專利名稱：：食品中常見彎曲菌檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及病原微生物的檢測方法，尤其涉及食品中致病性彎曲菌屬微生物的mPCR-DHPLC檢測方法，同時還涉及檢測所用的組合物，即試劑盒。
背景技術：
：彎曲菌感染是一種人畜共患病，在世界各地均有發生，可引起人類急性腸炎、格林巴利綜合癥、反應性關節炎、Reiter，s綜合癥等多種疾病。本屬的兩個耐熱禾中(決ermo//w7/ccamp少/oZ)acter):空月湯彎曲菌(y'^/wm')禾口結腸彎曲菌(C"m/^/oZ^"w//)，幾乎可從所有彎曲桿菌臨床感染的病例中分離。嗜熱彎曲菌屬細菌，尤其是空腸彎曲菌被認為是人類細菌性腹瀉的主要病原菌。在新西蘭和美國，由空腸彎曲菌引發的食源性細菌感染在一定范圍內已經超過了沙門氏菌和志賀氏菌。動物(特別是家禽)是該菌的主要寄主，另外生牛奶、未經加工的肉制品和未經處理的水也是主要載體。彎曲菌不易在食物中生長，但是引起發病的感染劑量卻很低，大約攝入400500個菌體就可引發腸道感染，這對禽類產品安全和人類健康造成了嚴重的威脅。國內針對食品微生物中沙門氏菌、單增李氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌等的分子生物學檢測技術研究較為深入和廣泛，但針對彎曲菌的快速、高通量、分型檢測技術研究則所見報道甚少。目前許多發達國家已對食品中的彎曲菌建立起較為完善的監測和控制體系，而我國相關調查報道較少。目前，對食品中常見彎曲菌的檢測最主要的方法就是選擇性富集培養，但是由于該菌在樣品中的數量極少，并且生長條件要求苛刻，因此很難從樣品中檢出。近來的研究發現，在一些特定的條件下，彎曲菌還存在著一種"存在但不可培養"的狀態，這更是傳統分離培養檢測方法無法克服的難題。因此，建立一種高效、快捷、高通量的致瀉性大腸埃希氏菌分型鑒定技術是食品安全所面臨的急需解決的問題。變性高效液相色譜(DHPLC)采用離子對反相高效液相色譜的原理，是通過使用特殊的耐高溫液相色譜分離柱同時采用溫度調控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離的方法，因此，也有人稱該技術為溫度調控離子對反相高效液相色譜。該技術的發明為生命科學領域里的核酸分析提供了方便實用的技術平臺。其快速高通量、全自動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優點使其在核酸分析中具有無可替代的優勢。DHPLC技術檢測微生物是很好的培養不依賴的混合微生物樣本的分析平臺，不僅能鑒定常見的微生物，還能鑒定不常見的，苛刻的，和厭氧的細菌。該技術在已知和未知基因突變的檢測和篩選、基因分型、基因定量和長度多態性分析等領域已經得到廣泛應用。基于此，本發明人試圖建立利用DHPLC的高效、快捷、簡便的適宜臨床檢測應用的特異而靈敏的食品中常見彎曲菌的檢測方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種用于靈敏快捷地檢測樣品、尤其是檢測食品中常見彎曲菌，以判定待檢樣品是否受到污染的試劑盒及其檢測方法。首先，本發明所述的食品中常見彎曲菌檢測試劑盒是lmL檢測溶液含10mMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U即5U/|iL及四種常見彎曲菌引物對各10pM、。其中，待檢測彎曲菌屬微生物的特異性引物序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')空腸彎曲菌GATATGTATGATTTTATCTTGCGAATGAAATTTTAGAATGGGG結腸彎曲菌CCACCTGTAATCACTCCTAATACCGCCCAGATTGTTAAAGATGCTC紅嘴鷗彎曲菌GACCGCTTCCAAGACTTACTTCCCAGACCCTCGCATCACC胚胎彎曲菌GCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG(C畫"/o6ac妙^加)TGCAGCGGCCCCACCTAT本發明還提供了利用上述試劑盒檢測食品中常見彎曲菌的檢測方法，包括如下步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min進入循環94r變性60s，56。