專利名稱：重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組金針菇免疫調節蛋白，尤其是涉及一種使用巴斯德畢赤酵母(P/c/n'a 進行表達的重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法及應用，屬于生物藥工程領域。
背景技術：
真菌免疫調節蛋白(Fungal immunomodulatory protein, FIP)最早是從靈芝子實體中提取獲得的一種小分子蛋白質(命名為LZ-8, Kino et al.， 1989， J Biol Chem:264:472-478)，具有刺激外周血淋巴細胞增殖，誘導白介素和干擾素等細胞因子分泌，促進核酸和蛋白質合成，抑制過敏反應，進而增強機體免疫力等功能。目前已從六種食、藥用真菌中獲得了這種真菌免疫調節蛋白質，分別是赤靈芝(LZ-8)，松杉靈芝(FIP-gts)，金針燕(FIP-fve; Ko et al., Eur J Biochem, 1995,228:244-249)，草菇(FIP-vvo)，紫芝(FIP-gja)和小孢子靈芝(FIP-gmi)，形成了 FIP家族。這六種真菌免疫調節蛋白之間有較高的同源性(60%~70%)和相似的免疫學活性，具有與凝集素和免疫球蛋白相似的結構。真菌免疫調節蛋白能夠凝集血細胞，促進小鼠脾淋巴細胞和人外周血淋巴細胞增殖，抑制多種過敏性反應，降低抗體產生，對抗小鼠足墊水腫和移植組織的排斥反應。其免疫調節活性主要表現為可促進免疫細胞增殖并促進T淋巴細胞分泌多種細胞因子(白介素-2、腫瘤壞死因子和干擾素IFN-y等)。另外，真菌免疫調節蛋白具有抗病毒和細菌感染，對多種腫瘤細胞具有抑制生長或者直接殺傷作用。
金針菇免疫調節蛋白FIP-Fve由114個氨基酸殘基組成，分子量為12704Da，不含組氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸。其一級和二級結構與人類免疫球蛋白重鏈可變區相似，為單純蛋白質，不含糖基。利用NaBr滲透對FIP-fVe進行單向不規則的晶體衍射方法揭示報道了其17A結構，發現對于FIP-fve活性起重要作用的二聚化是由于N端(X螺旋的三維交換形成，其二聚化主要靠疏水作用穩定
(Paaventhan et al. 2003, J Mol Biol, 332: 461-470)。
FIP-fve是一種有絲分裂原，作為一種激活劑，具有促進外周血單核細胞周期G0/G1向細胞周期S發展，進而促進淋巴細胞的分裂和增殖(Ko et al. 2008,Process Biochemistry 43:423-430)。 FIP-fVe能夠激活和誘導人外周血淋巴細胞和T淋巴細胞分泌白介素IL-2、干擾素IFNi、腫瘤壞死因子TNF-ot等細胞因子以及粘附因子ICAM-1，后者可促進不同的白細胞與靶細胞牢固結合，在上皮細胞發生炎癥的調控、免疫反應和組織修復中起重要作用。在非特異性免疫方面，FIP-fve還可以提高TNF-(3和一氧化氮的產量，顯著地提高腹腔細胞對患癌細胞的殺滅能力，提高罹患小鼠血清中特異性抗體的濃度。還能有效抑制鼠類系統性過敏毒素反應，鼠足墊水腫反應。研究表明FIP-fve對食物過敏和過敏性呼吸道類疾病也有較好的治療效果，可以對抗器官移植后的排異現象以及抑制對自體免疫所引起的糖尿病，通過減少IL-5ct受體以及凋亡信號蛋白表達誘導嗜酸性粒細胞凋亡而有效抑制炎癥和過敏反應。因此，FIP-fVe是一種潛在的非常有效的免疫調節類藥用蛋白。
由臺灣發明人申請的專利"真菌免疫調節蛋白之用途"(中國200610127042.7)公開了天然和重組的靈芝免疫調節蛋白的免疫調節和抗腫瘤作
用。其中提到天然金針菇免疫調節蛋白對降低糖尿病患者血糖的作用。由臺灣發明人申請的專利"用敏感貼劑對過敏性鼻炎進行鼻腔局部免疫治療"(Localnasal immunotherapy with allergen strip for allergic rhinitis; 美國 US Patent20040071718)闡述了天然金針菇免疫調節蛋白可以治療過敏性鼻炎。由新加坡發明人申請的專禾U"分子"(Molecule;美國20060275312 USPTO)公開了天然金針菇免疫調節蛋白的晶體結構，并以天然和細菌重組的融合蛋白為例闡述了金針菇免疫調節蛋白在治療和診斷免疫疾病方面的用途。
從天然金針燕菌體中提取真菌免疫調節蛋白的產率很低，約為30mg^g干重。因此應用基因工程將FlP-^e基因轉入到相應的宿主中表達獲得大量重組蛋
4白，進而開發應用是非常有意義和前景的。已有報道FIP-fVe在大腸桿菌TGI 和昆蟲細胞Sf21中的重組表達(Koetal, 1997, J Formos Med Assoc, 96: 517-524; Jinn et al. 2006, Biosci Biotechnol Biochem, 70:2627- 2634)，但產量較低僅為 15mg/L和6.25mg/L。盡管細菌表達具有簡單快速的特點，但是對于目的蛋白的 高級修飾不完善，生物學活性低于天然蛋白；而昆蟲細胞表達的重組蛋白接近 天然蛋白的生物學活性，但比較費時且成本較高。

發明內容
本發明就是針對上述現有技術存在的問題提出的，目的是利用巴斯德畢赤酵 母的重組表達，通過設計和構建，獲得高產率和高純度的重組金針燕免疫調節 蛋白，5升發酵工藝表達量300mg/L~350mg/L，具有與天然金針菇菌體中提取真 菌免疫調節蛋白相同的免疫生理功能，且成本低、容易實現的重組金針燕免疫 調節蛋白的制備方法。
