專利名稱：一種大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統及其構建方法。
背景技術：
隨著石油資源的緊缺以及環境的日益惡化，對環保且可再生能源的需求變得越來越迫切，而生物能源便能很好地解決此問題。目前，可利用的商業化生物燃料包括來自于玉米和蔗糖的短鏈的醇類以及來自于油菜和動物油脂的脂肪酸甲酯衍生物，但這些卻存在著生物燃料原料與人類本身需求相矛盾的問題。為了克服這些限制，最好的方法便是利用發酵法生產生物燃料，主要包括短鏈的醇類、類異戊二烯合成途徑中的碳氫化合物以及微生物脂肪酸衍生物。目前為止，能生產生物柴油的微生物主要包括細菌、真菌、酵母、微藻，但由于天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂產量有限，且天然脂肪酸多為胞內分泌，必須從組織、細胞中分離后，才能應用于生物柴油生產，這一過程關系到生物柴油的質量、成本以及·對環境的污染。而與天然菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚，易于工程調控，可高密度發酵，生長速度快等諸多優點，已經成為微生物催化合成化學品和燃料的理想受體菌，近年來通過對大腸桿菌的改造生產生物柴油已取得一定的成果。因此本文以大腸桿菌為出發菌株，利用基因工程手段來提高其胞外脂肪酸的產量。大腸桿菌脂肪酸生物合成與調控機制已得到廣泛的研究。人們對大腸桿菌的脂肪酸合成途徑已有了深入的研究，往往把大腸桿菌的脂肪酸合成途徑當做類型II脂肪酸合成酶系的模型。大腸桿菌飽和脂肪酸的合成可分為三步進行。第一步是原料合成，由丙二酸單酰CoA = ACP轉酰基酶(FabD)催化，將丙二酸單酰CoA轉變成丙二酸單酰ACP。第二步為起始反應，由酮脂酰ACP合成酶III (FabH)將丙二酸單酰ACP與乙酰CoA縮合成乙酰乙酰ACP。第三步為循環反應，有多種酶催化，依次進行。每一次循環脂酰碳鏈增加兩個CH2基團，直到形成棕櫚脂酰ACP。循環反應首先由NADPH依賴的β-酮脂酰ACP還原酶(FabG)催化β-酮脂酰ACP還原，生成β-羥脂酰ACP。接著產物脫水，生成反-2-烯酰ACP。這一反應β -羥脂酰ACP脫水酶(FabZ或FabA)催化。循環反應的最后一步是反_2_烯酰ACP還原，由NADPH依賴烯酰ACP還原酶(FabI)催化，生成脂酰ACP。接著開始下一循環，丙二酸單酰ACP和脂酰ACP在β -酮脂酰ACP合成酶I或II (FabB或FabF)縮合成β -酮脂酰ACP，然后依次被還原(FabG)Jj^jC (FabZ或FabA)和再還原(FabI)。大腸桿菌不飽和脂肪酸的合成是按以下方式進行當脂酰鏈延伸至10個碳時，即形成β_羥基癸脂酰ACP時，該產物經FabA或FabZ脫水，生成反_2_癸烯酰ACP，由于FabA還具有異構酶活性，2-反式-癸烯酰ACP同時被異構化，產生順-3-癸烯酰ACP，該產物不能被FabI還原，只能作為FabB的底物，與丙二酸單酰ACP縮合成順-5- β -酮基十二碳烯酰ACP，然后，該產物進入脂肪酸合成的循環反應，最終產生棕櫚油酰ACP。在大腸肝菌脂肪酸合成途徑中，硫酯酶基因(TesA)可催化水解脂?；鵄CP生成游離脂肪酸和ACP，解除由脂酰ACP導致的脂肪酸生物合成調節機制中的反饋抑制作用，釋放游離脂肪酸。有關文獻報道在大腸桿菌內過表達內源或植物硫酯酶基因，可產生游離脂肪酸。大腸桿菌中脂肪酸合成途徑如下所示。
權利要求
1.一種大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統，包括大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌攜帶有質粒系統，所述質粒系統包括大腸桿菌脂肪酸代謝途徑的融合蛋白。
2.如權利要求I所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統，其特征在于，所述融合蛋白中包括若干大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白，通過膜蛋白將該些蛋白錨定在膜上并通過異源二聚體將大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白按照代謝順序串聯在一起。
3.如權利要求2所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統，其特征在于，所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白選自酶FabI、FabG, FabZ, TesA中的一種或幾種，膜蛋白為膜蛋白Lgt,異源二聚體選自二聚體蛋白 GBD Domain、GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand 的一種或幾種。
4.一種權利要求I或2或3所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法，其特征在于，通過膜蛋白將大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白錨定在膜上并通過異源二聚體將所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白按照代謝順序串聯在一起，之后將其構建在質粒中形成質粒系統，將所述質粒系統在大腸桿菌中共表達使其定位并聚集于大腸桿菌細胞膜上，即得到大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統。
5.如權利要求4所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法，其特征在于，構建多個質粒系統，將該些質粒系統在大腸桿菌中共表達。
6.如權利要求4所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法，其特征在于，所述方法還包括，首先，分別制備大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白、膜蛋白和異源二聚體片段。
7.如權利要求6所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法，其特征在于，所述大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白選自酶FabI、FabG, FabZ, TesA中的一種或幾種，膜蛋白為膜蛋白Lgt,異源二聚體選自二聚體蛋白GBD Domain> GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand的一種或幾種。
8.如權利要求7所述的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法，其特征在于，所述片段的制備方法為以大腸桿菌基因組或大鼠cDNA或小鼠cDNA為模板，用引物進行PCR擴增或PCR擴增后再進行重疊PCR。
9.一種權利要求I或2的系統用于大腸桿菌生產脂肪酸的用途。
10.一種使用權利要求I或2的系統生產脂肪酸的方法，其特征在于，將攜帶有質粒系統的大腸桿菌于一 LB培養基中培養,得到種子液，之后將該種子液接種到另一 LB培養基中培養，然后加入誘導劑進行誘導表達。
全文摘要
本發明公開了一種大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統及其構建方法和應用。本發明提供的大腸桿菌高效生產脂肪酸的系統的構建方法是，構建大腸桿菌脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白FabI、FabG、FabZ、TesA與膜蛋白Lgt、二聚體蛋白GBD Domain、GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand的融合蛋白，將該系列蛋白在大腸桿菌中共表達使其定位并聚集于細胞膜上，利用該系統進行發酵培養可使大腸桿菌菌體以及培養基中的棕櫚酸(C-16)產量及總脂肪酸產量相較于野生型大腸桿菌有顯著提高。
文檔編號C12R1/19GK102899281SQ201210376058
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者馬鋼, 賀林, 王右, 吳宇奇, 郭華慶, 尹若楠, 索洋, 奚瑞, 于一能, 吳佳杰, 華楠, 張悅涵, 靳振明, 張少博 申請人:上海交通大學