專利名稱：馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物、檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及松材線蟲的基因學檢測，具體涉及一種馬尾松病死木 中松材線蟲的特異性檢測引物、檢測方法及其應用。
背景技術：
松材線蟲病是重要的檢疫性病害，目前松材線蟲病的全國發生面
積達8.7萬hm2，累計枯死松樹3500多萬株，疫區疫木不僅不能正常利 用，而且影響其它農副產品和林產品的流通，造成直接經濟損失25 億元，間接經濟損失達250億元，生態環境、外貿出口和社會經濟發 展受到嚴重影響，己被我國列入對內、對外的檢疫對象。
關于松木中松材線蟲的鑒定，目前常用的方法有松材線蟲的形 態學鑒定方法、松材線蟲蛋白質電泳方法、松材線蟲酶聯免疫吸附法、 松材線蟲蛋白質印記法、松材線蟲DNA雜交技術、松材線蟲RAPD 技術和松材線蟲巢式PCR鑒定等，但這些鑒定方法存在以下缺陷
1、松材線蟲形態學鑒定簡便易行，是現行線蟲種類鑒定的常規 方法，但是線蟲形態微小，需專業人士在顯微鏡下觀察，分離結果難 確定，而且松材線蟲組的變異傘滑刃線蟲、錐尾傘滑刃線蟲、科麗姆 傘滑刃線蟲和擬松材線蟲等具有和松材線蟲相似的形態，這也使得形 態學鑒定比較困難，此外植物感病前期外觀癥狀不明顯，這也使得松 材線蟲病早期診斷困難，發病的松木中并不是總能分離到松材線蟲成 蟲，且松材線蟲多以幼蟲形式存在，培養出成蟲需要時間，這些都導致疑似病例得不到及時確診，延誤了最佳防治時期；
2、 蛋白質電泳分析是較早應用于線蟲分類學研究的一項分子技
術，不少學者對松材線蟲和擬松材線蟲株系進行了同工酶差異的研 究，然而同工酶技術要求大量的樣本才能獲得清晰的電泳圖譜，且蛋 白質的表達與環境以及線蟲的生長發育階段有關，到目前為止，尚未
有一種同工酶被公認為可以明確地區分松材線蟲與擬松材線蟲；
3、 DNA雜交技術雖然可以準確快速地鑒定松材線蟲但是該技術 難度較大，費用高，且具有放射性危害，不利于大規模推廣；
4、 隨機擴增多態DNA技術(RAPD)雖然具有快速、簡便、靈 敏且無需放射性同位素標記等優點，但是也存在圖譜比較復雜，重復 性和可比性差等缺點，在鑒定松材線蟲上存在一定的局限性。
PCR技術的應用，突破了DNA分子鑒定所受DNA量的限制，大 大提高了檢測的靈敏度。Hoyer a/ (1998 Hoyer U, Burgermeister W， Braasch H. Identification of ^raqp/ze/ewc/2z^ species(Nematode, Aphelenchoididae) on the basic of amplified ribosomal DNA(ITS國RFLP). Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes, 1998, 50(11): 273-277)建立了區分5種線蟲的ITS-PCR-RFLP技術，并成功地檢測 了松材線蟲和擬松材線蟲，用單條活線蟲建立了快速、靈敏的松材線 蟲診斷方法；張立海(2001張立海，廖金鈴，馮志新.松材線蟲rDNA 的測序和PCRSSCP分析.植物病理學報，2001， 31 (1): 84-89)建立 的PCR-SSCP技術，可將松材線蟲和擬松材線蟲明顯區分開。
這些PCR技術是在種級水平上區分松材線蟲和擬松材線蟲的簡便快速方法，具有重復性和穩定性好、可靠性較高等優點，但是需要 將線蟲從木頭中分離出來之后，進行鑒定。
直接檢測出松木中的松材線蟲是人們一直在研究的課題。白鋼等 (2005白鋼，李海燕，馬洪周等.疫木切面上松材線蟲抗原的免疫學
檢測方法.林業科學，2005， 41 (6) : 101-104)利用抗松材線蟲血清， 建立在疫木切面上直接進行免疫組化染色檢測松材線蟲抗原的方法， 但是操作復雜，以及抗體特異性等因素給實際應用帶來了一定的困 難；王延輝(2007王延輝.擬松材線蟲致病性及檢測技術研究.廣州 華南農業大學，2007.30-36)通過設計組合外圍通用引物和特異性引 物，運用巢式PCR技術從松樹和線蟲的混合DNA中，有效的檢測出 松材線蟲和擬松材線蟲，但是步驟比較繁瑣且增加許多不確定的因素, 尚處于研究開發階段。
鑒于松材線蟲病是我國的頭號森林病害，而馬尾松又在我國廣泛 分布，因此對馬尾松的松材線蟲病的研究迫在眉睫。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種馬尾松病 死木中松材線蟲的特異性檢測引物，該引物對松材線蟲具有高特異 性，可用于PCR方法檢測馬尾松病死木中的松材線蟲。