C退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱溫50°C;流動相(體積比):0.0min，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;2.4min，44.2%緩沖溶液A，55.8%緩沖溶液B;4.3min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;6.1min，38.8%緩沖溶液A，61.2%緩沖溶液B;8min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5pL。檢測結束后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定樣品的染菌情況。檢測過程中可以分別設陽性對照和陰性對照。陽性對照為擴增片段的陽性克隆分子DNA或陽性齒株DNA，陰性對照為非目標致病菌DNA。陰性對照在上述DHPLC分析條件下，無吸收峰出現；陽性對照在上述DHPLC分析條件下，空腸彎曲菌在約3.8min出現PCR產物吸收峰；結腸彎曲菌在約4.2min出現PCR產物吸收峰；紅嘴區鳥彎曲菌在約4.5min出現PCR產物吸收峰；胚胎彎曲菌在約8.7min出現PCR產物吸收峰。且以上典型的PCR產物吸收峰值大于2mV;在上述DHPLC分析條件下，約3.8min出現PCR產物吸收峰，為空腸彎曲齒；約4.2min出現PCR產物吸收峰，為結腸彎曲菌；約4.5min出現PCR產物吸收峰，為紅嘴鷗彎曲菌；約8.7min出現PCR產物吸收峰，為胚胎彎曲菌。若在與陽性對照相同的出峰時間，檢測樣品無擴增吸收峰出現，可判定樣品結果為陰性，直接報告未檢出相對應的致病菌。本發明采用多重PCR結合變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)技術，針對食品中4類常見的彎曲菌建立靈敏便捷的檢測方法，并在此基礎上，建立食品中常見彎曲菌快速檢測試劑盒。本方法采用彎曲菌的毒力因子基因檢測，可以在檢測出彎曲菌的同時進行四種類型的區分；檢測時間僅1.5天，比傳統微生物學方法檢測時間大為縮短；檢測限低于15cfu/mL,只要每毫升菌液里各彎曲菌數不低于15個即可檢出。并且本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。本發明附圖5幅，均為實施例的種間特異性試驗結果圖，其中圖1是本發明方法的種間特異性試驗中空腸彎曲菌的檢測圖譜；圖2是本發明方法的種間特異性試驗中結腸彎曲菌的檢測圖譜；圖3是本發明方法的種間特異性試驗中紅嘴鷗彎曲菌的檢測圖譜；圖4是本發明方法的種間特異性試驗中胚胎彎曲菌的檢測圖譜；圖5是四種彎曲菌的mPCR-DHPLC檢測結果；上述附圖中，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。其中，1.空腸彎曲菌基因組DNAATCC33560D-5;2.空腸彎曲菌ATCC33291;3.結腸彎曲菌基因組DNAATCCBAA-1061D;4.結腸彎曲菌ATCC43478;5.紅嘴鷗彎曲菌基因組DNAATCCBAA-1060D;6.紅嘴區鳥彎曲菌ATCCBAA-1060;7.胚胎彎曲菌ATCC27374;8.胚胎彎曲菌ATCC43478;9.福氏志賀氏菌ATCC12022;10.腸致病性大腸桿菌ATCC43887;11.弗勞地檸檬酸桿菌ATCC8090;12.腸炎沙門氏菌ATCC13076;13.小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC9610上述附圖中，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發明的內容。若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源為細菌基因組DNA小量純化試劑盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)、Taq酶及PCR緩沖液等試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；彎曲菌培養基(CampylobacterAgarBase)購自美國BD公司；布氏肉湯購自北京陸橋技術責任有限公司；全自動細菌培養系統MART-II(MartMicrobiologyB.V.公司，荷蘭)；普通PCR儀PE24000(PerkinElmer公司，美國)；變性高效液相色譜儀NAV-99-4500(Transgenomic公司，美國)；高速離心機centriflige5804(Eppendorf公司，德國)。