專利名稱：產β-1,3-葡聚糖酶的微生物及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產生P-l， 3-葡聚糖酶的微生物及其菌體發酵培養粗酶制劑的制備方 法與應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
P-葡聚糖在自然界中分布廣泛，是組成高等植物、酵母菌和絲狀真菌細胞壁的結構大 分子之一。P-葡聚糖廣泛存在于麥類作物中，主要結構是P-1，3-1， 4-葡聚糖。酵母細胞 壁中多糖含量為85-90 %，其主要成分是P-1， 6-分枝的e-1， 3-葡聚糖。酵母細胞壁是 P -1, 3-葡聚糖的重要來源。很多重要的植物病原真菌細胞壁的主要成份也是e -1， 3-葡聚 糖，它同幾丁質一起構成真菌細胞壁的網狀骨架。
e-l， 3-葡聚糖酶(P-1, 3-glucanase， EC3. 2. 1. 39)是一類能特異作用于葡聚糖中
的e-i， 3-糖苷鍵的水解酶，可以催化e-i， 3-葡聚糖的水解反應。e-i， 3-葡聚糖酶可 廣泛應用于啤酒工業、飼料工業、生物防治以及醫藥等領域。在詞料、啤酒等行業中，e-
葡聚糖是限制麥類有效利用的關鍵因素，P-l， 3-葡聚糖酶能夠有效分解麥類植物細胞壁 中的葡聚糖，顯著降低詞料中非淀粉多糖的含量，降低啤酒釀造中麥芽汁的黏度，提高麥 芽溶出率，穩定啤酒質量。e-l， 3-葡聚糖酶能破壞真菌的細胞壁，可用于抑制有害真菌
的生長與增殖，是重要的抗真菌病的物質。e-i， 3-葡聚糖酶能夠降解酵母細胞壁，從而 促進酵母細胞內容物的釋放和利用。e-i， 3-葡聚糖具有抗腫瘤和免疫調節等藥理活性， 其生物活性與葡聚糖的分子量和水溶性相關。e-i， 3-葡聚糖酶能增加葡聚糖的水溶性， 用于可溶性免疫多糖的制備。
P-l， 3-葡聚糖酶來源廣泛，某些植物、真菌和細菌均能產生。在細菌中，目前己發
現的e-1， 3-葡聚糖酶的產生菌主要是芽孢桿菌，其他e-i， 3-葡聚糖酶產生菌研究得非
常少。篩選新的e-l， 3-葡聚糖酶產生菌，對獲得具有優良性狀的P-1， 3-葡聚糖酶，促 進葡聚糖酶的廣泛應用有重要意義。本發明篩選的e-l， 3-葡聚糖酶產生菌為殼聚糖酶產 生菌(附ts朋ris c力Wos朋ite&Va)，在分類系統中，該菌所在的屬和種都是2005年剛定 名的親jf屬禾口茅開禾中(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55, 1927-1932)。目前僅有幾篇論文報道殼聚糖酶產生菌能產生殼聚糖酶，尚沒有 關于該菌產生P-l， 3-葡聚糖酶的報道。
發明內容
針對現有P-l， 3-葡聚糖酶產生細菌來源不足的缺陷，本發明提供一種產P-1， 3-葡 聚糖酶的微生物與用途。
本發明的產P -1， 3-葡聚糖酶的微生物是殼聚糖酶產生菌H12。
本發明的產e-l， 3-葡聚糖酶的微生物分類命名為殼聚糖酶產生菌H12 c力"鎖/7i'ts力油H12),其保藏號為CGMCC 2949，保藏日期為2009年3月13日，保藏單位 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。其16SrRNA基因序列如 Seq.Nol所示。
本發明的殼聚糖酶產生菌H12的分離篩選步驟如下土樣采于趵突泉啤酒廠，將土樣點種于篩選培養基上，3(TC培養3天，挑取降解酵母 細胞壁透明圈大的菌落邊緣，再次轉接到篩選培養基上，30。C培養3天，挑取降解酵母細 胞壁透明圈邊緣的菌體，進行平板劃線分離，得到菌落純的殼聚糖酶產生菌H12。