本發明的另一個目的是重組金針菇免疫調節蛋白在免疫制劑中的應用。 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是重組金針燕免疫調節 蛋白的制備方法，包括下述步驟
(1) 、編碼FIP-fVe基因的克隆取干燥金針菇菌絲體在液氮研磨后，加入 DNA提取液，獲得基因組DNA，根據GenBank中已登錄FIP-fVe蛋白質序列
(Accession P80412)設計PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強重組免疫 蛋白的表達效率和準確性；
(2) 、重組巴斯德畢赤酵母表達載體的構建將克隆的目的基因與載體 pPIC9 —起經過酶切，回收和連接，然后轉化至大腸桿菌中，提取質粒 pPIC9隱FIP-fve;
(3) 、重組巴斯德畢赤酵母轉化子的獲得將上述構建好的重組酵母表達
載體pPIC9-FIP-fVe用BglII酶切線性化，采用電轉法將目的基因轉入酵母GS115 中表達，經轉化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的選擇培養基MD上，2S。C至少 培養3天分別挑至MM和MD培養基對比，提取轉化子酵母的總DNA;(4)、重組FIP-fVe的誘導表達和純化選取正確的酵母轉化子，首先用搖 瓶500-1000ml振搖培養誘導重組蛋白表達，確定其有表達后，挑選其中表達量 高的酵母菌進行5L發酵罐大量培養，發酵上清經透析后SDS-PAGE檢測，并用 君意凝膠分析系統測定目的蛋白產量，搖瓶發酵的產量至少為158.2 mg/L， 5L 發酵罐的產量至少為300mg/L~350mg/L，樣品進一步通過超濾系統超濾濃縮， 4。C的低溫透析后用血細胞凝集實驗確定其活性，并進行DEAE-A25離子柱層析 純化，再進一步用高效液相色譜進行純化，收集具有生理學活性的目的蛋白， 最后檢測重組FIP-fVe的純度。
歩驟(1)所述的設計PCR引物為上游，5、-cagaattcatgtccgccacgtcgctc acc-3 、； 下游，5 、 - ag gaattc ggatcc tea agt ctt ctt cca etc age -3、。
所述重組金針菇免疫調節蛋白在免疫制劑中的應用。
本發明的優點和有益效果如下
本發明的重組金針菇免疫調節蛋白，是通過克隆編碼金針菇免疫調節蛋白 的基因，構建巴斯德畢赤酵母表達載體，并經應用證明，通過工程菌發酵表達 獲得大量高產率和高純度的重組金針菇免疫調節蛋白，經純化后檢測其生物特
性和免疫生理活性。5升發酵工藝獲得的重組蛋白產量可達300mg/L 350mg/L， 純度達到90%以上，生物學特點和免疫生理活性與天然金針菇免疫調節蛋白相 同，具有凝血活性，促進小鼠淋巴細胞增殖及分泌白介素和干擾素的功能，并 能誘導腫瘤細胞凋亡。具體說明如下
1. 重組FIP-fVe和天然的FIP-fVe氨基酸組分一致采取酸水解方法分析重組 FIP蛋白的氨基酸組分，對氨基酸組分進行分析，證明重組蛋白的正確性。
2. 重組FIP-fVe和天然蛋白同樣具有相似的低含量a-螺旋和較多的(3-結構 對圓二色譜(CD)進行分析，重組FIP-fVe的a-螺旋，p-折疊和P-轉角的含量 分別為11.3%， 34.3%和11.9%，相對比例為l: 3: 1，與天然的FIPAe三者比 例接近。
3. 重組FlP-^e發生了糖基化修飾通過對重組真菌免疫調節蛋白糖含量分析，證明巴斯德畢赤酵母系統表達的重組FIP-fVe發生了糖基化修飾，而天然的 FIP-fVe不含糖成分，重組FIP-fVe經過一定的糖修飾，得到了正確的折疊而具有 生物學活性。
4. 重組FIP-fve與細胞的相互作用經熒光顯微鏡下觀察的結果表明重組 FIP-fve與三種細胞(人外周血淋巴細胞HPBL，人胚腎細胞293T，人肺癌細胞 A549)孵育后，重組金針菇免疫調節蛋白能夠進入這三種細胞內(正常淋巴細 胞和腫瘤細胞)，進而發揮其生物學功能，對作用細胞沒有特異選擇性。
5. 重組FIP-fVe體外促脾淋巴細胞增殖活性用MTT法檢測其在體外刺激小 鼠淋巴細胞的增殖，結果表明重組FIP-fve在促小鼠脾淋巴細胞增殖的活性和天 然蛋白相類似。另外，重組FIP-fve還和刀豆蛋白ConA共同作用刺激小鼠淋巴細 胞增殖，結果表明重組FIP-fVe主要是針對T型淋巴細胞起作用。
6. 重組FIP-fVe促進細胞的白介素-2和i干擾素分泌用ELISA方法檢測，結 果表明重組FIP-^e明顯的增強了小鼠脾淋巴細胞分泌白介素2 (IL-2)和y-干擾 素的水平，具有和天然蛋白以及昆蟲細胞表達的重組蛋白相似的功能。
7. 重組FIP-fve抑制腫瘤細胞的生長對體外抗腫瘤活性檢測，結果表明重 組FIP-^e對NB-4有明顯的抑制作用，在濃度為8pg/ml時的抑制率為38.5。/。和 45%。顯微鏡下觀察加入重組FIP-fVe的腫瘤細胞明顯有聚集和破裂現象，說明重 組FIP-fVe誘導腫瘤細胞死亡，可以通過誘導癌細胞的凋亡而抑制腫瘤細胞的生 長。


圖1是本發明表達重組金針菇免疫調節蛋白載體的示意圖。
圖2是本發明巴斯德畢赤酵母表達的重組金針菇免疫調節蛋白電泳圖。
圖3是本發明熒光標記FITC重組金針菇免疫調節蛋白與細胞的相互作用照片。
