專利名稱：滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法
技術領域：
本發明涉及綠潮生物檢測與監測研究，具體地說是一種滸苔微世代的熒光原位雜 交檢測方法。
背景技術：
基于分子基礎(核酸、蛋白、糖蛋白)的檢測方法較傳統檢測方法有很大的優勢， 種類鑒定更為準確可靠，并能夠提供定量信息，可以檢測較低豐度的目標微藻種類(大型 藻類的微型世代)，使之能在常規監測中使用。由于rRNA基因ITS區的異質性，使得其在各 類生物屬、種間表現出明顯的差異。國際上通常采用ITS區作為各種生物類群屬種間分類 和系統研究的區域，也是設計探針的首選區域。相對而言，兩者之間的轉錄間隔區ITS區， 為高變的區域，為生物各類群屬下水平的研究提供較多的信息，是國際上公認的生物各類 群屬下種間水平研究的一個很好的比較指標，在動植物的分子分類中已得到廣泛的使用， 在藻類分子鑒定中也已被采用。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種非放射性 原位雜交方法，它采用特殊熒光素標記核酸(DNA)探針，對檢測細胞內DNA或RNA的特定序 列存在與否最為有效。這一技術可以在保持細胞形態完整性的條件下，檢測到細胞內的核 酸序列。FISH技術的基本過程是利用熒光標記的探針在細胞內與特異性互補的核酸序列 雜交。通過激發雜交探針的熒光來檢測信號，從而檢測相應的核苷酸序列。該技術主要的 步驟包括1)樣品的固定；2)樣品的制備和預處理；3)預雜交；4)探針和樣品變性；5)用 不同的探針雜交來檢測不同的靶序列；6)漂洗去除未結合的探針；7)檢測雜交信號，進行 結果分析。其關鍵環節在熒光染料的選擇、雜交過程和雜交后檢測(Miller et al. , 1998 ； Groben et al.，2005)。FISH技術通常采用的熒光染料是熒光素衍生物(FITC，FluoX)、羅 丹明衍生物(TRITC，TeXaSRed)和吲哚二羧箐(Cy3、Cy5)等，由于吲哚二羧箐具有顯著的亮 度和光熄滅穩定性，因此具有較好的應用前景。2007年和2008年，我國黃海中部連續兩年爆發滸苔(Enteromorphaprolifera)綠 潮。2008年6月初，黃海中南部海域出現歷史罕見的大規模的滸苔綠潮現象，并逐漸向青島 近海海域漂移，滸苔綠潮持續時間長、規模大，嚴重影響到奧帆賽比賽海域環境質量和青島 市區沿海一線景觀。由此可見，我國沿海不僅成為中國赤潮發生的重災區，而且已經成為以 大型綠藻滸苔(Enteromorpha prolifera)為代表的綠潮的重災區，對赤潮、綠潮，特別是綠 潮微世代等生物的準確鑒定、快速檢測和預警預報已成為當前赤潮和綠潮研究領域的熱點 問題，并具有重要的理論和實際意義。針對傳統監測方法的困難和限制，國外科學家們已致力于發展各種特異性分子探 針來檢測各種赤潮類群，使目標赤潮生物能通過光學或化學的手段檢測出來，實現快速且 準確地鑒定、計數目標綠潮種類，從而確定赤潮的生物量、分布情況，達到準確檢測預報綠 潮的目的。迄今為止，分子探針技術在赤潮生物檢測與監測研究在國際上得到了迅速發展， 而針對綠潮的相關研究卻特別少，特別是針對滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代，即越冬種子庫(propagule bank)形式的熒光原位雜交技術還未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種快速、準確的滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法； 它可實現快速且準確地鑒定、計數滸苔，從而確定其生物量、分布情況，達到準確檢測預報 的目的。為實現上述目的，本發明采用的技術為滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法，用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代 的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5， -GCCCGCCGTTTACAGGAT-3，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，3) 5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，4) 5，-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3，于它們的5’端采用FITC標記的辦法。用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代的寡核苷酸探針最好為如下2種探針之 一或二種，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，，3) 5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，。原位雜交的具體過程為1)樣品的制備和預處理將現場海水水體樣品進行濃縮后，對藻的自發熒光進行固定、脫色用離心管于 5000g/min離心樣品5min，加入乙醇至終體積濃度1 %固定，靜置1_2小時，得濃縮脫色后的 樣品，上帶有聚碳酸酯膜的過濾器上過濾，使細胞留在聚碳酸酯膜上；分別采用1XPBS和 雜交緩沖液過濾清洗濾膜；2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入雜交緩沖液和熒光探針，使探針終濃度 達到5-lOng/ii L ；將玻片置于溫濕的暗處46-50°C雜交2_3h ；3)漂洗去除未結合的探針用預熱至50°C的1XSET的雜交清洗液浸泡洗滌濾膜 來終止雜交反應，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；4)檢測雜交信號，進行結果分析加入封片劑和終濃度為1 P g/mL DNA標記物DAPI的混合液，復染并防止熒光淬 滅。蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。雜交后的藻細胞以熒光顯微鏡觀察雜交 效果，并記錄陽性標記率；觀察FITC熒光標記的藻細胞時應用450-490nm的激發光波長、 510-520nm發射光波長的濾光片組合觀察，觀察確認水樣中存在的滸苔微世代。所述海水水體樣品采集后用篩絹過濾濃縮；所述雜交緩沖液的組成為0. 9M NaCl, 20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v) Nonidet-P40, 20% (v/v)甲酰胺。本發明的整體思路1、探針的設計和制作將所獲得的滸苔ITS序列(參見序列的數據庫網站http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/sites/gquery,登陸序列號為FJ026732)與從GeneBank和EMBL等核酸數據庫種獲得的石莼屬所有的株系的ITS序列，應用Clustal X(自由軟件)對序列進行排序，并手動精 減排列結果，確定針對目標藻分類水平的特異性序列；然后通過數據庫(GeneBank和EMBL) 的BLAST N接口對這些排列結果進行篩選。篩選后得到的特異性序列用于設計合適的探針。FISH技術通常采用的熒光染料是熒光素衍生物(FITC，FluoX)、羅丹明衍生物 (TRITC，Texas Red)和吲哚二羧箐(Cy3、Cy5)等，由于吲哚二羧箐具有顯著的亮度和光熄 滅穩定性，因此具有較好的應用前景。常用的熒光標記染料如表1所示；表1常用的FISH熒光染料 2、樣品的獲得1)水體中樣品的獲得用采水器采集5-10L海水，用10 ii m篩絹過濾濃縮，將水體積縮小為100-200mL。2)附著樣品的獲得附著樣品的采集地點一般為潮間帶。最常用的方法是放置載玻片或者其他載體放 置在目標區域，定期取回實驗室檢測；另一種方法是采用刮擦目標藻類的方式，這種方式容 易造成目標藻類的破損，而且雜質太多，不易檢測，一般不使用該方法。3、雜交技術流程該技術主要的步驟包括1)樣品的固定；2)樣品的制備和預處理；3)預雜交；4)探針和樣品變性；5)用不同的探針雜交來檢測不同的靶序列；6)漂洗去除未結合的探針；7)檢測雜交信號，進行結果分析。其關鍵環節在熒光染料的選擇、雜交過程和雜交后檢測。本發明采用的滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代的熒光原位雜交檢測方法 具有以下優點1、熒光試劑和探針經濟、安全原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記 的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素 操作較繁瑣等。項目采用原位熒光標記系統則可克服這些不足，而且沒有放射性，而且費用 較少，因此具有經濟、安全的特點。2、探針穩定，一次標記后可在兩年內使用；項目設計的探針在合適的條件下保存，可以使有效期延長至兩年。因此，探針一次 設計，可以長期使用，達到節省時間的目的。3、實驗周期短、能迅速得到結果、試驗操作流程簡單，時間短，達到迅速檢測的目的。4、可以定量檢測滸苔微世代的量項目設計的探針特異性好、定位準確，在熒光顯微鏡下可以清楚看到每一個被雜 交的孢子/合子/配子，因此，在取樣以及濃縮量記錄的情況下，可以通過推算的辦法定量 檢測水體中滸苔微世代種子庫的量。5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列該發明可以同時使用多種滸苔探針，通過不同的熒光顏色，更加正確的確認滸苔 微世代的存在及其存在量。


圖1 (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)為連續的23個樣品的ITS序列比對圖。
具體實施例方式實驗操作1、滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代探針的設計和制作1)滸苔(Enteromorpha prolifera) ITS序列的獲得于整個滸苔綠潮影響海域采 集23個不同站點，滸苔樣品的ITS序列及5. SSrDNA序列的PCR片段總長度為540bp，其中 ITS1長度為189bp，5. 8S rDNA全序列長度為160bp，ITS2長度為181bp。從序列比對的結果 看這23個樣品的ITS序列及5. 8S rDNA序列完全相同，可以確定是屬于一個種。滸苔ITS 序列為本實驗室測序獲得，登陸序列的數據庫網站http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ gquery，登陸序列號為FJ026732 ；序列比對如圖1所示；2)探針的篩選將所獲得的滸苔ITS序列與從GeneBank和EMBL等核酸數據庫種獲得的石純屬 所有的株系的ITS序列，應用Clustal X(自由軟件)對序列進行排序，并手動精減排列結 果，確定針對目標藻分類水平的特異性序列；然后通過數據庫(GeneBank和EMBL)的BLAST N接口對這些排列結果進行篩選。篩選后得到的特異性序列用于設計合適的探針，利用 0LIG06. 0軟件確定合適的探針長度(大約20bp左右)，根據Tm值和探針的二級結構等特 點篩除結構上不合適的探針。3)熒光染料的使用獲得的探針委托商業公司大連寶生物合成并進行5’端異硫氰酸熒光素FITC熒光 基團的標記。2、樣品的獲得
