專利名稱：一種生物材料玻璃化冷凍載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種生物材料玻璃化冷凍載體。
背景技術(shù)：
目前，低溫冷凍技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。玻璃化冷凍技術(shù)是利用體積微
小的冷凍承載工具，在極快速降溫(〉2 00(TC/min)過(guò)程中，使高濃度的冷凍保護(hù) 液由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轲ざ群芨叩念愃撇Ａ拥墓虘B(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，達(dá)到冷凍 保護(hù)的作用，從而顯著提高細(xì)胞/組織冷凍后的存活力和發(fā)育能力。玻璃化冷凍技 術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、省時(shí)、安全、費(fèi)用少等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，玻璃化冷凍技術(shù)在人卵 與胚胎的冷凍保存中的應(yīng)用逐漸增多，利用該技術(shù)對(duì)人未成熟卵母細(xì)胞、成熟卵母 細(xì)胞、胚胎及囊胚進(jìn)行冷凍均巳有成功報(bào)道。
冷凍載體是冷凍保存時(shí)承載細(xì)胞/組織的物體，玻璃化冷凍成功的關(guān)鍵因素之 一就是選擇適當(dāng)?shù)睦鋬鲚d體。目前使用的玻璃化冷凍載體主要包括開(kāi)放式拉細(xì)麥 管、封閉式拉細(xì)麥管、電子顯微鏡銅網(wǎng)、Cryoloop、 Cryotop和Cryoleaf等。冷凍 載體的功能在于承載標(biāo)本的同時(shí)盡量減少負(fù)載的冷凍液，達(dá)到以下兩個(gè)目的冷 凍過(guò)程中使標(biāo)本直接接觸液氮，快速降溫達(dá)到玻璃化狀態(tài)；解凍過(guò)程中使凍存標(biāo)本
充分接觸解凍液，及時(shí)脫離高濃度冷凍保護(hù)劑環(huán)境。
目前已有的玻璃化冷凍載體在制作、使用中存在著各種問(wèn)題，影響了凍存效率
和玻璃化冷凍技術(shù)的開(kāi)展。開(kāi)放式拉細(xì)麥管或封閉式拉細(xì)麥管存在如下問(wèn)題制作 過(guò)程中加熱裝置(酒精燈或熱板)的溫度不易控制，溫度稍低不能將麥管拉長(zhǎng)，溫 度稍高麥管易斷；存儲(chǔ)過(guò)程中易受到外力破壞而斷損，致凍存標(biāo)本丟失。電子顯微 鏡銅網(wǎng)、Cryoloop、 Cryotop在冷凍過(guò)程及儲(chǔ)存過(guò)程容易丟失標(biāo)本。所以上述冷凍 載體在臨床應(yīng)用推廣中可行性差，不被廣泛接受。Cryoleaf是目前臨床上應(yīng)用最廣 泛的冷凍載體，但費(fèi)用昂貴(每支約需200元人民幣)，在科學(xué)研究中難以廣泛采 用。

實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種生物材料玻璃化冷凍載體。
本實(shí)用新型提供的生物材料玻璃化冷凍載體，其特征在于它包括注射針頭1
3和麥片2;
所述注射針頭1由針頭1-1和針頭座1-2組成；
所述麥片2為開(kāi)放型拉細(xì)麥管，其一端2-l套設(shè)于所述針頭1-l的內(nèi)腔中；另
一游離端2-2的麥管壁部分缺失，余留麥管壁的橫截面為圓周的1/5-1/3。 所述針頭1-1的內(nèi)腔與所述開(kāi)放型拉細(xì)麥管的口徑最好匹配。 所述冷凍載體還可包括防護(hù)套3，所述針頭1-1和所述麥片2套設(shè)于防護(hù)套3內(nèi)。
為了組裝方便，所述麥片2套設(shè)于所述針頭中的一端2-1的端緣為尖端；所述
針頭1-1的端緣為平端。