圖4是本發明重組金針菇免疫調節蛋白促進小鼠脾細胞增殖柱狀圖。
圖5是本發明自重組金針菇免疫調節蛋白誘導小鼠淋巴細胞分泌白介素-2和Y-干擾素柱狀圖。
圖6是本發明重組金針菇免疫調節蛋白誘導腫瘤細胞NB4凋亡顯微鏡觀察圖。
圖7是本發明重組金針菇免疫調節蛋白誘導腫瘤細胞NB4凋亡的流式細胞儀 記錄圖。
具體實施例方式
下面參見本發明的圖1至圖7并結合具體實施例對本發明進行進一歩詳細 說明，但本發明的保護范圍不受具體的實施例所限制，以權利要求書為準。另 外，以不違背本發明技術方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員 容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。 實施例1
金針菇子實體購自市場。巴斯德畢赤酵母GS115和質粒pPIC9購自美國 Invitrogen生命技術公司。限制性內切酶，質粒提取及DNA回收試劑盒以及相 關生化試劑均購自大連寶生物公司，引物由上海生工公司合成。
(1) 、編碼FIP-^e基因的克隆取0.5g干燥的菌絲體在液氮中研磨，加入 15mlDNA提取液，然后加入K+，從而有效的去除多糖，同時用酚、氯仿和異 戊醇抽提2次，最后得到并提取較純的基因組DNA， 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 其結果?？寺【幋aFIP-fve基因的引物設計為上游，5、-caga加catgtccgccacg tcg etc acc-3、， 下游，5、-ag gwaWc ggafcc tea agt ctt ctt cca etc agc國3、 PCR產物 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。根據GenBank中已登錄FIP-fVe蛋白序列
(Accession P80412)設計PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強重組免疫 蛋白的表達效率和準確性。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖電泳，出現了約350bp 的DNA片段，與設計堿基大小相符。
(2) 、重組巴斯德畢赤酵母表達載體的構建表達載體pPIC-9上可用的多 克隆位點很少，而NotI位點堿基在目的片段基因端點很難被酶切識別，所以用 單酶切連接，將克隆的目的基因與pPIC9分別用EcoRI酶切后16"連接，然后轉化至大腸桿菌中，挑取大腸桿菌轉化子，挑取單菌落提取質粒pPIC9-FIP-^e， 并用多組酶切檢測和測序，用基因本身和載體上都有的酶切位點Bamffl或Kpnl 鑒定構建結果為正確的重組子，獲得的正確表達載體。如圖1所示為表達重組 金針燕免疫調節蛋白載體的示意圖。
用酶切電泳方法獲得正確的重組表達載體后，為了更進一步的證明基因的 準確和載體構建的正確性，將重組質粒測序，以573，AOX為引物，結果與 GenBank中已登錄的FIP-fVe序列比對后，證明完全正確。
cgteg敏fca"敏cfc妙cC敏cg紹贈ccflac"cgcag妙cacc妙cgg敏gcagacc她aac"c "ccagtocaacaag欲gtofgg妙cgcggacaccaaaacg加carag做cgffgfc誠ccag"toccggcafl" cggagg贈acato(3fcgc妙g敏czagaagacf妙ggafccgafl"cc。 (3)、重組巴斯德畢赤酵母轉化子的獲得
將上述構建好的重組巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC9-FIP-^e用BglII酶切 線性化，采用電轉法將目的基因轉入酵母GS115中表達，含目的基因的線性質 粒DNA片段上有HIS密碼基因，而野生型的巴斯德畢赤酵母GS115不能合成 該基因，經轉化后的酵母菌液涂布于fflS缺失的選擇培養基MD上，28"C培養 3天長出酵母單克隆菌落，再分別挑至MM和MD培養基對比，鑒定表型。如 果在二者上酵母菌生長相似，菌落大小一樣，說明目的片段為單點插入整合， 表型為His+Mut+,如果在MD上生長的菌落大小明顯比MM上的要大，說明基因 片段為雙點替換整合，表型為His+Muf。獲得的金針燕FIP-fVe的酵母轉化子， 經過MM和MD培養后觀察結果，從表型上鑒定都為His+Muf型。
對巴斯德畢赤酵母轉化子的PCR進行鑒定，采用HIS選擇培養基初步鑒定 后，參照表達手冊方法提取轉化子酵母的總DNA。再用FIP-fVe基因的引物進 行PCR檢測，結果表明所有的酵母轉化子均為陽性結果，說明目的基因已經成 功轉入酵母GS115中。
9(4)、重組FIP-fVe的誘導表達和純化先選取正確的酵母轉化子之后，
i 、搖瓶發酵
挑取新鮮活化的Muts型酵母轉化子至50ml BMGY中，3(TC振搖過夜培養； 取500jil菌液至含有250ml BMGY的搖瓶中，3(TC振搖培養16-18h，至 OD600=2-6;
將菌液倒入滅菌離心管，4000rpm室溫離心5分鐘，收集酵母細胞； 無菌條件下將菌沉淀重懸浮于5-10倍體積的BMM中，放到含有500ml BMM培養基的搖瓶中繼續培養；
