υu價豬肉產(chǎn)品安全具有重要意義。而常規(guī)PCR檢測程序需要從細(xì)胞中提取DNA 樣品，耗時長，試劑消耗多，造成檢測樣品周期長成本高。本發(fā)明采用豬源大腸 桿菌單菌落直接做DNA模板，實現(xiàn)了用PCR方法快速、經(jīng)濟(jì)地檢測大腸桿菌中的 抗銅基因pcoC。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測方法之不足，而提供一種豬源大腸桿菌中抗
銅基因;x^C的PCR檢測方法。
本發(fā)明的檢測方法包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制 備；抗銅基因/ coC的引物序列；PCR反應(yīng)液組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件；PCR擴(kuò)增
產(chǎn)物的檢測方法。
其中，用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備方法將分離到的
待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，37 。C培養(yǎng) 18-36 h，得到單菌落。
抗銅基因; C0C的引物序歹lJ為上游5'ATGTCGATTTTAAATAAAGCCATTCTT3';下 游5TCATAATCAGGTCGTTCATAATATTACTTC3'; PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為400 bp。
PCR反應(yīng)液組成(1)10xPCR buffer, (2)10 pM上游引物序，10 ^M下游引物 序，(3)10 nM dNTP， (4)用一個無菌的0.5-10 pL移液槍頭挑取一個單菌落(作為 DNA模板)放入PCR反應(yīng)液中混勻，(5M.5-3.OU Taq酶，(6)反應(yīng)體系20-50 ^L。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5-10min; 94。C變性l min、 52°C退火lmin、 72°C延伸2min、共進(jìn)行30-35個循環(huán)；72。C延伸10min，于4。C下保存。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法將擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8-2.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測 及UVI凝膠成像分析結(jié)果。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有較好的特異性，能在5h內(nèi)完成對豬源大腸桿 菌樣品是否帶有抗銅基因pcoC的檢測，檢測方法快速、簡便、且經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明為評價豬肉食品安全提供了一個技術(shù)手段，有良好的運(yùn)用前景。


圖l為本發(fā)明方法檢測實驗室保存的標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株中抗銅基因pcoC的電泳 圖，其中-
M:分子量標(biāo)準(zhǔn)
h標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株DHl(pRJ100) 2:標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株HWS2(pRJ100) 3:標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株AN194N(pRJ100) 4:標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株W3110(pRJ100) 5:標(biāo)準(zhǔn)銅敏感菌株DH1 6:標(biāo)準(zhǔn)銅敏感菌株HWS2 7:標(biāo)準(zhǔn)銅敏感菌株AN194N 8:標(biāo)準(zhǔn)銅敏感菌株W3110 6:標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株LR100
圖2為本發(fā)明方法檢測分離到的健康豬源大腸桿菌菌株中抗銅基因;7CoC的 電泳圖，其中
M:分子量標(biāo)準(zhǔn)
1:陽性對照株LRIOO 2:陰性對照株DH1 3:抗銅菌株W2a6 4:抗銅菌株G6a74 5:抗銅菌株Fd35 6:抗銅菌株G5d8具體實施例方式
實施例一實驗室保存的標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株中抗銅基因; coC的檢測
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，對實驗室保存的5株標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株和4株標(biāo)準(zhǔn)銅敏感 菌株進(jìn)行檢測。1. 菌落培養(yǎng)物的制備
將實驗室保存的5株標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株和4株標(biāo)準(zhǔn)銅敏感菌株分別劃線接種在牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，37 C培養(yǎng)24 h，得到單菌落。
2. PCR擴(kuò)增反應(yīng)
反應(yīng)體系10xPCR buffer, 10nM上游引物序，10pM下游引物序，10|aM dNTP，用一個無菌的0.5-10 nL移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入 PCR反應(yīng)液中混勻，1.5UTaq酶，反應(yīng)體系20iaL;
b.擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5 min; 94。C變性l min、 52°C退火lmin、 72°C 延伸2min、共進(jìn)行30個循環(huán)；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 產(chǎn)物檢測
將擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVl凝膠成像分析結(jié)果，結(jié) 果見表l和圖l， 5株標(biāo)準(zhǔn)抗銅菌株分別檢測出400bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而4株標(biāo)準(zhǔn)銅 敏感菌株未檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物。
表l
標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株
銅抗性
抗銅基因/x;oC
L詣O
DH1 (pRJ100)
HWS2 (pRJ腦)
A贈4N (pRJ,
W3110(pRJ100)
DH1
HWS2
AN194NW3110
+ + +
+ + + + +
注標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株保存在云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室c
實施實例二健康豬源大腸桿菌菌株中抗銅基因;x^C的檢測 根據(jù)本發(fā)明的的檢測方法，對從健康豬糞便中分離到的4株抗銅的大腸桿菌 菌株進(jìn)行檢測。
1.菌落培養(yǎng)物的制備