本發明的另一個目的是提供一種利用上述特異性檢測引物對馬 尾松病死木中松材線蟲進行高效快速PCR檢測的方法。
本發明的另一個目的是提供上述特異性檢測引物的應用。
本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的本發明人通過對比松材線蟲、擬松材線蟲、馬尾松松木的已公開 序列，設計并篩選出僅對馬尾松病死木中松材線蟲具有高特異性的引 物，通過PCP擴增檢測馬尾松病死木中松材線蟲。
本發明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物，其上游引
物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQIDNO: 2所示。
針對馬尾松病死木中松材線蟲種類多，將松材線蟲從松木中分離 出來難度大，而且松木本身成分復雜，從而導致目的DNA模板制備 困難的現狀，本發明還提供一種無需分離松材線蟲，直接用馬尾松病 死木制備DNA模板，可用于后期馬尾松病死木中松材線蟲的PCR檢 測，該DNA模板的制備方法主要是采用WLB裂解液和蛋白酶K對 馬尾松病死木進行兩次裂解，具體包括如下步驟將馬尾松病死木經 液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中完成溫度循環95"C15min， 65'C2min，重復溫度循環一次，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，將該DNA裂解液純化后則可作為 DNA模板用于后續的PCR擴增；所述WLB裂解液的配方為含有 2.5 mmol L" 二硫蘇糖醇(DTT)、 1.125%吐溫-20 (質量百分比)、 0.025%明膠(質量百分比)、125 mmol I/1 KC1、 25 mmol L" Tris-HCl (pH8.0)和3.75 mmol L-1MgCl2。
上述DNA模板的制備方法中，馬尾松病死木和WLB裂解液以 及蛋白酶K的用量優選5mg的馬尾松病死木，采用lOOpl 200pl WLB和8|il l(Hil蛋白酶K (20 mg'mr1)進行裂解；優選用量為5mg的馬尾松病死木，采用200WWLB和10|_d蛋白酶K(20 mg，ml—1)
進行裂解。
上述DNA模板的制備方法中，所述純化可采用純化DNA常用 的3S柱。
一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測方法，包括如下步
驟
(1) 模板DNA制備采用上述DNA模板制備方法；
(2) 采用上述馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物，進行 常規PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察電 泳結果中的特異性片段，即可實現對馬尾松病死木中松材線蟲的檢
上述步驟(2)中，為了提高PCR擴增效率，本發明對PCR擴 增反應條件進行了優化
a. PCR擴增退火溫度的優化退火溫度選擇47°C 、47.6°C 、48.2°C 、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7。C、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和 59'C的12個溫度梯度，對松材線蟲基因組DNA進行PCR擴增，實 驗結果表明在52.2。C與53.7'C時的PCR產量最大，因此本發明優選 53"C作為PCR擴增的退火溫度；
b. PCR擴增體系中鎂離子濃度的優化在25pL的PCR擴增反應 體系中，采取1.5mmolL-1、 2.0mmolL"、 2.5mmolL"、 3.0mmolL"、 3.5 mmolL/1和4.0 mmolU1共6個梯度的鎂離子濃度，對松材線蟲基 因組DNA進行PCR擴增，實驗結果表明當鎂離子濃度為3.0 mmolL-1時PCR擴增產物的產量最大，因此本發明的PCR擴增反應體系中鎂
離子濃度優選3.0 mmolL"。
上述步驟(2)中，PCR擴增結束后，將擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，若在403處出現特異性條帶，則為 陽性結果，說明待測樣品中，反之則為陰性結果。