每隔24h，補加0.5% (v/v)甲醇，共誘導培養4天； 收集發酵液，12000rpm室溫離心5分鐘，保留上清； 將上清液放入6000透析袋中4。C透析，每2h更換蒸餾水，共5次； SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達。
ii 、重組FIP-fVe的5升發酵罐發酵
發酵罐為WKT-J-7D/0型發酵罐(江蘇綠揚電子集團威科特)；罐體總容積 5升；裝液系數75%;材質為不銹鋼；攪拌方式為平葉/斜葉；在位滅菌；溫度
控制在3(TC;轉速控制在200rpm，專用發酵軟件。
從新鮮YPD平板挑重組FIP-fVe酵母工程菌單菌落接種于10mLBMGY種 子培養基，3(TC振蕩培養至OD6。。為5-6;
轉接于400mLBMGY培養基中，3(TC振蕩培養至OD柳達6-8作為發酵菌
種；
按10M接種量轉入5L發酵罐的基礎培養基中，進行甲醇誘導發酵96h; 收集發酵液經6000卬m室溫25min離心，收集上清； 將上清液放入6000透析袋中4'C透析24h備用； SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達。
從圖2中可以看出，l為標準蛋白；2， 3為空白菌對照；4， 5， 6， 7， 8分 別為誘導培養2， 3， 4， 5， 6天的樣品；9為純化后的樣品，與野生型畢赤酵母相比，轉化酵母上清SDS-PAGE分析出現15-20kD的2個蛋白帶，所述的蛋白
帶與重組蛋白的不同修飾水平有關。樣品透析后電泳檢測，并取3等分50ml樣
品透析后SDS-PAGE電泳并用君意凝膠掃描和分析系統(JY04S-3C)粗略分析
目的蛋白產量，分析目的蛋白泳道和條帶，與蛋白marker做比對，分析系統自
動給出蛋白帶的OD值，換算重組FIP-fve的產量。搖瓶發酵的產量為158.2
mg/L， 5L發酵罐的產量為300 mg/L~350 mg/L。
以搖瓶發酵為例，計算目的蛋白方法為如上樣量為15pl，稀釋倍數為1.8 (50ml—卯ml)， Marker蛋白帶為0.5嗎，艮P: [(0.846+0.812+0.856+0.818+0.833+0.806)/3]/[(0.433+0.510)/2]x0.5xl.8/20=0.1582 pg/Vl，相當于158 .2mg/L。
iii、 超濾純化
離心收集后的酵母發酵液上清用PALL超濾系統5kD的濾膜對透析后的發 酵上清液進行超濾，加入蒸餾水，最終收集濾膜膜上濃縮液約100ml，整個過程 中更換冰袋放入濾液缸，保持4'C的低溫操作。
iv、 離子柱純化
取處理好的DEAE-Sephadex-A25凝膠，裝柱(2x20cm)，用pH8.0， 10mM
Tris，HCl磷酸緩沖液過夜平衡；
將濃縮的超濾發酵液12000rpm離心2分鐘，上清液上柱； 用pH 8.0、 10mM Tris'HCl緩沖液300ml過夜洗滌凝膠柱； 用0-0.4MNaCl的Tris，HCl緩沖液對凝膠柱進行線性離子梯度洗脫，洗脫流
速為40ml/h，每管收集10ml;
收集洗脫峰的洗脫液，透析后取微量用于SDS-PAGE電泳檢測結果，同時
檢測其血細胞凝集活性；
其余透析液低溫凍干備用。
由于FIP-fve的等電點為6.2，所以重組FIP-Re顯負性，進行DEAE-A25離子柱層析分離時，重組FIP-fVe被掛柱，然后用0-0.4M NaCl的Tris'HCl緩沖
液進行線性鹽濃度梯度洗脫，從層析圖看出，有小部分的雜蛋白在不同時間被 洗脫，但是目的蛋白的吸收峰明顯高，準確收集峰洗脫液，透析后樣品進行血 細胞凝集實驗表明其確實有活性。
v、 HPLC純化
取離子凝膠柱層析洗脫后的目的蛋白凍干樣溶于pH 8.0、 10mM Tris，HCl 磷酸緩沖液，調節樣品濃度為3mg/ml;
高效液相色譜純化采用日本SHIMADZU LC-10AVP系統，檢測器 SHIMADZU LC-10AVP，工作站CLASS-Vp，色譜柱TSK-GEL, G3000PWXL， 流動相為pH8.0、 10mM PBS磷酸緩沖液，流速為0.5ml/min，柱溫為4'C， 柱壓為1.6mpa;
對照收集的蛋白峰和記錄峰，結果有兩個活性峰出現，峰1量較大，峰2 較小，分別準確收集兩個峰的洗脫液，進行SDS-PAGE電泳和血細胞凝集活 性實驗檢測，確定1峰為目的蛋白；
嚴格收集第一活性峰，徹底透析，低溫凍干后得到重組免疫調節蛋白純 品，保存備用。
vi、 重組FIP-fve的純度測定
重組蛋白產量測定取15iil或2(^1發酵上清的透析液，SDS-PAGE凝膠 電泳后，用君意凝膠掃描和分析系統(JY04S-3C)分析和計算重組蛋白的產
純化的重組蛋白純度測試取高效液相純化后樣品，溶于pH8.0、 lOmM PBS中，調節濃度為l-2mg/ml。用BCA蛋白檢測試劑盒(PIERCE)檢測蛋白 純度，BSA作標準。分別取待測樣品和標準品0.1ml和2mlBCA工作液，混勻 后放置37'C， 30分鐘，于560nm下測定吸光值，以BSA制作標準曲線，以純 品BSA作對照和標準，得到的標準曲線為Y=0.0009X+0.0962 (R2=0.9668， P <0.001)， Y為吸收OD值，X為樣品蛋白濃度(嗎/ml)，代入平均OD (1.208)，
12最后計算出重組FIP-fVe的純度為92.4%。
對重組金針燕免疫調節蛋白進行理化特征檢測如下
一、 方法
1. 重組FIP-iVe的氨基酸分析 采取酸水解方法分析重組蛋白的氨基酸組分。準確稱量純化的重組