所用篩選培養基為安琪酵母5.0g， CaCl2.2H20 1.36g,瓊脂10 g，加水至1 L， 121 °C滅菌30min。
本發明的殼聚糖酶產生菌H12菌株特征如下
殼聚糖酶產生菌H12經菌株鑒定為殼聚糖酶產生菌(必'"i/sris c力itos朋ite/^Vs)， 其16SrRNA序列見基因序列表，與胞ts"e/ ia cMto 朋ota&^s (ATCC保藏號BAA-476 )的16S rRNA序列相似性為98. 9%。該殼聚糖酶產生菌H12能以酵母細胞壁為唯一碳源生 長，在酵母平板上生長迅速，形成明顯的菌落。菌落呈乳白色，菌落邊緣整齊，菌落周圍 有降解透明圈產生。顯微鏡觀察細胞呈短桿狀，兩端稍尖，無鞭毛，不運動，菌的大小寬 約0. 8-1 ii m，長約2. 5-3. 0u m，革蘭氏染色為陰性。
本發明的殼聚糖酶產生菌H12制備P-l， 3-葡聚糖酶的用途，用殼聚糖酶產生菌H12 菌體發酵培養粗酶液制備e-l， 3-葡聚糖酶粗酶制劑。
上述殼聚糖酶產生菌H12菌體發酵培養粗酶液的制備方法包括如下步驟
發酵培養基為1-2%(w/v,單位g/ml)的安琪酵母，pH6-7， 121°C高壓滅菌30min。 按3-5% (v/v)的接種量接種本發明分離篩選得到的純菌株H12菌，30°C， 160 rpm，搖床 培養15 h-18 h，得粗酶液。
所得的粗酶液以昆布多糖為底物，用3，5 — 二硝基水楊酸(DNS)法測定e-l， 3-葡聚 糖酶的活力。1， 3-葡聚糖酶能將P-1， 3-葡聚糖降解成寡糖和單糖，具有還原性的寡 糖和單糖可以與DNS試劑發生顯色反應，在545 nm波長處有最大吸收。還原糖的量與光吸 收值呈線性關系，而酶活力又與還原糖的量呈線性關系，因此利用比色法可測定樣品光吸 收值，并推算出中粗酶液中e-l，3-葡聚糖酶的活力。
酶活測定方法酶液50iil，力n 10mg/ml的昆布多糖(主要含卩-1， 3-葡聚糖)50 n 1， 加pH6.0的0.1 mol/L醋酸緩沖液50 ul ，在45 'C， pH 6條件下反應1 h。加DNS 500 ml, 煮沸lOmin,，在550nrn測光吸收值。以每分鐘從P-1， 3-葡聚糖底物溶液中降解釋放l^unol 還原糖所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱為U。
DNS試劑6.3 g 3,5 — 二硝基水楊酸溶于262 ml 2 mol/L的氫氧化鈉溶液中。將此溶液 與500 ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水混合。向該溶液中再加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉， 充分攪拌使之溶解，待溶液冷卻后，用水稀釋到1 000ml。儲存于棕色瓶中。
上述e-i， 3-葡聚糖酶粗酶制劑的制備方法，可供優選的具體操作步驟如下
將上述殼聚糖酶產生菌H12菌體發酵粗酶液，4000-5000 rpm離心25-30 min，取上清， 加入固體硫酸銨到濃度為70-75 % (w/v，單位g/ml)飽和度，8000-10000 rpm離心25-30 min，所得沉淀放入半透膜的透析袋里，扎緊袋口置于pH 6.0的0.01 mol/L醋酸緩沖液 1000mL的燒杯中，在冰箱中透析過夜，其間更換醋酸緩沖液4次。移出透析袋中的酶液， 放在-20。C冷凍過夜，置于凍干機中冷凍干燥24-48 h，得P-l， 3-葡聚糖酶粗酶制劑,劑型為 干粉。
有關e-i， 3-葡聚糖酶活性及酶反應條件的實驗研究如下
對上述發酵培養的粗酶液以昆布多糖為底物，用3， 5-二硝基水楊酸(DNS)法測還原糖
