一種微生物油脂的生產方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬于微生物油脂的生產，特別涉及一種利用產油微生物轉化含有葡萄糖和甘露糖的酵母菌渣制備微生物油脂的方法?！?br>背景技術：
】[0002]產油酵母、霉菌、細菌和一些藻類等產油微生物在一定條件下，將可發酵性糖轉化為胞內油脂，稱為微生物油脂。據報道，部分產油微生物在胞內積累的油脂可以達到自身干重的70%以上(LiYH,ZhaoZB,BaiFff.High-densitycultivat1nofoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloidesY4infed-batchculture.EnzymeMicrobTechnol,2007,41(3):312-317)。利用微生物生產油脂，不受場地、季節及氣候的影響，不占用農田耕地，生產時間短，容易實現油脂生產的規模化、連續化。微生物油脂制得的生物柴油與動、植物油制得的生物柴油組成相似，因此，開發微生物油脂可以為生物能源產業發展提供新原料，具有重要的應用前景。[0003]隨著工業生物技術的發展，會出現大量廢棄酵母菌渣。酵母菌渣主要水解產物是葡萄糖、甘露糖、氨基酸和其他一些營養物質。另外還有一些含有葡萄糖、甘露糖的生物基材料，如魔芋。通過發酵技術充分利用這些資源，生產微生物油脂，將顯著降低微生物油脂生產成本。[0004]微生物在利用含有葡萄糖和其他單糖的混合物時，絕大多數微生物優先利用葡萄糖，待葡萄糖耗盡或濃度很低時才開始利用其他碳源，這種現象被稱為碳代謝阻遏，亦稱葡萄糖效應(NicholsNN,DienBS，BothastRJ.Useofcataboliterepress1nmutantsforfermentat1nofsugarmixturestoethanol.ApplMicrob1lB1technol,2001,56(1-2):120-125)。葡萄糖效應會使得微生物生長和產物的生成過程出現延滯期，即二次生長現象，該現象會導致發酵周期延長和發酵效率降低。因此，尋找能夠同步高效利用葡萄和甘露糖的微生物對于提高發酵效率具有重要意義。[0005]解除葡萄糖相應的相關研究已有文獻報道。在連續發酵過程中，將葡萄糖濃度維持在一個較低水平，并且在一個較合適的稀釋速率下實現葡萄糖和木糖的步利用(KastnerJ,Jonesff,RobertsR.Simultaneousutilizat1nofglucoseandD-xylosebyCandidashehataeinachemostat.JIndMicrob1lB1t,1998,20(6):339-343)第二，通過篩選葡萄糖磷酸轉移酶突變株，也能解除葡萄糖抑制作用，這已在葡萄糖和木糖同步利用實現(DienB,NicholsN,BothastR.Fermentat1nofsugarmixturesusingEscherichiacolicataboliterepress1nmutantsengineeredforproduct1nofL-1acticacid.JIndMicrob1lB1t,2002,29(5):221-227)。最后，選育天然的能夠同步利用葡萄糖和甘露糖的菌株是最為可靠和有效的途徑。【
發明內容】[0006]葡萄糖效應這一常見現象使得微生物在連續、批式-補料發酵時產生生長和產物積累出現二次增長現象。二次增長現象可導致油脂發酵過程周期延長、效率降低、生產成本提高。發明人認為利用天然的或者人工改造的微生物菌株，解除二次增長現象這一瓶頸，可顯著促進底物的代謝效率，改善微生物油脂的技術經濟性。因此，發明人利用大量產油微生物進行了科學實驗，發現部分產油微生物菌株具有同步利用葡萄糖和甘露糖的生理特性。[0007]本發明在于提供一種同步利用葡萄糖和甘露糖產油微生物，生產一種或多種脂肪酸及其衍生物的微生物油脂。本發明工藝簡便、方法易行、可高效利用和轉化成分復雜的碳源，如產油酵母菌渣的水解產物，改善微生物油脂生產的技術經濟性。[0008]本發明通過以下技術方案予以實現:[0009]1、制備產油培養基。通過下述方法的一種或它們的必要組合方法實現:[0010]A.將葡萄糖和甘露糖混合，制成總糖質量濃度為2%-10%的水溶液，葡萄糖和甘露糖的相對比例為95:5至5:95。添加其他必要的營養成分，pH3.0-8.0，滅菌后備用；[0011]B.參照文獻方法，將酵母菌渣水解，產物制成含有葡萄糖和甘露糖的水溶液，添加其他必要的營養成分，PH3.0-8.0，滅菌后備用；或，[0012]C.參照文獻方法水解含碳水化合物的生物基原料，產物中添加葡萄糖或甘露糖以及其他必要的營養成分，PH3.0-8.0，滅菌后備用；或，[0013]D.參照文獻方法水解含碳水化合物的生物基原料，產物中不添加任何其他營養成分，pH3.0-8.0,滅菌后備用。[0014]其他必要的營養成分為:常規的用于產油微生物培養的物質，如酵母粉以及所需無機鹽，包括但不限于硫酸銅、硫酸錳、硫酸鈉、硫酸鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鎂、氯化銨、氯化鈣中的一種或幾種組合。[0015]2、產油微生物培養。向步驟I所述培養基中接種產油微生物種子液，接種量5%-20%(v/v)，在25°C_37°C下有氧發酵，至醪液中殘糖濃度低于0.5%。[0016]3、菌體收集和微生物油脂提取。培養結束后，采用離心、過濾或其他必要的方法濃縮收集產油微生物細胞。參照文獻(李植峰，張玲、沈曉京等.四種真菌油脂提取方法的比較研究。微生物學通報，2001，28￠):72-75)使用酸熱-有機溶劑法提取獲得油脂，計算菌體油脂含量。