專利名稱：一種¹³C穩定性同位素標記纖維素的制備方法
技術領域：
本發明涉及穩定性同位素標記化合物生產領域，尤其涉及采用微生物發酵制備13c 穩定性同位素標記纖維素高分子聚合物的方法。
背景技術：
自然界的纖維素絕大部分是由植物產生的，少數微生物也能合成纖維素，微生物 合成的纖維素與天然纖維素結構非常相似，都是由葡萄糖以0-1，4_糖苷鍵連接而成的 高分子化合物。能夠合成纖維素的微生物種類很多，主要有醋酸桿菌屬(AcetobacteR)、 產堿菌屬(Alcaligenes)、八疊球菌屬(Sarcina)、根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、固氮菌屬(Azotobacter)和氣桿菌屬(Aerobacter)。其中比較典型的是醋 酸桿菌屬中的木醋桿菌(Acetobacter xylinus)，它具有很高的纖維素生產能力。通常采用化學方法合成穩定性同位素標記的化合物，利用生物法合成穩定性同位 素標記化合物的報道較少，中國專利公開了一種利用生物發酵法合成15N穩定性同位素標 記精氨酸(CN 1869244A)、15N標記亮氨酸(CN 101235402A)的方法等。但是，還未見有利用 微生物發酵合成并有效制備13C穩定性同位素標記纖維素的專利報道。利用微生物合成13C 穩定性同位素標記纖維素，13c容易標記且豐度高，工藝簡單，制備方便。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用微生物發酵合成并制備13C穩定性同位素標記纖維 素的方法。本發明所述的13C穩定性同位素標記纖維素的生產制備方法如下(1)選用菌株選取適用發酵生產細菌纖維素的醋酸桿菌屬，以木醋桿菌(Acetobacter xylinus)為代表。(2)發酵培養基以13C6葡萄糖為唯一碳源的M9基本培養基，其配方為磷酸氫二鈉5.0 7.0g/l， 磷酸二氫鉀 2. 0 4. 0g/l，氯化鈉 0. 5 1. 0g/l，氯化銨 1. 0 2. 0g/l，MgS04 '7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H2010 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。⑶靜置培養取1環活化好的斜面種子接入液體活化培養基，30°C振蕩培養24 36h，搖床轉速 為160rpm，作為預培養的種子。靜置培養前的預培養將上述種子接種13C6葡萄糖-M9液體培養基，接種量6 8%，28°C 30°C振蕩培養24 36h，搖床轉速為160 180rpm，作為靜置培養的種子。靜置培養將13C6葡萄糖-M9液體培養基活化的種子，接種13C6葡萄糖-M9液體培 養基，接種量6 8%，28°C 30°C靜置培養30d左右。靜置培養采用淺層培養的方法，95mm 直徑的滅菌扁燒杯盛有50 80ml 13C6葡萄糖-M9液體培養基，可換氣的培養用膜封口。
⑷分離提純將靜置培養獲得的13C穩定性同位素標記纖維素置于已預熱至60°C 80°C的蒸餾 水中，60°C 80°C振蕩洗滌20min 30min，搖床轉速為150 250rpm ；取出13C穩定性同 位素標記纖維素并置于已預熱至60°C 80°C的lmol/1的NaOH溶液中，60°C 80°C振蕩洗 滌20min 30min，搖床轉速為150 250rpm ；取出13C穩定性同位素標記纖維素并置于已 預熱至60°C 80°C的lmol/1的HAC溶液中，60°C 80V振蕩洗洚20min 30min，搖床轉 速為150 250rpm，重復三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩定性同位素標記纖維素，冷凍真空 干燥獲得產品。所述步驟(3)斜面培養基的配方為蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二 鈉 10g/l，葡萄糖 20g/l，瓊脂粉 15g/l，HAC 調 pH 6.0。所述液體活化培養基的配方為蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氫二鈉 10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 調 pH 6.0。
具體實施例方式以下將結合具體實施例，對本發明作進一步說明，目的在于幫助讀者更好地理解 本發明的精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。實施例1 使用木醋桿菌(Acetobacter xylinus)為出發菌株，使用的培養基包括斜面培養 基、液體活化培養基、13C6葡萄糖-M9液體培養基。各培養基的配方如下 斜面培養基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二鈉10g/l，葡萄糖20g/l， 瓊脂粉 15g/l，HAC 調 pH 6.0。液體活化培養基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二鈉10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 調 pH 6.0。13C6葡萄糖-M9培養基磷酸氫二鈉6. 8g/l，磷酸二氫鉀3. Og/1，氯化鈉0. 5g/l， 氯化銨 1. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l，CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 20g/l。