用采水器與滸苔密集海域采集5-10L海水，用10 y m篩絹過濾濃縮，將水體積縮小 為100-200mL，根據樣品研究需要分別加入1/10體積多聚甲醛(10%，終濃度)或
的魯格氏碘液、4%福爾馬林、2. 5%戊二醛進行固定。3、雜交技術流程將現場樣品進行濃縮及顯微鏡計數后，對藻的自發熒光進行脫色采用乙醇、丙酮 或者甲醇梯度脫色(此步驟脫色效果和時間根據具體情況而定)，過濾。用針筒吸取l_2ml 左右濃縮脫色后的樣品，在13mm針筒過濾器上低壓過濾，細胞則留在濾膜(聚碳酸酯膜或 核孔膜)上。用針筒吸取1XPBS lmL清洗一次5min，濾掉，用針筒吸取預熱的雜交緩沖液 (0. 9MNaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet_P40，20% 甲酰胺)lmL 清洗一次， 5min，濾掉。濾膜可以室溫空氣干燥，可在室溫下儲存一個月左右，也可以直接用于熒光原 位雜交(FISH)，大的濾膜如25mm可以剪成若干小塊，用作多樣本分析。將濾膜置于載玻 片上，直接加入預熱的雜交緩沖液55 y L與熒光探針5 u L (66ng/ u L)，使探針終濃度達到 5ng/uL0將玻片置于溫濕雜交盒(自制)于暗處46-50°C雜交2-3h。溫濕暗雜交盒中的 濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜(根據濾膜大小，用量 可以減少)。用預熱的(50°C ) lXSET(lmM EDTA, 20mM Tris/HCl,0. 15MNaCl,pH7. 8) 100 u L 的雜交清洗液洗滌濾膜來終止雜交反應，共清洗二次，每次溫育5分鐘，洗滌后用干凈濾紙 吸干濾膜。加入10-60 u L封片劑Citifluor/DAPI-Mix (含1 u g/mL DAPI)復染并防止熒 光淬滅。每張玻片可以并排放兩張25mm的濾膜，蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。 玻片可以在冷凍條件下保存數月而熒光不會衰減。4、實驗結果經過NIKON 80i熒光顯微鏡檢測(激發492nm，發射528nm)后發現片中有數量不 等的發射綠色熒光的滸苔孢子/配子/合子。
實施例1、樣品的獲得本次實驗從2008年6月開始，到2008年7月止。水體樣品于2008年6月15號采自 青島第二海水浴場潮間帶漂浮滸苔密集區域(35. 35° N，119. 30° E，水面以下10-35cm)。 采集樣品后的操作過程同上述實驗操作。共采集水體樣品55個，每個5L。實驗室內用10 ym 篩絹過濾濃縮，將水體積縮小為100mL。2、探針的設計滸苔中用于FITC標記原位雜交的寡核苷酸探針(根據ITS序列設計)設計同上 述方法，5’端采用FITC標記的辦法，一共設計4種探針1)5， -GCCCGCCGTTTACAGGAT-3，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，3) 5 ’ -CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’4) 5，-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3，3、雜交流程1)樣品的制備和預處理將現場樣品進行濃縮及顯微鏡計數后，對藻的自發熒光進行固定、脫色用15mL離心管于5000g/min 5min離心15mL樣品，棄上清，加入乙醇固定劑(體積濃度)3mL， 靜置1-2小時。用針筒吸取l_2ml左右濃縮脫色后的樣品，用13mm針筒在帶有聚碳酸酯膜的過濾 器上過濾，使細胞留在聚碳酸酯膜上。用針筒吸取1XPBS lmL過濾清洗一次，清洗時間5min。用針筒吸取預熱的(50°C) 雜交緩沖液(0. 9M NaCl,20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet-P40, 20% (v/v) 甲酰胺)lmL過濾清洗一次，清洗時間5min。濾膜可以室溫空氣干燥，可在室溫下儲存一個 月左右，也可以直接用于熒光原位雜交。2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入預熱的(50°C )雜交緩沖液(0. 9M NaCl,20mmol/ LTris-HCl, pH7. 2,0. 1 % (v/v) Nonidet-P40, 20 % (v/v)甲酰胺)55 ii L 與熒光探針 5 uL(50ng/ u L)，使探針終濃度達到5ng/ u L。將玻片置于溫濕雜交盒于暗處46_50°C雜交 2-3h。溫濕暗雜交盒中的濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜。3)漂洗去除未結合的探針用預熱的(50°C) lXSET(lmMEDTA,20mMTris/HCl,0. 15MNaCl，pH7. 8) 100 ii L 的雜