本發明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物可制備成 快速檢測試劑盒，從而使得馬尾松病死木中松材線蟲的檢測更加快 速、便利。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1. 本發明的馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物對馬尾 松病死木中的松材線蟲具有高度的特異性，能夠將松材線蟲與松材線 蟲近緣的線蟲區分開，能將松材線蟲與馬尾松松木、馬尾松松木中其 他12種線蟲區分開，還能將松材線蟲與馬尾松松木中常見的真菌和 細菌區別開來；
2. 由于松材線蟲病的復雜性，如何快速、有效地從病木中檢測 出松材線蟲， 一直是松材線蟲病鑒定的難點，本發明提供一種無需從 病木中分離松材線蟲，直接對病木中松材線蟲進行PCR擴增的方法， 節省了分離時間，提高了檢測效率；
3. 對PCR技術來說，引物的涉及和模板的質量一直是影響PCR 成功的兩大關鍵因素，本發明不但涉及得到針對馬尾松病死木中的松 材線蟲具有高度特異性的引物，還提供了一種從馬尾松病死木中制備 PCR所需DNA模板的方法，該方法是直接將病木進行液氮研磨后，經過WLB和蛋白酶K的兩次裂解，用3S柱純化后，得到了可用于 PCR擴增的DNA模板，擴增效率達到100%，不但DNA模板的制備 方法比現有方法簡單，而且模板的質量也有很大提高；
4. 本發明提供的檢測方法簡單高效，通過特異性檢測引物，通過 簡單的PCR，可方便地檢測馬尾松病死木中的松材線蟲；
5. 采用本發明的特異性檢測引物可制備相應檢測試劑盒，從而使 得檢測更加簡單程序化，成本低、方法特異性強，敏感性高，結果判 定客觀，準確性高，有利于大規模推廣；
6. 本發明對PCR擴增條件進行了優化，選擇退火溫度為53°C， MgCl2的濃度為3.0 mmolL—1，從而可提高整個PCR反應的特異性， 取得更好的檢測效果。


圖1為松材線蟲、馬尾松松木和擬松材線蟲的特異性檢測電泳
其中，M為Marker, 1 3為松材線蟲，4~6為擬松材線蟲，7~8 為馬尾松松木；
圖2為松材線蟲與馬尾松松木中其他12種線蟲的特異性檢測電 泳其中，M為Marker, 1為松材線蟲，2為擬松材線蟲 ， 3為奇異傘真滑刃線蟲(及a&mms)， 4為小角傘 滑刃線蟲(及coweo/w)， 5為來氏傘滑刃線蟲(及/eo"/)， 6為湖南傘 滑刃線蟲(5./mwa"e"w;s)， 7為畸剌傘滑刃線蟲(及teratos^^/ani)，8為紅松滑刃線蟲Uj^e/ewc/2o/(i^ mw'mosO 9為斯坦納長尾滑刃線 蟲(5Wm/ra他/"en')， 10為小蓬線蟲(Z)一e"c/m戶arras)， 11為劍 尾齒桿雙胃線蟲(CWor/za6卻/oga他r x一ocaMcfoto ) ， 12為小桿線蟲 (i /2aZ^///6^ w)， 13為寄生小桿屬線蟲(尸arawYoAaZ^/泡w)， CK 為陰性對照ddH20;
圖3為松材線蟲與馬尾松松木中常見真菌的特異性檢測電泳圖； 其中，M為Marker, 1為木霉屬真菌(7Hc/zo&rma spp. )， 2為 青霉屬真菌(i^"/cz'〃/wm spp. )， 3為炭疽病屬真菌(Co〃etofn'c/2wm spp.)， 4為擬盤多毛孢屬(Pasto/o/Zo/w^ w)， ck+為松材線蟲，ck-為ddH20;
圖4為松材線蟲與馬尾松松木中常見細菌的特異性檢測電泳圖； 其中，M為DNAMaker ， 1為蠟質芽孢桿菌(Sac/〃w;y cewus)， 2為解淀粉芽孢桿菌(5ac/腸調少/。/—咖c/冊)，.3為炭疽芽孢桿菌 (5ac/〃ws aw/Zzracz^), 4為矢旦矢豆芽f包桿菌(5rev/Z ac/〃ws 6rev/s)， 5為 蘇云金芽孢桿菌(5acZ〃ws AwW"g/era^ ) ， 6為熒光假單孢 (i^ewt/om^7770"as^/7worasce"/)， 7為枯草芽孢木干菌(5ac/〃z^ sw6/77/s)， 8為腸桿菌屬(觀)，9為施氏葡萄球菌(5"鄉/^/ococ譜 sa/ raj: /2,'cMS)， 10為微桿菌(M/cra6acfeWww ms7'他ra)， ck+為松材 線蟲，ck-為ddH20;
圖5為DNA模板制備過程中不同配比裂解液裂解擴增效果電泳
其中，M為Marker, 1~4為WLB裂解液32|iL與蛋白酶K4)iL，5~8為WLB 100^iL與蛋白酶K8j^L，9 12為WLB 200pL與蛋白酶K
L;
圖6為不同退火溫度對PCR擴增影響電泳其中，M為Marker, 1 12分別是退火溫度為47°C、 47.6°C、
48.2°C、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7°C、 55.1。C、 56.6°C、 57.8°C、
58.4。C和59°C;
圖7為鎂離子濃度對PCR擴增體系的影響電泳其中，M為Marker, 1 6分別是鎂離子濃度為1.5mmolL'1、 2.0