FIP-fvelOmg，溶于2ml 6M HCL，充分溶解后轉入到5ml水解管中，嚴密封口 后ll(TC水解反應20-24小時，吸出水解液至蒸發皿中，沸水浴蒸干驅盡HCL， 樣品送至吉林大學分析測試中心，在Agilent 1100型氨基酸自動分析儀分析氨基 酸組分。
2. 重組FIP-fVe的圓二色譜(CD)分析
重組FlP-^e的二級結構單元分析采用圓二色譜(CD)檢測。準確稱量1.3mg 純品重組蛋白，溶于lml滅菌4"C水中，然后稀釋10倍，調節最終蛋白終濃度 至10義10々M。樣品送至吉林大學分析測試中心，在J-810型圓二色譜儀上檢測 和記錄。分析結果數據用Origin 6.0軟件作圖，同時把測試結果的數據用Chen 和Yang的方法計算各二級結構單元含量。
3. 重組FIP-fVe的糖含量分析
用苯酚-硫酸法測定重組FlP-^e的可溶性中性糖含量。準確稱量1.5mg純品 重組FIP-fve，溶于lmlpH 8.0、 10mM PBS緩沖液，調節最終蛋白濃度為
0. 25mg/ml。取lml稀釋蛋白液至大試管(2xl5cm)中，用移液管準確加入6% 苯酚0.5ml，振蕩混勻后，延試管壁緩慢準確加入2.5ml濃硫酸，振蕩混勻后沸 水浴煮沸10分鐘，然后放置冷卻至室溫，在723型可見光分度計于490nm測定 每管OD值，平行做3管，取平均值。同時，取lml滅菌蒸餾水做負對照，lml 不同濃度葡萄糖(10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90和100pg/ml) PBS溶 液做正對照和標準。制作標準曲線，并計算重組FIP-^e的糖含量。
二、 結果
1. 重組FIP-fve氨基酸組分分析
13采取酸水解方法分析重組FIP-fVe蛋白的氨基酸組分。根據檢測結果，計算 各種測試氨基酸的重量百分比含量，與已發表的氨基酸組分進行比對，重組
FIP-fve和天然的氨基酸組分一致，證明重組FIP-fVe的正確性。
2. 重組FIP-fVe圓二色譜(CD)分析 功能蛋白的正確折疊對蛋白活性很關鍵，而FIP-fVe的二級結構的形成尤其
是a-螺旋對二聚體形成和生物活性至關重要。采用圓二色譜(CD)對重組FIP-fVe 的二級結構進行了測定，確定其形成二級結構單元和可能的正確折疊。用Yang 等人的方法，通過換算計算各二級結構單元的含量，重組FIP-fve的a-螺旋，(3-折疊和P-轉角的含量分別為11.3%， 34.3%和11.9%,相對比例為1: 3: 1，天 然的FIP-fVe三者比為3: 6: 1，和天然蛋白一樣具有相似的低含量oi-螺旋和較 多的(3-結構。
3. 重組FIP-fVe糖含量分析 重組FIP-fVe的糖含量用苯酚-硫酸方法測定，以純品葡萄糖作標準曲線，回
歸方程為Y=0.01553X+0.00518 (R2=0.923， P<0.01)， Y為490勤吸收值，X 為樣品糖濃度，然后代入重組FIP-fVe樣品，最后算出重組FIP-fve糖含量為1.2% 。 天然的FIP-fVe不含糖成分，而重組FlP-^e糖含量，說明用巴斯德畢赤酵母系 統表達的重組FIP-^e發生了糖基化修飾。重組FIP-fVe得到了一定的修飾，可 能使重組FIP-fVe得到正確的折疊從而具有生物活性。
對重組金針燕免疫調節蛋白免疫生理活性的檢測如下 一、方法
1. FITC熒光素標記蛋白和顯微鏡觀察
材料儀器異硫氰酸熒光素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte， FITC)，購自
吉爾生化(上海)；二甲基亞砜;碳酸鹽緩沖液(pH8-9.5);磷酸鹽緩沖液(PBS);
Desalting Hiprep 26/10脫鹽柱；AKTA purifier; IMDM細胞培養液(Hyclone)， 胎牛血清(FBS， Gibco)，日立分光光度計，激光掃描共聚焦顯微鏡80i(Nikon)。 熒光標記蛋白將純化的重組FIP-fVe (7.5mg'mr1) 20ml溶于碳酸鹽緩沖液(pH8.3)透析過夜，稱取3.75mgFITC，加入二甲亞砜(DMSO)3.75ml 配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小燒杯中先放入重組FIP-fVe溶液，加入 逐滴FITC-DMSO溶液，再用PBS加至30ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌4h， 用Desalting Hiprep 26/10脫鹽柱于AKTA purifier系統上除去游離熒光素，75ml PBS洗脫，280和495nm檢測，峰收集。將制備的FITC-重組FIP-fve (IO倍 稀釋)于220-520謡掃描，A495=0.445， A280=0.67，計算標記效率(F/P)為 3.80。
細胞培養將不同種類的細胞以2><106接種于24孔培養板中，每孔0.5ml， 以IMDM (2%FBS)培養液配制FITC-重組FlP-^e為lOOng.mr1,每孔0.5ml 孵育(37°C)，設空白對照組和24h實驗組。24h后取出細胞加入至1.5mlEP 管中，1000rpm離心，棄上清，以PBS清洗3次，洗凈重懸，制片。 細胞觀察于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，照相記錄。 2.促小鼠脾淋巴細胞增殖活性測定