將從健康豬糞便中用常規(guī)方法分離到的4株抗銅的大腸桿菌菌株與實驗室保 存的陽性/陰性株菌株分別劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，37 C培養(yǎng)18 h，得到單菌落。2. PCR擴(kuò)增反應(yīng)
反應(yīng)體系10xPCR buffer, 10(iM上游引物序，10 ^M下游引物序，10 pM dNTP，用一個無菌的0.5-10 iaL移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入 PCR反應(yīng)液中混勻，2.0UTaq酶，反應(yīng)體系35pL;
b.擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性8min; 94。C變性l min、 52°C退火lmin、 72°C 延伸2min、共進(jìn)行33個循環(huán)；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 產(chǎn)物檢測
將擴(kuò)增產(chǎn)物于l.O g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像分析結(jié)果，結(jié) 果見表2和圖2， 4株抗銅的大腸桿菌菌株和陽性對照菌株分別檢測出400bp的擴(kuò) 增產(chǎn)物，而陰性菌株未檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物。
表2
大腸桿菌菌株 銅抗性 抗銅基因/7C0C
LR100 + + DH1 - -W2a6 + + G6a74 + + Fd35 + + G5d83__^_+
注W2a6、 G6a74、 Fd35和G5d83分離自健康豬秀便中，保存在云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生 物實驗室。
實施實例三病豬源大腸桿菌菌株中抗銅基因pcoC的檢測 根據(jù)本發(fā)明的的檢測方法，對從赤痢豬糞便中用常規(guī)方法分離到的7株抗銅的 大腸桿菌菌株進(jìn)行檢測。
1. 菌落培養(yǎng)物的制備
將從赤痢豬糞便中分離到的7株抗銅的大腸桿菌菌株與實驗室保存的陽性/ 陰性株菌株分別劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，37C培養(yǎng)36h，得到單 菌落。
2. PCR擴(kuò)增反應(yīng)
反應(yīng)體系10xPCR buffer, 10nM上游引物序，10pM下游引物序，10 dNTP，用一個無菌的0.5-10 ^L移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入 PCR反應(yīng)液中混勻，3.0UTaq酶，反應(yīng)體系50 |iiL;b.擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性10 min; 94。C變性l min、 52°C退火lmin、 72°C延伸2min、共進(jìn)行35個循環(huán)；72。C延伸10min，于4。C下保存。 3.產(chǎn)物檢測
將擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVl凝膠成像分析結(jié)果，結(jié) 果見表3， 7株抗銅的大腸桿菌菌株和陽性對照菌株分別檢測出400 bp的擴(kuò)增產(chǎn)
物，而陰性菌株未檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物。 表3
大腸桿菌菌株銅抗性O(shè)-type/serotype抗銅基因/7C0C
LR腦++
DH1——
1347/02-3+045+
0021/03-3+0139+
227/03-1+OM9:K88， K99+
193/03-1+0149+
1339/03+0141:K85ab+
334/04-7+0157: K82+
516/04-2+08: K87， K88+
注1347/02-3、 0021/03-3、 227/03-1、 193/03-1、 1339/03、 334/04-7和516/04-2分離自赤痢
豬糞便中，保存在云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室。
權(quán)利要求
1、一種用PCR檢測豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoC的方法，其特征在于包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備；抗銅基因pcoC的引物序列；PCR反應(yīng)液組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法。
2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備為將分離到的待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，在37 。C溫度下培養(yǎng)18-36 h后得到單菌落。
3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的抗銅基因pcoC的引物序列為上游5，ATGTCGATTTTAAATAAAGCCATTCTT3，； 下游5，TCATAATCAGGTCGTTCATAATATTACTTC 3'
4、 如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)液組成 為10x PCR buffer,10 ,上游引物序，10幽下游引物序，10 PM dNTP， 用一個無菌的0. 5-10叱移液槍頭挑取一個單菌落作為DNA模板放入PCR反應(yīng)液 中混勻，1.5-3.0 U Taq酶，反應(yīng)體系20-50叱。
5、 如權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增反 應(yīng)條件包括94°C預(yù)變性5-10 min; 94。C變性l min、 52°C退火lmin、 72°C 延伸2 min、共進(jìn)行30-35個循環(huán)；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于將擴(kuò)增產(chǎn)物于0. 8-2. 0 g/L的瓊 脂糖凝膠電泳檢測及UV I凝膠成像分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoC的PCR檢測方法，屬檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備；抗銅基因pcoC的引物序列；PCR反應(yīng)液組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件；及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法。本發(fā)明不需要提取DNA，直接用豬源大腸桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測抗銅基因pcoC。本發(fā)明具有較好的特異性、可快速、經(jīng)濟(jì)地檢測豬源大腸桿菌中的抗銅基因pcoC。本發(fā)明為評價豬肉食品安全提供了一個技術(shù)手段，有良好的運(yùn)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101457255SQ20081023378
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者春 侯, 放 孫, 張智輝, 竇秋燕, 貢嬌娜 申請人:云南大學(xué)