mmo11/1、 2.5 mmo11/1、 3.0 mmolL誦1、 3.5 mmolL"禾口 4.0 mmo11/1。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步地描述，但具體實施例并 不對本發明做任何限定。
實施例l本發明引物特異性試驗
1. 制備引物通過基因合成公司合成馬尾松病死木中松材線蟲的
特異性檢測引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示。引物放在-20冰箱中 保存。
2. PCR擴增
PCR擴增反應體系10xPCRbuffer 2.5^1 (Mg2+ free), dNTP(2.5 mmol-I/1) 2pl， Mg2+ (25mmol'L1) 3^1，弓I物P1 (10(iM)禾口 P2 (10)iM)各ljil， TaqDNA聚合酶5U'y10.125^11，模板DNA2pl， 滅菌雙蒸水補充至總體積25^1。
12PCR擴增反應條件94"C預變性3min; 94。C變性45s， 53'C退火 30s， 72。C延伸lmin， 35個循環后，最后72'C延伸5min。
3. 馬尾松病松木制備DNA模板
將采回實驗室的病木，分割成底面積為0.5cmx0.5cm、厚度為 0.02cm的薄木片，放入滅菌的1.5mL的離心管中，液氮中做稍許研 磨，后加入200iiLWLB(2.5mmo1 'I/1 DTT， 1.125% Tween20， 0.025 % Gelatin， 125 mmol L-1 KC1， 25 mmol I/1 Tris-HCl (pH 8.0)， 3.75mmo1 L"MgCl2 )，然后在水浴中完成溫度循環95。Cl5min， 65。C2min，兩個循環，加入10pL蛋白酶K (20 mg'mL")，后65。Clh， 95。C15min。裂解后的DNA提取液經過3S柱進行純化，吸取2pL做 模板。
4. 松材線蟲、馬尾松松木和擬松材線蟲的特異性檢測 將用現有方法已經鑒定的，松材線蟲、擬松材線蟲和健康馬尾松
松木作為檢測原料，分別制備后續PCR擴增所需模板。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴增體系和反應條件，分別對三種材料的DNA進行 PCR擴增，擴增產物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察電泳結果， 如圖1所示。
從圖1中可以看出，在約500bp處出現特異性條帶(403bp)而 其余泳道均未出現特異性條帶，由此說明本發明的特異性引物可以將 松材線蟲與擬松材線蟲以及馬尾松松木區分開來。5. 松材線蟲與馬尾松松木中其他12種線蟲的特異性檢測 選擇已知的馬尾松松木中12種線蟲擬松材線蟲(及聽m 加^
、奇異傘真滑刃線蟲(及Wwrara)、小角傘滑刃線蟲(及comeo/w s)、來氏傘滑刃線蟲(及/eow')、湖南傘滑刃線蟲(及/m"fl"m^)、畸 刺傘滑刃線蟲(及terato^/cw/an^)、紅松滑刃線蟲(v4j^e/e"c/zoW^ r m/"cw')、斯坦納長尾滑刃線蟲(&z'm^ra We/wen')、小蓮線蟲(D〖&/ 戶arvws)、..金U尾齒禾干雙胃線蟲(CWw/^Znii^/ogaWer xi(p/zocaw(i a^s)、小桿線蟲(i /^6o^Wa 和寄生小桿屬線蟲(Paras/tor/za6d 他《sp)。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴增體系和反應條件，分別對松材線蟲以及上述12種 線蟲進行PCR擴增，擴增產物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀 察電泳結果，如圖2所示。
從圖2中可以看出，只有松材線蟲出現特異性條帶(403bp)，而 其余12種線蟲以及陰性對照都沒有出現特異性條帶，由此說明本發 明的特異性引物可以將松材線蟲與馬尾松木中其余12種常見線蟲區 分開來。
6. 松材線蟲與馬尾松松木中常見真菌、細菌的特異性檢測 選擇己知的馬尾松病木中常見的木霉屬真菌、青霉屬真菌、炭疽
病屬真菌和擬盤多毛孢屬真菌等4種真菌，以及蠟質芽孢桿菌、解淀 粉芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單孢、枯草芽孢桿菌、腸桿菌屬、施氏葡萄球菌和微桿菌等10種 細菌。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴增體系和反應條件，分別對松材線蟲以及上述木霉 屬真菌、青霉屬真菌、炭疽病屬真菌和擬盤多毛孢屬真菌等4種真菌 進行PCR擴增，擴增產物一起跑瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察電 泳結果，如圖3所示。