采用MTT法測定重組FIP-Re對小鼠脾淋巴細胞的促分裂作用，所用抗生素， 重組FIP-^e樣，ConA， LPS和MTT都用0.22pm超濾膜過濾，-20°€:保存。
取4-6周無致敏環境下生長的Ba舊/C小鼠，斷頸處死小鼠，75%酒精浸泡3 分鐘，在超凈工作臺中無菌條件下取脾臟；
采用研磨法，用4-6層滅菌紗布，分離脾淋巴細胞；
用3ml RPMI1640培養液(不含BSA和雙抗)懸浮脾細胞，2000rpm離心2 分鐘；
小心吸取上清，重復上一步驟3-5次；
將脾細胞懸浮于lml配制好的RPMI1640培養液(含有10% BSA, 100U/ml 青霉素，100pg/ml鏈霉素)中，稀釋濃度至lxl(^細胞/ml;
在96孔培養板上每孔加入lOOpl脾淋巴細胞懸浮液，加入重組FlP-^e PBS 溶液(終濃度1, 2, 4， 8， 16和32嗎/ml)，重組FIP-fVe PBS溶液(終濃度10, 20, 40, 60, 80和100|ig/ml)，同時加pH7.2， lOmMPBS， ConA (終濃度5(ig/ml)和LPS (終濃度2pg/ml)分別做為負對照和正對照；
將培養板封口，放置于5%(302， 37。C培養箱中培養48-72小時，在顯微鏡下觀察細胞增殖效果；
沿培養板孔內壁小心加入20^ilMTT的PBS液，輕輕振蕩30秒混勻，繼續培養4-5小時；
小心吸取上清，盡量吸干細胞培養液，加入lOOpl 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10分鐘后，放入酶標儀(Model 680， Bio-Rad)，于570nm測定吸光值，記錄讀數，制作重組金針菇免疫調節蛋白促進小鼠脾細胞增殖反應-曲線柱狀圖，如圖4所示。
3.促細胞因子白介素IL-2和干擾素分泌活性測定
通過ELISA方法檢測重組FIP-fve促進小鼠脾淋巴細胞分泌白介素(IL-2)
和Y-干擾素的作用以測定其免疫調節活性。
BalB/C小鼠脾淋巴細胞懸浮液制備同上，最終稀釋于配制好的RPMI1640培養液(含有10。/oBSA， 100U/ml青霉素，100|ig/ml鏈霉素)中，稀釋濃度至lxl()7細胞/ml;
在96孔培養板加入lOOpl細胞懸浮液，lOO(il重組FIP-fVe液終工作濃度為1， 2, 4， 8, 16和32嗎/ml，同時加100^1 ConA (5pg/ml)和pH7.2， 10mM PBS做正負對照。每個樣品做2個平行 L。密封好后，輕輕震蕩混勻，放于5%(302，37"C培養箱中培養48小時；
吸出細胞培養液，2000rpm室溫離心5分鐘，收集上清。以下步驟用小鼠IL-2定量ELISA試劑盒操作；
加入100pl樣品上清，同時取標準品小鼠IL-2和干擾素，分別稀釋至終濃度為15.6， 31.2, 62.5, 125, 250, 500和1000 pg/ml作為正對照和制作標準，用PBS做負對照，加入100(il標準品和PBS，每個樣品做2個平行孔；
輕微震蕩混勻后，放于37"C培養箱中培養2小時，小心吸出上清液，用洗滌液每孔200W洗滌5次，倒置濾紙上盡量空干液體；每孔加入一抗5(V1，放于37'C培養箱中培養1小時，洗滌液洗板同上；
加入二抗(酶標抗體)10(^1，放于37"C培養箱中培養1小時，洗板同上。每孔加入底物工作液10(^1，放于37'C培養箱中暗反應IO分鐘，每孔加入
50|ll終止反應液；
將培養板放入酶標儀，于492nm測定吸光值，記錄讀數，制備標準曲線并計算樣品IL-2含量。
4. MTT法測定體外抗腫瘤活性
采用MTT方法和流式細胞術(FCM)測定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性。首先用MTT法粗測定重組FIP-fVe對人白血病細胞NB4和小鼠肉瘤細胞S-180的作用。
NB4和S-180細胞由吉林大學再生醫學所提供，在高糖DMEM中傳代培養后，測量細胞濃度直到其濃度為5xl()S細胞/ml;
在96孔培養板內每孔加入10(^1腫瘤細胞懸浮液，100pil重組蛋白樣品，重組FIP-fVe終濃度為1， 2， 4， 8， 16， 32， 64和128(ig/ml，同時加入5-氟尿嘧啶(5嗎/ml、 10嗎/ml)做正對照。每個樣品做3個平行孔；
混勻后，放于5%<:02， 37。C培養箱中培養12-72小時，每隔12小時顯微鏡觀察抗腫瘤結果；
24小時后，沿培養板孔內壁小心加入20(^1 MTT的PBS液，輕輕振蕩30秒混勻，繼續培養4-5小時；
小心吸取上清，盡量吸干細胞培養液，加入lOOjil 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10分鐘后，放入酶標儀(Model 680， Bio-Rad)，于570nm測定吸光值，記錄讀數。制作反應-曲線柱狀圖。計算重組FIP-fVe對腫瘤細胞的抑制率。
5. 流式細胞術(FCM)測定抗腫瘤活性
在用MTT法初步確定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性后，采用FCM法進一步準確測定重組FIP-fVe的抗腫瘤活性。
在5%(202， 37'C培養箱中用高糖DMEM培養液培養NB4細胞，使其生長至濃度為lxl(^細胞/ml;
在12孔培養板中每孔加入0.8ml腫瘤細胞懸浮液，加入0.2ml終濃度為8，16和32pg/ml的重組FIP-fVe，以正常生長的NB-4細胞做負對照，每個樣品濃度做2個平行孔。在5%002， 37t:培養箱中培養24小時；