[0017]本發明使用的產油微生物菌體油脂含量可超過細胞干重20%(w/w)，并且具有同步消耗葡萄糖和甘露糖的生理特性的微生物，它們包括但不限于油脂酵母Lipomyces屬的菌種，如斯達式油脂酵母Lipomycesstarkeyi。這些菌株可以直接從包括中國普通微生物菌種管理中心(CGMCC)及美國典型培養物保藏中心(ATCC)等菌種保藏機構購買或從自然界中分離，也可以使用與原來菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。[0018]本發明采用將葡萄糖和甘露糖混合的方法、水解含有葡萄糖單元或甘露糖單元生物原料的方法、或者組合必要的方法，制備含有葡萄糖和甘露糖的碳源。生物基料水解參照文獻方法(CaraC,RuizE,OlivaJM,SaezF，CastroE.Convers1nofolivetreeb1massintofermentablesugarsbydiluteacidpretreatmentandenzymaticsaccharificat1n.B1resourTechnol,2008,99(6):1869-1876)進行。生物基材料主要含有葡聚糖和甘露聚糖的物質，包括但不限于釀酒酵母、產油酵母菌渣和魔芋。[0019]本發明的有益效果是:[0020]I)為工業生產中的酵母菌渣的利用提供了新途徑，本發明技術簡單有效，周期短，可解決發酵工業中下游廢物的利用問題；[0021]2)微生物同步利用葡萄糖和甘露糖，克服了葡萄糖效應，避免了過程中的二次生長現象；[0022]3)微生物利用葡萄糖和甘露糖積累微生物油脂，開拓了含有葡萄糖/甘露糖為主的生物基材料作底物，為降低微生物油脂生產成本提供了新的途徑。[0023]與常規優先利用葡萄糖發酵的過程相比，本發明涉及葡萄糖和甘露糖的同步利用，能夠消除發酵過程中的二次生長現象，縮短發酵周期，提高底物轉化效率，降低生產成本；與生物轉化其他原料制備微生物油脂的方法相比本發明使用的原料是含有葡萄糖和甘露糖的工業生產酵母菌渣，如產油酵母菌渣、釀酒酵母菌渣，具有豐富的潛在資源，發酵獲取油脂方法簡單易行、成本低而且可控，是一種利用可再生資源生產微生物油脂的新途徑。【附圖說明】[0024]圖1為實施例1中底物消耗和生物量生成曲線；[0025]圖2為對比實施例1中底物消耗曲線。其中，■葡萄糖；?甘露糖；八生物量。【具體實施方式】[0026]下面是具體對比實施例和實施例，它們有助于了解本專利以及不同工藝對微生物油脂生成的影響，但不局限于本發明的內容。[0027]對比實施例1[0028]I)將葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖35g/L，甘露糖35g/L，添加2.0g/L酵母粉，0.lg/L氯化銨，1.0g/L氯化鎂，0.lg/L硫酸鈉，11.8g/L磷酸二氫鉀，3.7g/L磷酸氫二鉀，I%(v/v)的微量元素溶液(微量元素母液(mg/L):二水氯化鈣40，七水硫酸亞鐵5.5，七水硫酸鋅1.0,一水硫酸錳0.76和硫酸1.76，余量為水，pH7.0,所得培養基滅菌121°C滅菌后備用；[0029]2)產油酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養基中，于35°C，200轉/分鐘振蕩培養18小時；[0030]3)向步驟(I)所述培養基中接入步驟(2)制備的產油微生物種子液，接種量15%(v/v)，在35°C下通氣培養120小時；[0031]4)終止發酵，此時發酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的濃度分別為0.0g/L和20.9g/L;固液分離收集菌體，干燥，得干菌體14.3g/L，油脂含量51.8%。[0032]對比實施例2[0033]I)將葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖53g/L，甘露糖47g/L，添加1.0g/L酵母粉，0.75g/L氯化銨，1.0g/L氯化鎂，0.lg/L硫酸鈉，微量元素溶液I%(v/v)，余量為水，pH3.0，所得培養基滅菌121°C滅菌后備用；[0034]2)產油酵母TrichosporoncutaneumAS2.571(菌株來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養基中，于30°C，200轉/分鐘振蕩培養24小時；[0035]3)向步驟(I)所述培養基中接入步驟(2)制備的產油微生物種子液，接種量20%(v/v)，在30°C下通氣培養132小時；[0036]4)終止發酵，此時發酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的濃度分別為0.0g/L和31g/L；固液分尚收集菌體，干燥，得干菌體26.5g/L,油脂含量51.3%。[0037]對比實施例3[0038]I)將葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖59.5g/L，甘露糖10.5g/L,添加0.8g/L酵母粉，0.lg/L氯化銨，1.0g/L氯化鎂，0.lg/L硫酸鈉，0.8g/L磷酸二氫鉀，1.7g/L磷酸氫二鉀，微量元素溶液1%(v/v)，余量為水，pH8.0，所得培養基滅菌121°C滅菌后備用；[0039]2)產油酵母CryptococcuscurvatusATCC20509(來源于美國典型微生物菌種保藏中心)在液體種子培養基中，于28°C，200轉/分鐘培養20小時；[0當前第1頁1 2 3 4