本部分內容涉及的標準菌株及標準菌株基因組DNA分別購自美國ATCC標準生物品收藏中心和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)，詳見表l。使用前，取表l中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立模板庫供本部分實施例試驗使用。彎曲菌屬的菌株在彎曲菌選擇性培養基上，于42X:微需氧環境下(5%氧氣、10%一氧化碳和85%氮氣)培養24h。其他的菌株在胰蛋白大豆瓊脂(TSA)上，于37。C培養24h。表1序號中文名稱拉丁學名菌株號1空腸彎曲菌C"，y/。力w/ersupsp.m'ATCC332912空腸彎曲菌基因組DNAC證/盧Z)"c欣勿'臓'supsp.勿'畫'genomicDNAATCC33560D-53結腸彎曲菌ATCC434784結腸彎曲菌基因組DNAC調^y/c^"e/erco//genomicDNAATCCBAA-薩D胚胎彎曲菌Cjy/oZ)"c^#船supsp.fewsATCC273746紅嘴鷗彎曲菌基因組DNAC"m/y/oZ^c^/an'genomicDNAATCCBAA-1060D腸致病性大腸桿菌EnteropathogenicOl11:nmATCC438878腸產毒性大腸桿齒Enterotoxigenic五.co//078:H11ATCC354019腸出血性大腸桿菌Enterohemorrhagic五.co//Ol57:H7ATCC3515010腸侵襲性大腸桿菌Enteroinvasive0124:nmATCC4389311大腸桿菌ATCC2592212大腸桿菌ATCC837913火腸桿菌ATCC1177514鼠傷寒沙門氏菌ATCC4941615豬霍亂沙門氏菌ATCC1070816腸炎沙門氏菌ATCC1307617弗勞地檸檬酸桿菌ATCC809018福氏志賀氏菌ATCC1202219奇異變形桿菌ATCC2924520普通變形桿菌CMCC4902721小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC961022金黃色葡萄球菌5^//y/ococeusa廳船ATCC4944423單增利斯特氏菌ATCC1911124創傷弧菌糊"》ra/"訴c'wA'ATCC2756225擬態弧菌ATCC3365326嗜水氣單胞菌ATCC796627類志賀鄰單胞菌ATCC1403028銅綠假單胞菌ATCC2785329阪崎腸桿菌ATCC51329實施例l、食品中常見彎曲菌的檢測試劑盒及其檢測方法的建立本實施例確定用于檢測的目的基因及其引物如下表(表2)所示_表2_菌株目的基因上、下游引物序列(5'-3')產物大小bp空腸彎曲菌g一GATATGTATGATTTTATCTTGC159GAATGAAATTTTAGAATGGGG結腸彎曲菌CCACCTGTAATCACTCCTAATACC173GCCCAGATTGTTAAAGATGCTC紅嘴鷗彎曲菌GACCGCTTCCAAGACTTACTTC197CCAGACCCTCGCATCACC胚胎彎曲菌■rapGCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG435TGCAGCGGCCCCACCTAT在此基礎上，設計用于PCR擴增的食品中常見彎曲菌檢測試劑盒lmL檢測溶液含10mMTris'Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾口dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U爾L及上述表2中四種常見彎曲菌引物對各10nM、；使用該試劑盒檢測樣品中的彎曲菌的PCR-DHPLC方法包括如下步驟①待檢樣品的制備a.食品樣品將10g采集樣品加入90mL布氏肉湯中，42。C微需氧條件下(5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)培養24h。使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。b.純化菌株樣品挑取單個菌落于布氏肉湯中，42'C微需氧條件下(5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)培養24h。使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。