用3000rpm室溫離心5分鐘，收集腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞的凋亡率用Annexin-V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒測定；
用pH7.2、 10mMPBS洗漆NB-4細胞，3000rpm室溫離心5分鐘，共2次，
確保最終收集細胞為1-5X105;
加入試劑盒內結合緩沖液500iLi1，混勻；再加入2^ilAnnexin-V-EGFP，混勻，最后加入5pl碘化丙啶(PI)，充分混勻；
室溫避光暗處反應10-15分鐘，在1個小時內送至流式細胞儀進行測試；
FCM采用488nm激發波長，530nm發射波長；Annexin-V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道(FL1), PI紅色熒光通過PI通道(FL3);
以未經PI和EGFP染色的正常生長的NB4細胞做純陰性對照，記錄所有被熒光標記的腫瘤細胞，同時計算誘導細胞凋亡率。
二、結果
1. 重組金針菇免疫調節蛋白一與細胞的相互作用
熒光顯微鏡下觀察，經FITC標記的重組FIP-fVe (6.25|ig/ml)與三種細胞(人外周血淋巴細胞HPBL，人胚腎細胞293T，人肺癌細胞A549)孵育24h后，細胞內綠色熒光都增強，標記蛋白大部分進入細胞內，未標記蛋白處理的細胞無綠色熒光，如圖3是本發明熒光標記FITC重組金針菇免疫調節蛋白與細胞的相互作用照片，結果表明重FIP-fve能夠進入這三種細胞內(正常細胞和腫瘤細胞)，進而發揮其生物學功能，對作用細胞沒有特異性選擇。
2. 促脾淋巴細胞增殖活性檢測
天然的FIP-fVe被證明可以促進小鼠脾淋巴細胞或者是人外周血淋巴細胞的增殖，用MTT法檢測重組FIP-^e在體外刺激小鼠淋巴細胞的增殖。結果表明，加入了重組FIP-fVe的小鼠脾淋巴細胞明顯數目增多，雖然比LPS作用弱相比， 但是在某些濃度時比ConA還要強，如圖4所述本發明重組金針菇免疫調節蛋白 促進小鼠脾細胞增殖柱狀圖，正常脾淋巴細胞作為負對照，LPS和ConA作為正 對照，重組FIP-,e濃度分別從10-320[ig/mL， (**)表示P〈0.01。重組FIP-fVe 在80嗎/mL時最大限度促進細胞增殖；而天然的FlP-^e在100pg/mL達到最有 效濃度，說明重組FIP-fVe和天然蛋白一樣具有促小鼠脾淋巴細胞增殖的功能。 另外，重組FIP-^e還和ConA共同作用刺激小鼠淋巴細胞增殖，其最有效濃度 為8|iig/mL，說明重組FIP-fve主要是針對T型淋巴細胞起作用。
3. 促白介素-2和Y-干擾素分泌活性檢測
以前的研究報道指出FIP-fVe可以在體內或體外誘導小鼠脾淋巴細胞和人血 淋巴細胞分泌產生多種細胞因子，該活性與FIP-^e的免疫調節和抗腫瘤功能密 切相關。測定了重組FlP-^e促細胞增殖活性后又用ELISA方法檢測了其增強小 鼠脾淋巴細胞分泌細胞白介素2(IL-2)和Y-干擾素的能力。結果表明重組FIP-^e 明顯的增強了小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2和Y-干擾素的水平，如圖5是本發明自 重組金針燕免疫調節蛋白誘導小鼠淋巴細胞分泌白介素-2和Y-千擾素柱狀圖， 以已知的PBS和ConA分別作為負對照和正對照，重組FIP-fVe的濃度從 l-16pg/mL， ConA誘導水平為1032.8 pg/ml，與已發表的結論一致。重組FIP-fVe 在16， 8和4pg/mL時誘導IL-2分泌水平為618， 430和316 pg/ml，而來自昆蟲 細胞表達的重組FlP-^e在15， 10和5pg/mL時誘導IL-2水平分別為668， 503 和349pg/ml，這說明從巴斯德畢赤酵母中表達的重組FIP-fVe具有和天然蛋白以 及昆蟲細胞表達的重組FIP-fVe相似的增強IL-2胞因子分泌水平的活性。
4. 體外抗腫瘤活性檢測
用MTT法測定重組FIP-fVe對白血病細胞NB-4和小鼠肉瘤細胞S-180的抑 制作用，結果發現重組FIP-fVe對NB-4和S-180有明顯的抑制作用，在濃度為 8呢/ml時最大抑制率為38.5%。顯微鏡下觀察到加入重組FIP-fve的細胞明顯有 聚集和破裂現象，說明重組蛋白誘導癌細胞NB-4和S-180的死亡，如圖6是本
19發明重組金針菇免疫調節蛋白誘導腫瘤細胞NB4凋亡顯微鏡觀察圖片，顯微鏡
(20x16)下觀察正常NB-4細胞和重組FIP-fVe誘導死亡的癌細胞；圖7是本發 明重組金針菇免疫調節蛋白誘導腫瘤細胞NB4凋亡的流式細胞儀記錄圖，a為 正常生長的NB-4細胞作為負對照。B、 c、 d表示不同濃度重組FIP-^e (64、 32 和16pg/ml)誘導NB-4細胞凋亡結果。Bl: I染色的癌細胞，機械和自然死亡 的細胞；B2:被PI和EGFP雙染色的癌細胞，表示正常死亡和誘導凋亡的細胞； B3:不被染色的細胞，即活的癌細胞；B4:被EGFP染色的細胞，即被誘導凋 亡的癌細胞。
