專利名稱：：致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及病原微生物的檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及食品中致瀉性大腸埃希氏菌mPCR-DHPLC檢出試劑盒及方法。
背景技術：
：致瀉性大腸埃希氏菌是與人類疾病有關的大腸桿菌的統稱，包括腸產毒性大腸桿菌(五wtera/ox(g^"/c五.co//，ETEC)、腸致病性大腸桿菌(五她ra/"f/zoge"/c五.co/z'，EPEC)、腸出血性大腸桿菌(五wfera/2ewwr/wg/c五.co//，EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(五"^w'"vawVeEIEC)等。致瀉性大腸桿菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的全球性疾病的主要致病菌，其中尤以EPEC、ETEC所占比例為大。多年來，致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例始終位于第二位，可見大腸桿菌腸道傳染的廣泛性。EHEC0157:H7己被世界衛生組織(WHO)定為新的食源性致病菌，其引發的出血性腸炎的暴發或散發病例，自1983年以來在北美州(美國、加拿大)地區逐年增多，英國、日本亦有爆發和散發病例報道，我國也發現散發病例，尚未有爆發EHEC的報道。目前，我國對大腸桿菌的診斷和流行病學調查也主要仍依靠菌株血清型的菌體抗原進行鑒定，但血清學分型檢測有其弊端檢測周期長并易受人為因素干擾，在一些不同的"O"血清型之間存在著交叉反應，而且多數從腹瀉病人糞便標本中分離出的大腸桿菌并不能用現有的血清抗原進行診斷鑒定。因而在許多臨床實驗室中，仍將未能鑒定的大腸桿菌作為腸道正常菌群看待，僅根據少數生化指標，甚至僅根據乳糖發酵一項就將分離物作為"雜菌"丟棄，從而殆誤診斷和治療的例子屢見不鮮。現在國內關于致病性大腸桿菌的國家標準(GB/T4789.6-2003)和行業標準檢測方法還是傳統的微生物學檢測方法，尚不夠完善，四種致瀉性大腸桿菌的分類鑒定僅依靠血清學凝集反應現象，而很多情況下腸致病性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌容易出現血清學的交叉反應，很難進行區分。而國外的傳統微生物檢測方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以單一的或少數目標菌為目的設計的程序，既費時又費力。目前，有些成熟的微生物快速鑒定系統己經被應用于致瀉性大腸桿菌的檢測，但是開發較多的也僅限于腸出血性大腸桿菌0157:H7。如熒光免疫檢測法(VIDAS)、BAX全自動病原菌篩選系統、API20E等。在分子生物學檢測方面，目前FDA2004標準仍是以檢測一種致瀉性大腸桿菌為目的設計程序，檢測不同的致瀉性大腸桿菌需要不同的反應條件。因此，建立高效、快捷、高通量的致瀉性大腸埃希氏菌分型鑒定技術是食品安全所面臨的急需解決的問題。變性高效液相色譜(DHPLC)采用離子對反相高效液相色譜的原理，是通過使用特殊的耐高溫液相色譜分離柱同時采用溫度調控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離的方法，因此，也有人稱該技術為溫度調控離子對反相高效液相色譜。該技術的發明為生命科學領域里的核酸分析提供了方便實用的技術平臺。其快速高通量、全自動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優點使其在核酸分析中具有無可替代的優勢。DHPLC技術檢測微生物是很好的培養不依賴的混合微生物樣本的分析平臺，不僅能鑒定常見的微生物，還能鑒定不常見的，苛刻的，和厭氧的細菌。該技術在己知和未知基因突變的檢測和篩選、基因分型、基因定量和長度多態性分析等領域已經得到廣泛應用。基于此，本發明人試圖建立利用DHPLC的高效、快捷、簡便的適宜臨床檢測應用的特異而靈敏的致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種用于靈敏快捷地檢測樣品、尤其是檢測食品中致瀉性大腸埃希氏菌以判定待檢樣品是否受到污染的試劑盒及其檢測方法。首先，本發明所述的致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒是lmL檢測溶液含10mMTris.Cl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾ndTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(即5UML)及四種致瀉性大腸埃希氏菌引物對各10其中，針對四種致瀉性大腸埃希氏菌的目的基因及特異性引物序列如下5菌株目的基因上、下游引物序列(5'-3')腸產毒性大腸桿菌GCACACGCAGCTCCTCAGTC(ETEC)TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT腸致病性大腸桿菌的GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT(EPEC)GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT腸出血性大腸桿菌ATTGCGCTGAAGCCTTTG(EHEC)CGAGTACATTGGCATCGTG腸侵襲性大腸桿菌/a/CTGGATGGTATGGTGAGG(EIEC)GGAGGCCAACAATTATTTCC本發明還提供了利用上述試劑盒檢測致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法，包括如下步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱(4.6mmx50mm，粒度3jim);柱溫50°C;流動相(體積比)0.0min，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;3.6min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B;6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液。