交清洗液浸泡洗滌濾膜來終止雜交反應，共清洗二次，每次溫育5分鐘，洗滌后用干凈濾紙 吸干濾膜。4、檢測雜交信號，進行結果分析加入10-60 u L封片劑Citif luor和DNA標記物DAPI (終濃度為1 y g/mL)的混合 液，復染并防止熒光淬滅。每張玻片可以并排放兩張25X25mm的濾膜，蓋上蓋玻片并封片， 儲存于暗處以備檢測。玻片可以在冷凍條件下保存數月而熒光不會衰減。雜交后的藻細胞 以熒光顯微鏡(Leica，型號為DMIRB)觀察雜交效果，并記錄陽性標記率。觀察FITC熒光 標記的藻細胞時應用450-490nm的激發光波長、510-520nm發射光波長的濾光片組合觀察。 觀察結果發現55個水樣中有24個觀察到了發綠色熒光的滸苔微世代，存在率為43. 64% ； 其中探針 2)5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，和 3)5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，的標記 效果較好。滸苔微世代SEQUENCE LISTING<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法<130><160>4<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<222>(1). . (18)<223><400>1gcccgccgtt tacaggat18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (20)<223><400>2agccctaacc cattgaaccc 20<210>3<211>22滸苔微世代<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (22)<223><400>3ccctgcgata gtaactgaga ca 22<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (19)<223><400>4ggagccctaa cccattgaa19
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權利要求
滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法，其特征在于用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’于它們的5’端采用FITC標記的辦法。
2.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微 世代的寡核苷酸探針為如下2種探針之一或二種，2)5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，，3)5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，。
3.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于原位雜交的具體過程為，1)樣品的制備和預處理將現場海水水體樣品進行濃縮后，對藻的自發熒光進行固定、脫色用離心管于 5000g/min離心樣品5min，加入乙醇至終體積濃度1 %固定，靜置1_2小時，得濃縮脫色后的 樣品，上帶有聚碳酸酯膜的過濾器上過濾，使細胞留在聚碳酸酯膜上；分別采用IXPBS和 雜交緩沖液過濾清洗濾膜；2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入雜交緩沖液和熒光探針，使探針終濃度達到 5-10ng/yL ；將玻片置于溫濕的暗處46_50°C雜交2_3h ；3)漂洗去除未結合的探針用預熱至50°C的IXSET的雜交清洗液浸泡洗滌濾膜來終 止雜交反應，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；4)檢測雜交信號，進行結果分析加入封片劑和終濃度為1 μ g/mL DNA標記物DAPI的混合液，復染并防止熒光淬滅。蓋 上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。雜交后的藻細胞以熒光顯微鏡觀察雜交效果，并記 錄陽性標記率；觀察FITC熒光標記的藻細胞時應用450-490nm的激發光波長、510-520nm 發射光波長的濾光片組合觀察，觀察確認水樣中存在的滸苔微世代。
4.按照權利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述海水水體樣品采集后用篩絹過 濾濃縮。
5.按照權利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述雜交緩沖液的組成為0.9M NaCl, 20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet-P40, 20% (v/v)甲酰胺。
全文摘要
本發明涉及綠潮生物檢測與監測研究，具體地說是一種滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法，用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’，2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’，3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’，4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’，它們的5’端采用FITC標記的辦法。本發明可實現快速且準確地鑒定、計數滸苔微世代，從而確定其生物量、分布情況，達到準確檢測預報的目的。
文檔編號C12N15/11GK101851666SQ20091002028
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月4日 優先權日2009年4月4日
發明者葉乃好, 莊志猛, 張曉雯, 毛玉澤, 王清印 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所