4的含量，表明粗酶液的e-l,3-葡聚糖酶活力為3-5U/ml。 e-l,3-葡聚糖酶的最適反應溫度為 50 °C ，最適反應pH值為pH 6。該酶在pH 4-9具有良好的酸堿度耐性，在50°C以下有良 好的溫度穩定性，但是該酶在5(TC以上不耐熱。
(1) e-i，3-葡聚糖酶最適反應溫度的測定方法
酶液50 y 1,力Q 10 mg/ml的昆布多糖50 u 1,加pH 5. 9， 0.1 mol/L的醋酸緩沖液50 yl ，分別放入30°C， 40°C， 45°C， 50。C， 53°C， 55°C， 60。C的水浴鍋中反應1 h，分別 按上述酶活測定方法測定各樣品酶活力。e-1，3-葡聚糖酶的最適反應溫度如圖1所示。
(2) 13 -1， 3-葡聚糖酶最適反應pH的測定方法.-
配制不同pH值的緩沖液。pH值2. 5 7為0. 02 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 值7 9為0. 02 mol/L磷酸鹽緩沖液。用pH計分別精確測定緩沖溶液pH值為2. 57， 4， 4. 73， 5.5， 5.97， 6.89， 7.5， 9.25，酶液50 nl，分別加入到不同pH的緩沖液中，按上述酶活 測定方法測定各樣品酶活力。P -1， 3-葡聚糖酶的最適反應pH如圖2所示。
(3) 0-1,3-葡聚糖酶溫度耐受性測定方法 將酶液置于不同溫度的水浴鍋中，30°C， 40°C， 50°C, 60°C。分別保溫30min、 60min、
90 min、 120 min、 150 min、 180 min,迅速放在冷水中冷卻，分別按上述酶活測定方法測 定各樣品酶殘余活力。5 -1， 3-葡聚糖酶對溫度的耐受性如圖3所示。
(4) e-l，3-葡聚糖酶pH耐受性測定方法 將酶液置于上述不同pH的緩沖液中，pH值分別為pH 2.57， pH 4， pH 4.73， pH 5.5，
pH5.97， pH6.89， pH 7. 5， pH 9. 25，室溫放置24hr，分別按上述酶活測定方法測定各樣 品殘余酶活力。e -1, 3-葡聚糖酶對pH的耐受性如圖4所示。
本發明的e -1， 3-葡聚糖酶及P -1, 3-葡聚糖酶粗酶液干粉制劑可廣泛應用于啤酒工業、 詞料工業、生物防治以及醫藥等領域。
圖i是反應溫度對e-i,3-葡聚糖酶酶活力影響的關系曲線,橫坐標是反應體系的溫度， 縱坐標是酶活力。
圖2是反應pH對P -1, 3-葡聚糖酶酶活力影響的關系曲線,橫坐標是反應體系的pH，縱 坐標是酶活力。
圖3是P -1， 3-葡聚糖酶溫度耐受性曲線，橫坐標是不同溫度下的保溫時間，縱坐標是 殘余酶活力。
圖4是e -1, 3-葡聚糖酶pH耐受性曲線。橫坐標是緩沖液的pH值，縱坐標是殘余酶活力。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但不限于此。 實施例1:
殼聚糖酶產生菌H12的分離篩選，步驟如下
土樣采于趵突泉啤酒廠，將土樣點種于篩選培養基上，3(TC培養3天，挑取降解酵母 細胞壁透明圈大的菌落邊緣，再次轉接到篩選培養基上，3(TC培養3天，挑取降解酵母細 胞壁透明圈邊緣的菌體，進行劃線分離，得到菌落純的菌株。該菌株鑒定為殼聚糖酶產生 菌H12 (y(/j't卿ria c力yto，"a6油H12)，其16SrRNA基因序列如Seq. Nol所示。所用篩選培養基為安琪酵母5.0 g， CaCl2'2H20 1.36g,瓊脂10 g，加水至1 L， 121 °C滅菌30min。
實施例2:殼聚糖酶產生菌H12的發酵培養與J3 -1, 3-葡聚糖酶活性測定