②取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總休積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱溫50°C;流動相(體積比)O.Omin，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8°/。緩沖溶液B;2.4min，44.2%緩沖溶液A，55.8%緩沖溶液B;4.3min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;6.1min，38.8%緩沖溶液A，61.2%緩沖溶液B;8min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液8;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5pL。檢測結束后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定測定結果。需要說明的是對于mPCR-DHPLC結果的判斷需要結合陽性對照和陰性對照來進行。將待測樣品的mPCR-DHPLC檢測譜圖與陰性對照及陽性對照的mPCR-DHPLC檢測譜圖比較，當陰性對照無任何特異性吸收峰出現，而陽性對照出現位置正確的特異性吸收峰時，若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，且峰高>2mV時，判定為陽性；若被檢樣品在該位置無特異性吸收峰，則判定為陰性；若被檢樣品在與陽性擴增的同一位置上出現特異性吸收峰，但峰高〈mV時，則為可疑樣品，需要通過國標方法或其他方法進行確認。實施例2、特異性試驗取表1中所列試驗菌種，經培養后分別提取基因組DNA，建立一個模板庫。然后以這些基因組DNA為模板，按照上述條件及方法進行mPCR-DHPLC分析檢測。4種不同類型的彎曲菌DHPLC特異性檢測圖譜如附圖14所示，箭頭所指的峰型為各待檢測彎曲齒的特異性吸收峰。從圖示結果可以看出a.2個空腸彎曲菌全部擴增出了目的基岡片段，而其他非空腸彎曲菌株則全部為陰性結果(附圖1);b.2個結腸彎曲菌全部擴增出了cA目的基岡片段，而其他非結腸彎曲齒則全部為陰性結果(附圖2);c.1株紅嘴鷗彎曲菌擴增出了cA目的基閑片段，而其他非紅嘴瞎彎曲菌則全部為陰性結果(附圖3);d.l株胚胎彎曲菌擴增得到^^目的基閑片段，其余非胚胎彎曲菌全部為陰性結果(附圖4)。上述結果表明本試驗設計的4種引物適用于PCR-DHPLC檢測彎曲菌，具有很好的種間特異性。實施例3、靈敏度試驗將ATCC購得的①空腸彎曲菌基因組DNA(ATCC33560D-5)5嗎凍干粉、②結腸彎曲菌基因組DNA(ATCCBAA-1061D)10pg、③紅嘴區鳥彎曲菌基因組DNA(ATCCBAA-1060D)10嗎用TE緩沖液溶解并進行10倍梯度稀釋，濃度分別為10ng/|iL，lng:L，100pg爾L，10pg/pL禾卩1pg爾L。將胚胎彎曲菌(ATCC27374)基因組DNA用分光光度計測定濃度后，調整為10ng^iL，1ng/^iL，100pg/|iL，10pg/)iL禾口lp,。不同濃度的模板經多重PCR反應，用DHPLC進行檢測。在模板DNA濃度分別為空腸彎曲菌10pg/pL、結腸彎曲菌1pg/pL、紅嘴鷗彎曲菌1pg爾L和胚胎彎曲菌100pg&L時仍可檢測到特異性吸收峰。表3為在基因組水平上檢測各彎曲菌的靈敏度。表3^\編濃\^號度\^空腸彎曲菌基因組DNAATCC33560D-5結腸彎曲菌基因組DNAATCCBAA-薩D紅嘴鷗彎曲菌基因組DNAATCCBAA-1060D胚胎彎曲齒ATCC27374基因組DNA10ng/nL++++1ng/pL++++100pg/pL++++10pg/^iL+++-1pg爾L-++-測量的DHPLC譜圖如附圖5所示。由該結果還可以看出四種常見彎曲菌的mPCR-DHPLC行為具有明顯的差異，使用實施例1所建立的試劑盒及檢測方法可以在一次檢測中非常有效地將染菌樣品中的這四種菌區分識別。實施例4、人工污染樣品靈敏度將含菌量分別為1.5x105、1.5x104、1.5x103、1.5x102、1.5x101、1.5x10°的模擬污染樣品置卯mL布氏肉湯中，42t:微需氧條件下培養24h。每個梯度培養液采用試劑盒提取法(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)制備模板DNA，進行PCR-DHPLC檢測。各彎曲菌的檢測限如表4。即當最初模擬樣品中含有1.5個空腸彎曲菌、1.5個結腸彎曲菌、1.5個紅嘴鷗彎曲菌或15個胚胎彎曲菌時，經42X:微需氧條件下培養24h可被檢出。