采用上述合成的特異性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR擴增體系和反應條件，分別對松材線蟲以及上述蠟質 芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、蘇云金 芽孢桿菌、熒光假單孢、枯草芽孢桿菌、腸桿菌屬、施氏葡萄球菌 和微桿菌等IO種細菌進行PCR擴增，擴增產物一起跑瓊脂糖凝膠電 泳，紫外光下觀察電泳結果，如圖4所示。
從圖3和圖4中可以看出，只有松材線蟲出現特異性條帶 (403bp)，而實驗中的4種真菌和10種細菌以及陰性對照都沒有出 現特異性條帶，由此說明本發明的特異性引物可以將松材線蟲與馬尾 松木常見的真菌、細菌區分開來。
由本實施例的三個特異性檢測試驗可以看出，本發明的馬尾松病 死木中松材線蟲的特異性檢測引物具有很高的特異性，能夠將松材線 蟲和馬尾松木、馬尾松木中常見的其他線蟲以及真菌、細菌區分開來，從而保證了本發明檢測方法的準確性和特異性。
實施例2馬尾松病死木制備DNA模板
本實施例對馬尾松病死木制備DNA模板時，所需要的WLB和 蛋白酶K兩種裂解液的量進行一個優化。
采用馬尾松病死木制備DNA模板，若采用2mg的馬尾松病死木 較難擴增出目的片段，因此采用5mg的馬尾松病死木進行試驗。
制備WLB裂解液，配方為含有2.5 mmol 二硫蘇糖醇、1.125 %吐溫-20、 0.025%明膠、125醒olL"KCl、 25 mmol L" Tris畫HCl (pH8.0)和3.75mmolL"MgCl2。
蛋白酶K為市售。
本實施例采取三種裂解液(O WLB裂解液32pL與蛋白酶K 4jiL; (2) WLB 100^iL與蛋白酶K8^iL; (3) WLB 200pL與蛋白酶K 10pL，將這三種裂解液分別進行如下DNA模板制備的操作
將5mg的馬尾松病死木放入滅菌的1.5mL的離心管中，液氮中 做稍許研磨后，加入WLB水浴中完成溫度循環95'C15min， 65°C2min，兩個循環，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95'Cl5min， 得到DNA裂解液，再經3S柱純化后得到所需DNA模板。
將所得到的三種DNA模板，采用實施例1的特異性引物，PCR 擴增體系和擴增條件進行后續的PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳檢測，電泳結果如圖5所示，裂解液配方(2)和(3)都能取 得較好的效果，其中以配方(3)最好，因此本發明在制備DNA模板 時，采用100ji1 200ji1WLB和8^d 10pl蛋白酶K (20mgTiir1)進行裂解，優選200pl WLB和10^1蛋白酶K (20mg'mr1)。 實施例3 PCR擴增條件的優化
本實施例對PCR擴增中退火溫度和鎂離子濃度進行優化。 l.退火溫度的優化
以47。C、47.6。C、48.2。C、49.4。C、 50.8°C、 52.2°C、 53TC、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和59。C為溫度梯度，對松材線蟲基因組DNA 進行PCR擴增，PCR擴增結果如圖6所示，這12個測試的溫度都能 擴增出清晰的條帶，其中以52.2"C與53.7'C時的PCR產量最大，因 此本發明的退火溫度優選53 °C 。 2.鎂離子的優化
在25pL的PCR擴增反應體系中，采取1.5mmolL'1、 2.0mmolL'1、 2.5 mmolL-1、 3.0 mmolL"、 3.5 mmolU1和4.0 mmolL-1共6個梯度的 鎂離子濃度，對松材線蟲基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增結果 如圖7所示，6個梯度的鎂離子濃度均有擴增條帶，其中，以鎂離子 濃度為3.0 mmolL'1時產量最大，因此本發明的鎂離子濃度優選3.0 mmolL-1 。
17馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物、檢測方法及其應用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>華南農業大學
<120>馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物、檢測方法及其應用