發酵培養基為1-2 % (w/v)的安琪酵母，pH 6-7， 121°C高壓滅菌30 min。按3-5 % (vZv)的接種量接種本發明分離篩選得到的殼聚糖酶產生菌H12， 3(TC， 160rpm，搖床培養 15 h-18 h，得粗酶液。
所得的粗酶液以昆布多糖為底物，用3，5 — 二硝基水楊酸(DNS)法測定P-1， 3-葡聚 糖酶的活力，粗酶液的f3-l，3-葡聚糖酶活力為3-5 U/ml。 P-l，3-葡聚糖酶的最適反應溫 度為50 'C，最適反應pH值為pH6。 e-l,3-葡聚糖酶的最適反應溫度如圖1所示。f3-1,3-葡聚糖酶的最適反應pH如圖2所示。
酶活測定方法酶液50nl，加10mg/ml的昆布多糖(主要含(3-1, 3-葡聚糖)50 u 1， 加pH6.0的0.1mol/L醋酸緩沖液50 u 1 ，在45°C， pH6條件下反應lh。力卩DNS 500 ml, 煮沸10 min, 550 nm測光吸收值。以每分鐘從p-l， 3-葡聚糖底物溶液中降解釋放lpmol還 原糖所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱為U。
DNS試劑6.3 g 3， 5-二硝基水楊酸溶于262ml2mol/L的氫氧化鈉溶液中。將此溶液 與500 ml含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水混合。向該溶液中再加入5 g重蒸酚和5 g亞硫酸鈉， 充分攪拌使之溶解，待溶液冷卻后，用水稀釋到1000 ml。儲存于棕色瓶中。
實施例3: P-l， 3-葡聚糖酶粗酶制劑的制備
將實施例2中所得的殼聚糖酶產生菌H12的發酵培養粗酶液，4000-5000 rpm離心30 min，取上清，緩慢加入固體硫酸銨到硫酸銨濃度為70-75% (w/v)飽和度，8000-10000 rpm 離心30min，所得沉淀放入半透膜的透析袋里，扎緊袋口置于pH6.0的0. 01 mol/L醋酸 緩沖液1000mL的燒杯中，在冰箱中透析過夜，其間更換約醋酸緩沖液4次。移出透析袋 中的酶液，放在-2(TC冷凍過夜，置于凍干機中冷凍干燥36h,得P-1， 3-葡聚糖酶粗酶制 劑，劑型為干粉。
6序列表
〈110〉山東大學
〈120〉產e-l， 3-葡聚糖酶的微生物及應用 〈160〉 1 <170〉 Patent In3. 1 〈210〉 1 〈211〉 1592 〈212〉 16Sr腿 〈400〉 1 Seq. No 1
ttscgccssgcttgcatgcctgcaggtcgacga_tta_3gg3ggtgatcctsccgcsccttc60
cgatscggctsccttgtt3cgacttcsccccagtcscgaaccctgccgtggtaatcgccc120
tccttgcggttaggctaactacttctggcagascccgctcccatggtgtgacgggcggtg180
ccgggetacgtsttcaccgcggcaagctgacccgcgattactsgcgsttcc240
gacttcacgcagtcgagttgtccggactacgaccgggtttctgggattag300
ctccccctcgcgggttggcagccctctgtcccggccattgtatgscgtgtgtagccctac360
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ctcattagsgtgccctttcgtgacaagggttgcgctcgttgcgggsctts480
