專利名稱：廣親和基因Sⁿ₅的功能標記開發的制作方法
技術領域：
本發明提供了廣親和基因&"的分子標記鑒定方法，屬于分子遺傳學領域，專用于
廣親和基因s/的基因型鑒定。
背景技術：
栽培稻(Oy加w "vfl[ L.)分為秈稻(Oyza sariva L. indica sub)和粳稻(Oyza ^"va( L. japonicasub)兩個亞種，亞種間雜種具有很強的優勢。但秈粳亞種間雜種存在育性障礙， 結實率很低，限制了雜種優勢的利用。在水稻中存在一類特殊的種質資源稱為廣親和 品種，如江蘇農業科學院選育的02428，與多數的秈稻和粳稻雜交的后代都表現正常可 育，其廣親和基因已經成功克隆。正常的S5基因編碼一個天冬氨酰蛋白酶，通過控制 雌配子的育性而影響結實率。秈粳稻的S5等位基因間僅兩個堿基的差別，引起相應蛋 白質兩個氨基酸的替換，可能是造成其雜種不育的原因。廣親和品種的&"基因則因其 大片段缺失，導致功能喪失，無論與秈稻還是粳稻雜交都不影響雜種育性。
栽培稻的秈粳不育和廣親和性的并存在生物進化中是一種很奇特的現象秈粳分 化造就了豐富多樣的稻種資源，也導致生殖隔離，而廣親和基因的存在則給秈粳亞種 間基因交流提供橋梁。利用廣親和基因的有關信息，可直接用于發掘其他廣親和基因， 等位基因差異可作為分子標記應用于廣親和品種的培育。有效地應用廣親和基因能夠 克服水稻秈粳亞種間雜種的不育性，從而利用秈粳亞種間強大的雜種優勢，提髙水稻 的產量。

發明內容
本發明的目的是開發廣親和基因的功能標記，利用本研究開發的基于PCR 的實用經濟型標記，可以有效地對廣親和基因&"進行基因型選擇，既可以用于水稻資 源的篩選鑒定，又可以用于廣親和基因S/的分子育種。
本發明所提供的可廣親和基因&"進行基因型選擇的InDel標記S5136，是通過以 下方法獲得的
1) 利用廣親和粳稻品種02428與秈稻3037構建F2分離群體。
2) 廣親和基因&"已經克隆((PNAS，2008， 105(32): 11436-11431 ))。 S5基因編碼一個天冬氨酰蛋白酶，通過控制雌配子的育性而影響結實率。秈粳稻的S5等位基因間 僅兩個堿基的差別，引起相應蛋白質兩個氨基酸的替換，造成其雜種的不育。廣親和 品種的&"基因(廣親和基因)在5'端缺失136bp,導致基因功能喪失，無論與秈稻 還是粳稻雜交都不影響雜種育性。我們根據這136bp缺失設計了 InDel標記， InDel標記S5136引物序列如下 上游引物5' ATCAACCCATTTCCTTTCCT 3' 下游引物5' ATACGCTCGATCGGATTAAC 3' 對廣親和材料擴增出441bp,對普通秈稻和粳稻擴增出577bp。 3 )利用SDS方法提取02428與3037的F2群體各單株的DNA,利用InDel標記 S5136引物進行PCR,擴增產物在1%的瓊脂糖電泳分析，我們發現該標記與等位基因 共分離。即該標記是共顯性標記，能對廣親和基因和非廣親和基因的純合基因型和雜 合基因型進行準確鑒定，標記基因型符合l: 2: l的比例(圖l)。
4)利用該標記對太湖流域粳稻資源和東南亞一帶的品種資源進行了廣親和基因資 源篩選，發現了 17份帶有廣親和基因的材料。
本研究所提供的分子標記方法，具有如下優點 通過本發明獲得了廣親和基因"進行基因型鑒別的共顯性分子標記。 本發明的分子標記可以從直觀地從品種資源材料中篩選廣親和基因可用于廣 親和基因的分子標記選擇育種，由于可以進行基因型選擇，可以省去繁雜的親和性鑒 定過程，極大地縮短育種進程，提高育種效率。


圖1引物S5136對"3037/02428"F2群體PCR擴增產物在1%的瓊脂糖膠電泳結果； (Pl為02428， P2為3037, F!為雜種，1-19為F2群體的部分單株)