流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5pL;檢測結束后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定樣品的染菌情況。檢測過程中可以設陽性對照和陰性對照。陽性對照為擴增片段的陽性克隆分子DNA或陽性菌株DNA，陰性對照為非目標致病菌DNA。陰性對照在上述DHPLC分析條件下，無吸收峰出現；陽性對照在上述DHPLC分析條件下，腸產毒性大腸桿菌在約5.2min出現PCR產物吸收峰；腸致病性大腸桿菌在約6.5min出現PCR產物吸收峰；腸侵襲性大腸桿菌在約7.1min出現PCR產物吸收峰;腸出血性大腸桿菌在約10.5min出現PCR產物吸收峰。且以上典型的PCR產物吸收峰值大于2mV;在上述DHPLC分析條件下，約5.2min出現PCR產物吸收峰，為腸產毒性大腸桿菌；約6.5min出現PCR產物吸收峰，為腸致病性大腸桿菌；約7.1min出現PCR產物吸收峰，為腸侵襲性大腸桿菌；約10.5min出現PCR產物吸收峰，為腸出血性大腸桿菌。上述檢測方法中所述的待測樣品DNA溶液是指用常規的細菌基因組提取的基因組DNA。疑似染菌的樣品可以通過常規方法增菌培養后用于提取基因組DNA。通常可以采用如下的試劑盒提取法制備待測樣品DNA基因組a.食品樣品無菌方法稱取25克樣品于225mL緩沖蛋白胨水中，46h增菌后，取10mL轉移到10mL營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-20'C保存。b.標準菌株挑取單個菌落于營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。本發明采用多重PCR結合變性高效液相色譜(mPCR-DHPLC)技術，針對食品中4類致瀉性大腸埃希氏菌建立靈敏便捷的檢測方法，并在此基礎上，建立食品中致瀉性大腸埃希氏菌快速檢測試劑盒。本方法采用致瀉性大腸桿菌的毒力因子基因檢測四種致瀉性大腸桿菌，可以檢測出致瀉性大腸桿菌的同時進行四種類型的區分。檢測四種致瀉性大腸桿菌的檢測下限低于10cfU/mL，只要每毫升菌液里各致瀉性大腸桿菌數有10個，用本方法就可以檢測出來。此外，本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。本發明附圖5幅，其中"圖1是mPCR-DHPLC方法的種間特異性試驗中EPEC的檢測圖譜；圖2是mPCR-DHPLC方法的種間特異性試驗中ETEC的檢測圖譜；圖3是mPCR-DHPLC方法的種間特異性試驗中EHEC的檢測圖譜；圖4是mPCR-DHPLC方法的種間特異性試驗中EIEC的檢測圖譜；圖5是四種致瀉性大腸埃希氏菌的mPCR-DHPLC檢測結果；上述附圖中，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發明的內容。若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源為細菌基因組DNA小量純化試劑盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)、Taq酶及PCR緩沖液等試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；普通PCR儀PE24000(PerkinElmer公司，美國)；變性高效液相色譜儀NAV-99-4500(Transgenomic公司，美國)；高速離心機centrifuge5804(Eppendorf公司，德國)。本部分所使用的標準菌株分別購自美國ATCC標準生物品收藏中心和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。實施例1、致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒及其檢測方法的建立本實施例確定用于檢測的目的基因及其引物如下表所示8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在此基礎上，設計用于PCR擴增的致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒lmL檢測溶液含10mMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾ndTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5UL及四種致瀉性大腸埃希氏菌引物對各10nM。使用該試劑盒檢測樣品中的致瀉性大腸埃希氏菌的mPCR-DHPLC方法包括如下步驟①待檢樣品的制備采用試劑盒提取法制備待測樣品DNA基因組c.食品樣品無菌方法稱取25克樣品于225mL緩沖蛋白胨水中，46h增菌后，取10mL轉移到10mL營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-20"C保存。d.標準菌株挑取單個菌落于營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-20。