a_cccaa_catctcscgsceLCgggccatgcsgcscctgtgtcC3ggttctct540
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cctcaggtcgt3tgcggt3ttagctgctctttcgsgcEigttatcccccac33Ctgggcac1440
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gscttgcstgtgtaaggcatgccgccsgcgttcaatctgagccaggstcaaactctcsat1560
ctctagsggatccccgggt3ccgagctcgs159權利要求
1、產β-1，3-葡聚糖酶的微生物，分類命名為殼聚糖酶產生菌H12(Mitsuariachitosanitabida H12)，保藏號為CGMCC 2949，保藏日期為2009年3月13日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2、 權利要求1所述的產I3-1， 3-葡聚糖酶的微生物的制備方法，其特征是菌株分離篩 選步驟如下土樣采于趵突泉啤酒廠，將土樣點種于篩選培養基上，3(TC培養3天，挑取降解酵母 細胞壁透明圈大的菌落邊緣，再次轉接到篩選培養基上，3CTC培養3天，挑取降解酵母細 胞壁透明圈邊緣的菌體，進行劃線分離，得到H12菌株；所用篩選培養基為安琪酵母5.0 g， CaCl2.2H20 1.36g,瓊脂10 g，加水至1 L， 121 °C滅菌30min。
3、 權利要求1所述的P-1， 3-葡聚糖酶的微生物在制備e-l， 3-葡聚糖酶中的用途， 用殼聚糖酶產生菌H12菌體發酵培養粗酶液制備e-l， 3-葡聚糖酶粗酶制劑。
4、 如權利要求3所述的P-1， 3-葡聚糖酶的微生物在制備P-1， 3-葡聚糖酶中的用途， 其特征在于所述殼聚糖酶產生菌H12菌體發酵培養粗酶液的制備方法如下發酵培養基為1-2 % w/v的安琪酵母，pH 6-7， 121°C高壓滅菌30 min; 按3-5 % 體積比的接種量接種殼聚糖酶產生菌H12， 3CTC， 160 rpm，搖床培養15 h-18 h,得粗酶 液。
5、 一種e-l， 3-葡聚糖酶粗酶制劑的制備方法，將權利要求4制得的殼聚糖酶產生菌 H12菌體發酵粗酶液，4000-5000 rpm離心25-30 min，取上清，加入固體硫酸銨到濃度為 70-75 % (w/v) , 8000-10000 rpm離心25-30 min，所得沉淀放入半透膜的透析袋里，扎緊袋 口置于pH 6.0的O.Ol mol/L醋酸緩沖液1000mL的燒杯中，在冰箱中透析過夜，其間更 換醋酸緩沖液4次;移出透析袋中的酶液，放在-2(TC冷凍過夜，置于凍干機中冷凍干燥24-48 h，得e-i， 3-葡聚糖酶粗酶制劑，劑型為干粉。
全文摘要
本發明涉及一種產β-1，3-葡聚糖酶的微生物及應用。產β-1，3-葡聚糖酶的微生物，分類命名為殼聚糖酶產生菌H12(Mitsuaria chitosanitabida H12)，保藏號為CGMCC 2949，用于制備β-1，3-葡聚糖酶。通過制備殼聚糖酶產生菌H12菌體發酵培養粗酶液，進而制得β-1，3-葡聚糖酶粗酶液干粉制劑。本發明的β-1，3-葡聚糖酶及β-1，3-葡聚糖酶粗酶液干粉制劑可廣泛應用于啤酒工業、飼料工業、生物防治以及醫藥等領域。
文檔編號C12N1/20GK101565682SQ20091002030
公開日2009年10月28日 申請日期2009年4月7日 優先權日2009年4月7日
發明者劉巍峰, 盧雪梅, 創 張, 樊志華, 峰 段 申請人:山東大學