表4雙^<空腸彎曲菌ATCC33291結腸彎曲菌ATCC43478紅嘴鴟彎曲菌ATCCBAA-1060胚胎彎曲菌ATCC27374++++1.5xl04++++1.5x103++++1.5xl02++++1.5xl01+++1.5xlOe+++-實施例5、食品檢測試驗采用本實施例所述的mPCR-DHPLC方法和國家標準方法(GB/T4789.9-2003)和行業標準方法(SN/T0175-92)對隨機采集的172份冷凍雞肉類樣品進行同時檢測。其中本發明的mPCR-DHPLC的前增菌方法為將10g采集樣品加入90mL彎曲菌液體增菌培養基中，42。C微需氧條件下(5。/。氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)培養24h。經統計，用本發明的mPCR-DHPLC方法檢出18株空腸彎曲齒，7株結腸彎曲菌。采用國家和行業標準方法檢出4株空腸彎曲菌，l株結腸彎曲菌。對其余本發明的mPCR-DHPLC檢出為陽性，而標準方法檢出為陰性的樣品，采用增加篩選可疑菌株數量，利用免疫學分析試劑條(VIDAS)和快速生化鑒定(API)等多種確認方法，均證實為陽性結果。彎曲菌采用PCR-DHPLC和GB/SN兩種方法檢測結果的比較見表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>該試驗中，本發明的mPCR-DHPLC方法檢出率高于傳統國家標準方法的檢測結果。可能是因為傳統檢測方法對于處于不可培養狀態的彎曲菌不具有檢測能力，故未能如實反映樣品中彎曲菌的實際污染狀兄而本發明的mPCR-DHPLC方法對于處于不可培養狀態的彎曲菌同樣具有檢測的能力，這將有助于對冷凍食品中彎曲菌的污染狀況進行檢測監測。權利要求1、食品中常見彎曲菌檢測試劑盒，其特征在于1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四種常見彎曲菌引物對各10μM；其中，待檢測彎曲菌屬微生物的特異性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2、食品中常見彎曲菌的檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑盒，包括下述步驟①取lul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul;5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，56'C退火60s，72"C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3jim;柱溫50°C;流動相(體積比):0.0min，55.0%緩沖溶液A，45.0%緩沖溶液B;`0.5min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B;2.4min，44.2%緩沖溶液A，55.8%緩沖溶液B;4.3min，40.9%緩沖溶液A，59.1%緩沖溶液B;`6.1min，38.8%緩沖溶液A，61.2%緩沖溶液B;8min，37.3%緩沖溶液A，62.7%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器(光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s);上樣量PCR產物5fiL。全文摘要一種用于食品微生物污染檢測及監控的食品中常見彎曲菌檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒中，1mL檢測溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四種常見彎曲菌引物對各10μM；本方法采用彎曲菌的毒力因子基因檢測，可以在檢測出彎曲菌的同時進行四種類型的區分；檢測時間僅1.5天，比傳統微生物學方法檢測時間大為縮短；檢測限低于15cfu/mL，只要每毫升菌液里各彎曲菌數不低于15個即可檢出。并且本方法檢側時間比傳統方法短，方法更加簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。文檔編號C12Q1/68GK101624625SQ20091001079公開日2010年1月13日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者徐君怡,曹際娟申請人:徐君怡;曹際娟