圖2引物S5136對部份材料PCR擴增產物在1%的瓊脂糖膠電泳結果，具有廣親 和基因&"的Dular、水源341帶型一致，而其余材料帶型一致；(M為DNA ladder; a 為100bp; b為250bp; c為500bp; d為750bp; e為lkb;f為2kb; l-23:部分品種資源材 料)下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例l、 一種鑒別廣親和基因&"基因型分子標記的獲得 1供試材料
江蘇農學院選育的秈稻3037與粳型廣親和品種02428的雜種F>以及Fa群體。 2 DNA提取
在水稻分蘗期或孕穗期取1克左右水稻葉片，利用SDS方法提取DNA。 DNA提取參照Dellapporta等(1983 )的方法，略有修改，具體步驟如下
① 取200-300 mg新鮮水稻葉片(-20°C保存的葉片)，在-20°C預冷研缽中用液氮研磨 成粉末。
② 轉移到1.5 ml離心管中。
③ 加入600ul SDS提取液搖勻，65°C,溫浴30min,振蕩3-4次。
加入1/4體積(約100ul)KAc，搖勻。
⑤ 加入1/2體積(約300-400 ul)的氯仿:異戊醇(體積比:24: 1),振蕩器上充分搖勻 (120rpm， 30min)。
⑥ 室溫下6000-8000rpm離心15min，取上清。
⑦ 加入2倍體積(700ul左右)-2(TC預冷的無水乙醇、搖勻，-20'C自由沉淀20min。
⑧ 室溫下12000rpm離心6min，棄上清，沉淀用等體積(400 ul左右)70%乙醇洗滌 10min。
⑨ 棄70。/。乙醇，DNA沉淀風干后，溶解于200ulTE(l/10),4。C保存備用。 用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA樣品質量。
3引物設計及PCR反應
iV'基因是利用圖位克隆方法從江蘇農業科學院選育的02428中克隆(PNAS,2008, 105(32):11436-11431 )，與秈稻和粳稻等位基因相比較，&"基因在5'端缺失136bp， 導致該基因功能喪失，與秈稻和粳稻的雜種F,不存在S5位點的育性障礙。橫跨該缺 失設計PCR引物S5I36,&"基因的PCR產物為441 bp,秈稻和粳稻的S5等位基因PCR 產物為577 bp，引物設計采用Primer 5軟件。
S5136-For: 5' ATCAACCCATTTCCTTTCCT 3'
S5136-Rev: 5' ATACGCTCGATCGGATTAAC 3'
引物合成由Invitrogen公司完成。將合成的引物用ddH20稀釋為10pmol/W， -20°C保存備用。
以提取的DNA為模板，按下列反應體系進行PCR。PCR反應體系(25iil)為DNA 2.0^1,上游引物S5136-For0.5 下游引物S5136-Rev 0.5 10xbuffer 2.5fil, MgCl2 (5mmol/L)2p1, Taq酶0,25p1, dNTP ( 2.5 mmol/L) 1^1,純水16.25^1。擴增條件 為94。C, 5min; 94°C , 30s， 58°C, 30s, 72°C , 30s, 35個循環；72°C,延伸10 min; l(TC,冷卻10min，結束反應。PCR反應在MJPTC200熱循環儀中進行，擴增產物加 入指示劑(0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲苯青FF、 40%蔗糖水溶液)，將擴增產物利用 1%瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成相系統保存圖象。
利用標記S5136引物對"3037/02428'下2群體單株進行PCR分析(圖1 ),擴增出3 種帶型，兩種親本型， 一種是雜合型，基因型比例符合l: 2: 1。