所述麥片2游離端2-2余留麥管壁的橫截面具體可為圓周的1/3。
所述麥片2的厚度最好控制在80-100um之間，外徑、內(nèi)徑及長(zhǎng)度可根據(jù)所選
用的注射針頭而定。
所述麥片2的外徑具體可為0. 8-1. 2mm，優(yōu)選lmm;所述麥片2的內(nèi)徑具體可 為O. 6-1.04mm，優(yōu)選0. 8mm;所述麥片2的長(zhǎng)度具體可為2. 5-3. 5cm，優(yōu)選3cm。
所述注射針頭可為任何市售注射針頭，所述麥片可由任何市售麥管制作而成。
所述針頭1-1可采用金屬材質(zhì)，所述針頭座l-2可采用塑料材質(zhì)，所述麥片2 的可采用聚乙烯材質(zhì)，所述防護(hù)套3具體可為注射器針頭套。
所述生物材料玻璃化冷凍載體可按照如下步驟制備
本發(fā)明提供的制備方法，包括如下步驟是將開(kāi)放型拉細(xì)麥管的一端2-l套設(shè) 入注射針頭1的針頭1-l的內(nèi)腔中；另一端2-2沿縱向切去部分麥管壁，余留麥管 壁的橫截面為圓周的1/5-1/3;得到生物材料玻璃化冷凍載體。
所述開(kāi)放型拉細(xì)麥管可將麥管在沸水浴中拉長(zhǎng)得到。
實(shí)際操作時(shí)，可將保護(hù)套3套設(shè)于所述針頭1-1和麥片2外，對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。 為了組裝方便，制備本實(shí)用新型的冷凍載體時(shí)，可先將麥片2的一端2-1的端
緣加工為尖端，將針頭1-1的端緣加工為平端。
得到的生物材料玻璃化冷凍載體可以消毒后售出，也可直接售出，使用前進(jìn)行
消毒即可。常規(guī)消毒方法均可采用，如環(huán)氧乙垸熏蒸法。
本實(shí)用新型提供的生物材料玻璃化冷凍載體，具有如下優(yōu)點(diǎn)
1)材料主要是一次性注射針頭和麥管，來(lái)源豐富、成本低(注射器針頭每支
l.O元，麥管每支0.4元)。2) 冷凍載體上有多處用于標(biāo)記的部位，使用很方便。
3) 冷凍載體占用儲(chǔ)存容器空間小，易于儲(chǔ)存、運(yùn)輸。
4) 具有防護(hù)套，可以防止外界的機(jī)械碰觸而導(dǎo)致的凍存標(biāo)本丟失，凍存標(biāo)本 放心、可靠。
本實(shí)用新型可以解決目前存在的自制冷凍載體難度大，而商品化載體價(jià)格昂貴 的問(wèn)題，適用于各醫(yī)院生殖中心實(shí)驗(yàn)室及各研究單位使用，對(duì)于推動(dòng)玻璃化冷凍技 術(shù)的發(fā)展以及卵、胚胎、卵巢組織等的冷凍保存研究有著重要的意義。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本實(shí)用新型，但并不限定本實(shí)用新型。

圖1為生物材料玻璃化冷凍載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為麥片的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為圖2的俯視圖。
圖4A、圖4B、圖4C為應(yīng)用生物材料玻璃化冷凍載體的操作示意圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例l、生物材料玻璃化冷凍載體的制備
一、 材料的準(zhǔn)備
市售注射針頭(18號(hào))；市售注射器針頭套(18號(hào))；
麥管(0. 25ml):法國(guó)I.M.V公司。
二、 生物材料玻璃化冷凍載體的制備
用鉗子將注射針頭的針頭前二分之一處剪斷成平口，得到平口注射針頭；
用電爐將雙蒸水煮沸；
用血管鉗將麥管兩端夾住；
手持血管鉗，將麥管浸入沸水浴中，向兩端平拉至原管長(zhǎng)的4倍，得到開(kāi)放 型拉細(xì)麥管(外徑1.0mm，內(nèi)徑0.8mm);