為了進一步更準確的檢測其抗腫瘤活性，用流式細胞術檢測重組FlP-^e誘 導NB-4細胞凋亡。結果可以看出，作為負對照的正常生長的NB-4細胞的活細 胞占62.3%，而加入了重組FIP-fVe的NB-4活細胞比例分明下降到54.8， 43.1 和48.8%;另夕卜，凋亡的NB-4細胞的比例明顯增加，由正常的17.3%增加到 32.4%，表明重組FIP-fve具有明顯的誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
重組金針菇免疫調節蛋白免疫制劑的應用
1、 重組FIP七e用于提高免疫力的保健口服液以重組FIP-fve為活性劑， 有效含量為200mg/L，制備口服液，具體用法成人每日兩次、每次服用20mL， 對化療后病人用藥2—3周就有提高人體免疫力功效，特別是具有升高白細胞的 功效。
2、 重組FIP-We治療過敏癥藥物以重組FlP-^e為活性劑，有效濃度35 %，制成外用噴劑鼻腔噴入給藥，成人每次每鼻孔2—3撳，每日三次、使用1 一3就有預防和治療過敏性鼻炎的作用。
3、 重組FIP-^e升高白細胞治療制劑以重組FIP-fVe為活性劑，有效含量 為200mg/Kg，制成口服藥物和非腸道藥物，具體用法成人每日三次、每次服 用20mg，用于各種原因引發的白細胞減少癥的治療。
4、 重組FIP-^e作為艾滋病藥物或疫苗佐劑以重組FIP-fVe為活性齊U，有 效濃度60%，制成防治和治療艾滋病的免疫藥物或疫苗佐劑，重組FIP-fVe和艾
20滋病病毒都作用于T淋巴細胞，但效果拮抗。艾滋病病毒通過受感染的T細胞 在死亡前產生病毒粒子來慢慢損耗健康的白細胞，造成機體免疫力低下。而
FIP-fve主要作用于T淋巴細胞，促進其增殖和分泌細胞因子，提高免疫力。 FIP-fve能有效地抵抗和防御艾滋病病毒對T淋巴細胞的侵害和對免疫系統的破 壞。
5、重組FIP-fVe作為抗腫瘤藥物以重組FIP-fve為活性劑，有效含量為300 mg/Kg，制成口服藥物和非腸道藥物用于腫瘤的治療，特別是用于淋巴系統腫瘤 的治療。具體用法成人每日三次、每次服用20mg。重組FIP-fVe可以通過誘 導免疫細胞分泌Y-干擾素，白介素-2和腫瘤壞死因子等，并且可以誘導腫瘤細 胞凋亡，達到直接或間接殺傷腫瘤細胞，提高機體免疫力的目的。
權利要求
1、重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)、編碼FIP-fve基因的克隆取干燥金針菇菌絲體在液氮研磨后，加入DNA提取液，獲得基因組DNA，根據GenBank中已登錄FIP-fve蛋白質序列(Accession P80412)設計PCR引物，在引物上游加入ATG以便增強重組免疫蛋白的表達效率和準確性；(2)、重組巴斯德畢赤酵母表達載體的構建將克隆的目的基因與載體pPIC9一起經過酶切，回收和連接，然后轉化至大腸桿菌中，提取質粒pPIC9-FIP-fve；(3)、重組巴斯德畢赤酵母轉化子的獲得將上述構建好的重組酵母表達載體pPIC9-FIP-fve用BglII酶切線性化，采用電轉法將目的基因轉入酵母GS115中表達，經轉化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的選擇培養基MD上，28℃至少培養3天分別挑至MM和MD培養基對比，提取轉化子酵母的總DNA；(4)、重組FIP-fve的誘導表達和純化選取正確的酵母轉化子，首先用搖瓶500-1000ml振搖培養誘導重組蛋白表達，確定其有表達后，挑選其中表達量高的酵母菌進行5L發酵罐大量培養，發酵上清經透析后SDS-PAGE檢測，并用君意凝膠分析系統測定目的蛋白產量，搖瓶發酵的產量至少為158.2mg/L，5L發酵罐的產量至少為300mg/L～350mg/L，樣品進一步通過超濾系統超濾濃縮，4℃的低溫透析后用血細胞凝集實驗確定其活性，并進行DEAE-A25離子柱層析純化，再進一步用高效液相色譜進行純化，收集具有生理學活性的目的蛋白，最后檢測重組FIP-fve的純度。
2、 根據權利要求l所述重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法，其特征在于 步驟(1)所述的設計PCR弓I物為上游，5、-ca gaattc atg tcc gcc acg tcg etc acc-3、； 下游，5、- ag gaattc ggatcc tea agt ctt ctt cca etc age -3、。
3、 所述重組金針燕免疫調節蛋白在免疫制劑中的應用。
全文摘要
本發明公開一種使用巴斯德畢赤酵母進行表達的重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法及應用。包括下述步驟(1)編碼FIP-fve基因的克隆；(2)重組巴斯德畢赤酵母表達載體的構建；(3)重組巴斯德畢赤酵母轉化子的獲得；(4)重組FIP-fve的誘導表達和純化。本發明通過克隆編碼金針菇免疫調節蛋白，構建巴斯德畢赤酵母表達載體，獲得大量高產率和高純度的重組金針菇免疫調節蛋白，5升發酵工藝獲得的重組蛋白產量達300mg/L～350mg/L，純度達90％以上，經純化后檢測其生物學特點和免疫生理活性與天然金針菇免疫調節蛋白相同，具有凝血活性，促進小鼠淋巴細胞增殖及分泌白介素和干擾素的功能，并能誘導腫瘤細胞凋亡。
文檔編號C12N15/81GK101487020SQ20091001057
公開日2009年7月22日 申請日期2009年3月5日 優先權日2009年3月5日
發明者劉立俠, 非 孫, 韌 張, 林景衛, 許守民 申請人:劉立俠