<130>
<160> 2
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 23
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 1
ctacgtgctg ttgttgagtt ggc 23
<210> 2
<211> 20
<212> 腿 <213>人工序列
<400> 2
tggtgcctaa cattgcgcga 20
權利要求
1、一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2、 一種馬尾松病死木中松材線蟲的檢測方法，其特征在于該方 法包括如下步驟(1) 將馬尾松病死木經液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中95 'C15min， 65"C2min進行溫度循環，重復一次溫度循環后加入蛋白酶 K，水浴中65"Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，將該DNA裂解 液純化后則制備得到DNA模板；所述WLB裂解液含有2.5 mmolL" 二硫蘇糖醇、1.125 %吐溫-20、0.025 %明膠、125 mmolL" KC1、25 mmol L" pH 8.0的Tris-HCl和3.75 mmol L-1 MgCl2;(2) 用權利要求1所述特異性檢測引物采用常規PCR技術進行擴增；(3) 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光下觀察特異性擴增條 帶，即可實現馬尾松病死木中松材線蟲的檢測。
3、 根據權利要求2所述檢測方法，其特征在于所述步驟(l)中， 馬尾松病死木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量為5mg的馬尾松病 死木采用lOOjil ~200^il的WLB裂解液和8pl l(^l蛋白酶K進行裂 解；所述蛋白酶K的濃度為20mg'mr1。
4、 根據權利要求3所述檢測方法，其特征在于所述馬尾松病死 木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量為5mg的馬尾松病死木采用200pl的WLB和lO(il蛋白酶K進行裂解；所述蛋白酶K的濃度為20 mg.mri 。
5、 根據權利要求2所述檢測方法，其特征在于所述步驟(1)中， DNA裂解液的純化采用3S柱。
6、 根據權利要求2所述檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中， PCR擴增的退火溫度為47°C~59°C。
7、 根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于所述PCR擴增的 退火溫度為53'C。.
8、 根據權利要求2所述檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中， PCR擴增體系中鎂離子的濃度為1.5mmolL'1 4.0 mmolL—1。
9、 根據權利要求8所述檢測方法，其特征在于所述PCR擴增體 系中鎂離子的濃度為3.0mmolU1。
10、 權利要求1所述馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物 在制備馬尾松病死木中松材線蟲的快速檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開一種馬尾松病死木中松材線蟲的特異性檢測引物、檢測方法及其應用，該特異性檢測引物其上游引物的核苷酸序列如SEQID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明的引物能將松材線蟲與馬尾松松木、馬尾松木中其他12種線蟲，以及馬尾松木中常見的4種真菌和10種細菌區別開來。本發明還提供一種無需從病木中分離松材線蟲，直接對病木中松材線蟲進行PCR擴增的方法，將病木液氮研磨后，經WLB和蛋白酶K兩次裂解，純化后得到PCR擴增用DNA模板，擴增效率達到100％，節省了分離時間，提高了檢測效率。本發明的檢測方法簡單高效，準確性高、特異性高，可制備成試劑盒進行大規模推廣。
文檔編號C12N15/11GK101586160SQ20091004039
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者孔祥超, 朱孝偉, 王新榮, 紀春艷, 胡月清, 賈文慧, 鐘填奎 申請人:華南農業大學