將開(kāi)放型拉細(xì)麥管抬離液面，維持原先的拉力數(shù)秒，至冷卻； 用剪刀將開(kāi)放型拉細(xì)麥管剪成3厘米的管段； 將開(kāi)放型拉細(xì)麥管(3厘米) 一端剪成0.5厘米斜口末端； 將管段的斜口末端插入平口注射針頭，進(jìn)深1.3厘米；
用手術(shù)刀片從開(kāi)放型拉細(xì)麥管(3厘米)中點(diǎn)開(kāi)始，沿縱向切去長(zhǎng)1.5cm、截面2/3圓周的管壁，剩余管壁修整為長(zhǎng)1. 3cm、寬O. lcm的薄片； 得到生物材料玻璃化冷凍載體。
如圖1所示，生物材料玻璃化冷凍載體由注射針頭l、麥片2和防護(hù)套3組成；其 中，注射針頭l由端緣為平端的針頭卜l和針頭座l-2組成；麥片2的一端2-l的端緣 為尖端、套設(shè)于針頭l-l的內(nèi)腔中，另一端2-2麥管壁部分缺失，呈薄片狀；針頭l-l 和麥片2套設(shè)于防護(hù)套3內(nèi)。由圖2和圖3可見(jiàn)，麥片2的一端2-l為斜口末端，另一端 2-2麥管壁部分缺失，呈薄片狀。
針頭l-l的作用為把持、固定麥片；針頭1-l的孔可作為減壓孔，不僅可以在將 載體浸入液氮時(shí)做為液氮自行注入管內(nèi)的進(jìn)口，在從液氮中取出時(shí)，還可以釋放管 內(nèi)因液氮迅速氣化而產(chǎn)生的高壓。針頭座l-2用于操作時(shí)把持和文字標(biāo)記。麥片2的 2-l端與注射針頭l的針頭l-l連接，起固定作用。麥片2的2-2端承載要凍存的標(biāo) 本，浸入液氮中使標(biāo)本與液氮直接接觸而急速降溫達(dá)到玻璃化狀態(tài)。防護(hù)套3保護(hù) 麥片2及凍存標(biāo)本免遭外界機(jī)械性碰撞，避免存放時(shí)標(biāo)本丟失，還可用于文字標(biāo)記。 所以組裝后的注射針頭1和麥片2的長(zhǎng)度等于或略小于防護(hù)套3的長(zhǎng)度。
實(shí)施例2、生物材料玻璃化冷凍載體的應(yīng)用
將實(shí)施例l制備的冷凍載體用環(huán)氧乙垸熏蒸法消毒。用消毒后的冷凍載體玻璃 化冷凍53枚小鼠成熟卵母細(xì)胞，冷凍1天后，解凍卵母細(xì)胞，檢測(cè)其存活情況。復(fù) 蘇卵母細(xì)胞存活標(biāo)準(zhǔn)為卵母細(xì)胞折光性好，透明，沒(méi)有明顯的胞漿皺縮,透明帶與 細(xì)胞膜完整。
平衡液(EM) : 10。/o乙二醇+l(^二甲基亞砜+10y。胎牛血清+DPBS; 玻璃化冷凍液(VM) : 20。/。乙二醇+20y。二甲基亞砜+l(m胎牛血清+DPBS; 解凍液(Tl溶液)0. 1M蔗糖+10。/。胎牛血清+DPBS; 解凍液(T2溶液)0.5M蔗糖+l(m胎牛血清+DPBS; 解凍液(T3溶液)0.25M蔗糖+1(^胎牛血清+DPBS; 解凍液(T4溶液)1(m胎牛血清+DPBS; M16培養(yǎng)基Sigma公司。 一、玻璃化冷凍
室溫下將小鼠成熟卵母細(xì)胞在平衡液(EM)中停留5分鐘后移入玻璃化冷凍液 (VM)中40秒，移到用冷凍載體的麥片上(見(jiàn)圖4A)，立即投入液氮(見(jiàn)圖4B)， 在液氮中蓋好注射器針頭帽(見(jiàn)圖4C)。
6二、快速解凍
將冷凍l天的小鼠成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行解凍，并檢測(cè)解凍后細(xì)胞的存活情況，具 體操作如下
從液氮中迅速取出冷凍載體，在室溫下把負(fù)載小鼠成熟卵母細(xì)胞的冷凍載體的
麥片(見(jiàn)圖4A)迅速放入T1溶液，在體式顯微鏡下找到卵母細(xì)胞，依次移入T2溶液、 T3溶液和T4溶液中，各停留3min，最后移入M16培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中(37°C， 5%C02)孵 育l小時(shí)后觀察卵母細(xì)胞存活情況。
結(jié)果表明，凍存53枚卵母細(xì)胞，解凍復(fù)蘇后獲得53枚卵母細(xì)胞，存活47枚，無(wú) 丟失，存活率88.7%。