C保存。；②PCR擴增取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56。C退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色譜柱PS-DVB&CI8DNASep色譜柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱溫50°C;流動相(體積比):O.Omin，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;3.6min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B;6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液。流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5liL;實施例2、特異性試驗取表2中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立模板庫。然后以這些基因組DNA為模板，以6#、仏-E、為目的基因采用實施例1所建立的條件進行mPCR-DHPLC分析檢測。4種不同類型的致瀉性大腸桿菌DHPLC特異性檢測圖譜如附圖14所示，箭頭所指的峰型為各致瀉性大腸桿菌的特異性吸收峰；具體結果見表2。結果顯示，在mPCR反應體系中，a.6種血清型的腸致病性大腸桿菌(EPEC)全部擴增出了6》目的基因片段，而其他非EPEC菌株則全部為陰性結果(附圖l);b.3個血清型的4株腸產毒性大腸桿菌(ETEC)全部擴增出了目的基因片段，而非ETEC菌株則全部為陰性結果(附圖2);c.2株腸出血性大腸桿菌(EHEC)0157:H7全部擴增出^Z)E目的基因片段，而非EHEC菌株則全部為陰性結果(附圖3);d.1株腸侵襲性大腸桿菌(E正C)擴增得到/"/目的基因片段，其余非EIEC菌株全部為陰性結果(附圖4)。上述結果表明本實驗設計的四重引物適用于inPCR-DHPLC檢測致瀉性大腸桿菌，具有很高的種間特異性。_表2_a,,顯示陽性PCR結果的菌株數/測試菌株數困休詠卿/a/EnteropathogenicOlll:nmATCC43887i/i0/10/10/1086:K61CIQai/i0/10/10/1026:腿CIQi/i0/10/10/1044:K74CIQi/i0/10/10/10119:K69CIQi/i0/10/10/1O114:K90CIQi/i0/10/10/1Enterotoxigenic078:H11ATCC354010/11/10/10/1O78:K80CIQ0/22/20/20/2025:K19CIQ0/11/10/10/1Enterohemorrhagicco//0157:H7ATCC351500/10/11/10/10157:H7CIQ0/10/11/10/1Enteroinvasive0124達ATCC438930/10/10/11/1foc/zm'c/n'"co/ZATCC259220/10/10/10/1foc/^"'Cco/iATCC83790/10/10/10/1foc/zm'c/;/"co//ATCC117750/10/10/10/1&c/2mc*/n'aco/iCIQ0/50/50/50/55^/附0/7^//仏/)^/n'mwn't/mATCC494160/10/10/10/1&/,we〃"，c/zo/eraeATCC107080/10/10/10/1e她n7i&ATCC130760/10/10/10/1C7加6a"er加i/m/z7ATCC80900/10/10/10/1幼脈W".Zfec固.ATCC120220/10/10/10/1/Vo^w51m/ra6///51ATCC292450/10/10/10/1vw/,&CMCC490270/10/10/10/1C"附p少/oZ""e「/咖w/ATCC332910/10/10/10/1lfera'm'ae她wco/Z"'caATCC96100/10/10/10/1實施例3、四種致瀉性大腸埃希氏菌的mPCR-DHPLC檢測結果分別取腸產毒性大腸桿菌(ETEC)ATCC35401、腸致病性大腸桿菌(EPEC)ATCC43887、腸出血性大腸桿菌(EHEC)ATCC35150、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)ATCC43893標準菌株在36。C培養18h，測其OD值，估計其菌數，然后按10"，10—2，10—3等倍數梯度稀釋，取幾個適宜梯度的菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其菌濃度。將適當濃度的4種菌液混合，并按1(T1，10'2進行倍數梯度稀釋，配成混合菌液腸出血性大腸桿菌8CFU/mL，腸侵襲性大腸桿菌6CFU/mL，腸產毒性大腸桿菌7CFU/mL，腸致病性大腸桿菌6CFU/mL。采用試劑盒提取法制備基因組DNA，制備待測樣品DNA溶液，采用上述條件進行mPCR-DHPLC分析檢測。測量結果的DHPLC譜圖如附圖5所示。由該結果可見，四種致瀉性大腸埃希氏菌的mPCR-DHPLC行為具有明顯的差異，本發明的試劑盒及檢測方法可以在一次檢測中非常有效地將染菌樣品中的這四種菌區分識別。實施例4、mPCR-DHPLC檢測靈敏度試驗分別取腸產毒性大腸桿菌(ETEC)ATCC35401、腸致病性大腸桿菌(EPEC)ATCC43887、腸出血性大腸桿菌(EHEC)ATCC35150、腸侵襲性大腸桿菌(E正C)ATCC43893標準菌株在36。C培養18h，測其OD值，估計其菌數，然后按10"，10—2，10—3等倍數梯度稀釋，取幾個適宜梯度的菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其菌濃度。