實施例2:利用S5I36標記對水稻品種資源的標記基因型分析 用于分析的材料包括亞洲栽培稻(Oz7加&r/raL.)(秈稻，粳稻)及栽培稻的祖先 普通野生稻((9A7加Ww,pogM)和雜草稻材料；地理分布上包括中國、日本、印度、韓國、 美國、泰國的品種資源共550份。這些材料既有大面積推廣栽培品種，也包括地方品 種，如太湖流域地方品種。Dular是來源于印度的Aus群的一個地方品種，具有紅色果 皮，它具有比02428更強的親合力與親合譜，是常用的廣親和基因資源。其它秈稻如 9311， IR24， IR36,南京ll,南京14,南京16, IR58,揚輻秈2號，揚稻l號，鎮秈 96,桂朝2號，密陽23，湖南早，早香1號，中早9號，成矮29,茉莉香秈，云南秈， 小麻占，紫B,制5，多恢43等；粳稻包括日本晴，武育粳3號，武運粳7號，武粳 15,南粳41，徐稻3號等。雜草稻材料包括連云港櫓稻3份，安徽懷遠塘稻、來安塘 稻、全椒塘稻、肥東塘稻各1份，由江蘇省農業科學院糧食作物研究所品種資源室保 存，以及本課題組近年來在江蘇揚州、南通、鎮江、泰洲、鹽城收集到的雜草稻17份 材料。
從這些材料中鑒定出Dular、水源341、雙竹占、嘉農秈育43、 CP231 、 NEW-BONNET、 221、鎮杣96、 SM117-T2、 SM118B44-T2、 P41-l、 P41-2、紅根矮子 占、俄山大白谷、P50VP3和粳稻恢復系0707、 0709具有廣親和基因57 (圖2)。
權利要求
1、廣親和基因S5n的分子標記方法，其特征在于開發了可以準確鑒別廣親和基因S5n基因型的共顯性InDel標記S5136上游引物5′ATCAACCCATTTCCTTTCCT 3′下游引物5′ATACGCTCGATCGGATTAAC 3′擴增有廣親和基因S5n的品種DNA，能夠擴出441bp的擴增片段，而不帶S5n的品種DNA擴增出577bp片段。
2、 根據權利要求書1所述廣親和基因&"的基因型鑒定的分子標記，其特征在于， 獲得基因型選擇標記引物的過程如下1) 江蘇省農業科學院選育的02428具有廣親和基因&",已經克隆(PNAS,2008， 105(32):11436-11431 )。 S5基因編碼一個天冬氨酰蛋白酶，通過控制雌配子的育 性而影響結實率。秈粳稻的S5等位基因間僅兩個堿基的差別，引起相應蛋白質 兩個氨基酸的替換，造成其雜種的不育。廣親和品種的S5基因(廣親和基因) 則因其大片段缺失，導致功能喪失，無論與秈稻還是粳稻雜交都不影響雜種育性。 我們根據其等位基因的差異設計了 InDel標記S5136。2) 利用SDS方法提取02428與3037的F2群體各單株的DNA，利用InDel標記 S5136引物進行PCR，擴增產物在1%瓊脂糖電泳分析，標記基因型符合l: 2: 1 的比例(圖1 )。3) 利用該標記對江淮流域的雜草稻包括連云港櫓稻3份，安徽懷遠塘稻，來安 塘稻，全椒塘稻，肥東塘稻，以及近年來在江蘇收集到的雜草稻共24份材料擴 增出577bp片段，沒有檢測到&"基因。191份秈稻親本資源鑒定出6份有&-"基 因，而335份分布于世界各地的品種資源也鑒定出9份有&"基因，其中2份具 有雜合基因型，主要是越南和印度的資源，2份江蘇農科院選育的粳稻恢復系有基因，印度品種Dular具有基因(圖2 )。
全文摘要
本發明涉及廣親和基因S₅ⁿ的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域。根據已克隆的廣親和基因S₅ⁿ和秈稻等位基因Si、粳稻等位基因Sj基因結構的差異設計了InDel標記S5136，該InDel標記與廣親和基因S₅ⁿ及其等位基因共分離。利用該標記可以準確地從品種資源中篩選鑒別帶有廣親和基因S₅ⁿ的材料，可用于廣親和基因S₅ⁿ的分子標記育種和水稻廣親和恢復系的選育。
文檔編號C12Q1/68GK101613740SQ20081024377
公開日2009年12月30日 申請日期2008年12月15日 優先權日2008年12月15日
發明者仲維功, 杰 楊, 軍 王, 陳志德 申請人:江蘇省農業科學院