取1環活化好的斜面種子接入液體活化培養基，30°C振蕩培養24 36h，搖床轉速 為160rpm，作為預培養的種子。將上述種子接種13C6葡萄糖-M9液體培養基，接種量6%， 30°C振蕩培養24 36h，搖床轉速為160rpm，作為靜置培養的種子。將13C6葡萄糖-M9液 體培養基活化的種子，接種13C6葡萄糖-M9液體培養基，接種量6%，30°C靜置培養30d。靜 置培養采用淺層培養的方法，95mm直徑的滅菌扁燒杯盛有80ml 13C6葡萄糖-M9液體培養 基，可換氣的培養用膜封口。培養過程中，當細菌纖維素膜厚度達5mm左右時，適度搖動培 養基，使細菌纖維素膜微浸入液體培養基中，繼續靜置培養。將靜置培養獲得的13C穩定性同位素標記纖維素置于已預熱至70°C的蒸餾水中， 70°C振蕩洗滌20min，搖床轉速為160rpm ；取出13C穩定性同位素標記纖維素并置于已預熱 至70°C的lmol/1的NaOH溶液中，70°C振蕩洗滌20min，搖床轉速為160rpm ；取出13C穩定 性同位素標記纖維素并置于已預熱至70°C的lmol/1的HAC溶液中，70°C振蕩洗滌20min， 搖床轉速為160rpm，重復三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩定性同位素標記纖維素，冷凍真空 干燥獲得產品。經同位素比率質譜儀分析得到的13C穩定性同位素標記纖維素產品，13C的 豐度達99%。
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實施例2 使用的菌種、培養基培養方式基本同實施例1。靜置培養采用淺層培養的方法， 95mm直徑的滅菌扁燒杯盛有50ml13C6葡萄糖-M9液體培養基，可換氣的培養用膜封口。培 養過程中保持靜置培養狀態不變。將靜置培養獲得的13C穩定性同位素標記纖維素置于已 預熱至80°C的蒸餾水中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉速為220rpm ；取出13C穩定性同位素 標記纖維素并置于已預熱至80°C的lmol/1的NaOH溶液中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉速 為220rpm ；取出13C穩定性同位素標記纖維素并置于已預熱至80°C的lmol/1的HAC溶液 中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉速為220rpm，重復三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩定性同位 素標記纖維素，冷凍真空干燥獲得產品。經同位素比率質譜儀分析得到的13C穩定性同位素 標記纖維素產品，13C的豐度達99%。
權利要求
一種13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，其特征在于，利用微生物發酵合成并制備13C穩定性同位素標記纖維素的方法。
2.權利要求1所述的13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，其特征在于，使用的微 生物為醋酸桿菌屬，木醋桿菌(Acetobacter xylinus)及突變菌株，使用菌株為常規菌種， 各菌種保藏中心均有保藏。
3.權利要求1所述的13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，其特征在于，發酵培養 基配方，13C6葡萄糖-M9培養基磷酸氫二鈉5. 0 7. Og/1，磷酸二氫鉀2. 0 4. Og/1，氯 化鈉 0. 5 1. Og/1，氯化銨 1. 0 2. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。
4.權利要求1所述的13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，其特征在于，28°C 30°C條件下靜置培養30d，培養過程中，當細菌纖維素膜5mm左右厚時，適度搖動培養基，使 細菌纖維素膜微浸入液體培養基。靜置培養的種子需要經過13C6葡萄糖-M9液體培養基活 化預培養，培養溫度28°C 30°C。
5.權利要求1所述的13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，其特征在于，60°C 80°C酸堿交替洗滌，每次作用20min 30min，搖床轉速為150 250rpm。提純的13C穩定 性同位素標記纖維素經冷凍干燥得到最終產品。
全文摘要
本發明公開一種13C穩定性同位素標記纖維素的制備方法，該方法包括以下步驟(1)選用細菌纖維素高產木醋桿菌為出發菌株；(2)13C6葡萄糖-M9培養基用作發酵培養基；(3)30℃左右靜置培養30d；(4)80℃左右酸堿交替洗滌、分離提純細菌纖維素，最后經冷凍干燥得到13C穩定性同位素標記纖維素。本發明工藝簡單，設備要求不高，方便在實驗室條件下制備13C高豐度的13C穩定性同位素標記纖維素產品。
文檔編號C12P19/04GK101824445SQ20091007930
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月6日 優先權日2009年3月6日
發明者呂迪, 呼慶, 莊國強, 白志輝, 馬安周 申請人:中國科學院生態環境研究中心