將適當濃度的4種菌液混合，并按10"，10—2進行倍數梯度稀釋，形成三個混合菌液系列(如表3)，每個系列梯度菌液采用試劑盒提取法制備模板DNA，進行PCR-DHPLC檢測，確定反應體系的靈敏度。表3腸出血性大腸桿腸侵襲性大腸桿腸產毒性大腸桿腸致病性大腸桿菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)系列1800600700600系列280607060系列38676結果表明，在四種致瀉性大腸桿菌的混合液中，當菌液濃度為腸產毒性大腸桿菌(ETECATCC35401)7CFU/mL、腸致病性大腸桿菌(EPECATCC43887)6CFU/mL、腸出血性大腸桿菌(EHECATCC35150)8CFU/mL、腸侵襲性大腸桿菌(EIECATCC43893)6CFU/mL時，各致瀉性大腸桿菌依然可被檢出。12實施例5、應用mPCR-DHPLC的食品檢測試驗自2007年10月至2008年5月，將上述建立的致瀉性大腸埃希氏菌的mPCR-DHPLC檢測試劑盒及檢測方法用于9大類1256份進出口農畜產食品樣品中致瀉性大腸桿菌的實際檢驗，同時采用國家標準方法(GB/T4789.6-2003)進行比較。對mPCR-DHPLC檢測結果結果的判斷標準是將待測樣品的PCR-DHPLC檢測譜圖與陰性對照及陽性對照(標準菌株)的PCR-DHPLC檢測譜圖比較，當陰性對照無任何特異性吸收峰出現，而陽性對照出現位置正確的特異性吸收峰時，若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，且峰高>2mV時，判定為陽性；若被檢樣品在該位置無特異性吸收峰，則判定為陰性；若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，但峰高<2mV時，則為可疑樣品，需要通過其他方法進行確認。試驗統計結果如表4:表4統計結果mPCR-DHPLC檢測結果GB/T4789.6-2003檢測結果樣本量12561256ETEC9ETEC9K口,Mf仕里EPEC11EPEC11陽'任多口采EHEC0EHEC0EIEC1E正C1陰性結果12351235陽性率％1.67%1.67%經統計，用mPCR-DHPLC方法檢出的21份陽性樣本采用經典的國家標準(GB)方法驗證，均證實為陽性。mPCR-DHPLC方法檢測出的陰性結果與GB方法結果符合。試驗中mPCR-DHPLC方法吻合率為100%,顯示該方法具有廣泛而且良好的適用性。本實施例中，使用GB/T4789.6-2003的方法，檢測每個樣品平均總耗時(包括樣品制備)96h，檢測耗時(不包括樣品制備)94h;使用mPCR-DHPLC方法，檢測每個樣品平均總耗時(包括樣品制備)25h，檢測耗時(不包括樣品制備)0.5h。1權利要求1、致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒，其特征在于1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四種致瀉性大腸埃希氏菌引物對各10μM；其中，致瀉性大腸埃希氏菌的特異性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="161"></tables>2、致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94t:變性60s，56"C退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱溫50°C;流動相(體積比)0.0min，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;·0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;3.6min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B;6.8min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;··9.9min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B;13min，35.0%緩沖溶液A，65.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為O.IMTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5)iL。全文摘要一種用于食品微生物污染檢測及監控的致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒及其檢測方法，所述的試劑盒中，每1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl₂、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及用于多重PCR的4對上、下游引物各10μM。本方法采用致瀉性大腸桿菌的毒力因子基因檢測四種致瀉性大腸桿菌，可以檢測出致瀉性大腸桿菌的同時進行四種類型的區分。檢測四種致瀉性大腸桿菌的檢測下限低于10CFU/mL，靈敏度高。此外，本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。文檔編號C12Q1/68GK101665823SQ20091001079公開日2010年3月10日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者徐君怡申請人:徐君怡