權(quán)利要求1、一種生物材料玻璃化冷凍載體，其特征在于它包括注射針頭(1)和麥片(2)；所述注射針頭(1)由針頭(1-1)和針頭座(1-2)組成；所述麥片(2)為開(kāi)放型拉細(xì)麥管，其一端(2-1)套設(shè)于所述針頭(1-1)的內(nèi)腔中；另一游離端(2-2)的麥管壁部分缺失，余留麥管壁的橫截面為圓周的1/5-1/3。
2、 如權(quán)利要求1所述的冷凍載體，其特征在于所述冷凍載體還包括防護(hù)套(3)， 所述針頭(1-1)和所述麥片(2)套設(shè)于防護(hù)套(3)內(nèi)。
3、 如權(quán)利要求2所述的冷凍載體，其特征在于所述防護(hù)套(3)為注射器針頭套。
4、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)套設(shè)于所述針頭中的一端(2-1)的端緣為尖端；所述針頭(1-1)的端緣為平端。
5、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)游離 端(2-2)余留麥管壁的橫截面為圓周的1/3。
6、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)的外 徑為O. 8-1.2mm、內(nèi)徑為0. 6-1. 04mm，所述麥片(2)的長(zhǎng)度為2. 5-3. 5cm。
7、 如權(quán)利要求6所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)的外徑為lmm、 內(nèi)徑為0.8mm，所述麥片(2)的長(zhǎng)度為3cm。
8、 如權(quán)利要求4所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)游離端(2-2) 余留麥管壁的橫截面為圓周的1/3。
9、 如權(quán)利要求8所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)的外徑為0. 8-1. 2mra、 內(nèi)徑為0.6-1.04mm，所述麥片(2)的長(zhǎng)度為2. 5-3. 5cra。
10、 ，如權(quán)利要求9所述的冷凍載體，其特征在于所述麥片(2)的外徑為lmm、 內(nèi)徑為0.8mm，所述麥片(2)的長(zhǎng)度為3cm。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種生物材料玻璃化冷凍載體。本實(shí)用新型提供的生物材料玻璃化冷凍載體包括注射針頭(1)和麥片(2)；所述注射針頭(1)由針頭(1-1)和針頭座(1-2)組成；所述麥片(2)為開(kāi)放型拉細(xì)麥管，其一端(2-1)套設(shè)于所述針頭(1-1)的內(nèi)腔中；另一游離端(2-2)的麥管壁部分缺失，余留麥管壁的橫截面為圓周的1/5-1/3。本實(shí)用新型將處理后的開(kāi)放型拉細(xì)麥管與注射針頭組裝，用于生物材料的玻璃化冷凍，具有操作簡(jiǎn)便，成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于各醫(yī)院生殖中心實(shí)驗(yàn)室及各研究單位使用，對(duì)于推動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展以及卵、胚胎、卵巢組織等的冷凍保存研究有著重要的意義。
文檔編號(hào)C12M1/24GK201284339SQ20082012320
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者杰 嚴(yán), 杰 喬, 平 劉, 穎 廉, 閆麗盈 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院