專利名稱：一種降解辛硫磷農藥的微生物制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物利用技術領域，尤其涉及一種可高效降解有機磷農藥的菌株和
利用該菌株制備而成的菌劑及該菌劑的制備方法。
背景技術：
我國現在每年農藥總產量已達50萬噸，迄今為止，我國農藥的積累用量已達400 多萬噸。殺蟲劑占所有農藥的70%以上，其中高毒的有機磷殺蟲劑又占所有殺蟲劑的70% 以上，即高毒的有機磷殺蟲劑占整個農藥市場的50%以上。在年產量萬噸以上的6個殺蟲 劑品種中，有5個是有機磷殺蟲劑。從目前農藥使用情況看，高毒農藥使用量大，使用次數 頻繁是造成某些食品，特別是蔬菜、水果農藥殘留超標的主要原因。對于毒性低的農藥，若 用量大或使用不當也同樣可造成對某些食品的污染。 有機磷農藥(OPs)在殺蟲劑中占據重要的地位，是世界上生產和使用最多的農藥 品種，我國的有機磷農藥在殺蟲劑中占70% ，近幾年經調整有所下降，但仍然是控制農作物 害蟲和病蟲媒昆蟲的重要手段。然而，由于有機磷農藥的毒性，隨著廣泛使用，也帶來嚴重 的副作用，日益成為重要的化學環境污染物。有證據表明，OPs具有誘變性和致畸胎性，哺 乳動物的神經和免疫系統疾病大多與OPs相關，這些疾病包括瘋牛病、海灣戰爭綜合癥、帕 金森綜合癥等。如何消除有機磷農藥殘留對環境和人類的危害，已成為事關人類健康和國 民經濟發展的問題。 微生物降解被認為是消除有機磷農藥殘留的一種有效措施，一直是國內外學者研 究的熱門方向。利用生物或生物產品來降解污染物的生物修復方法具有無毒、無殘留、無二 次污染等優點，是消除和解毒高濃度農藥殘留的一種安全、有效、廉價的方法。但現有的降 解有機磷的微生物存在生長緩慢，缺少競爭優勢，降解性能不穩定等問題。細菌由于其具生 化上多種適應能力以及容易誘發突變，從而在降解農藥的微生物中占有主要的地位，尤其 是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的菌株降解能力較強。
發明內容
本發明目的是，針對目前微生物降解技術中所存在的缺少生長快、培養簡單、能高
效降解有機磷農藥殘留微生物菌種的現狀，提供一種生長速度快、培養方法簡單、能高效、
穩定降解辛硫磷等有機磷類農藥的菌株，并利用該菌株生產用于治理有機磷類農藥引起的
土壤、農作物及其產品污染的菌劑及該菌劑的制備方法。 本發明目的通過以下技術方案得以實現。 本發明所提供的微生物是一株命名為Y幾-l的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌 株，該菌株通過以下培養、分離、篩選而得到 1)我們取2007年10月在杭州農藥廠污水處理池中采集的活性污泥2g，加入 100ml富集培養基中，該培養基的配方為NaCl 0. 5-1. 5g/L，琴030. 5-1. 5g/L， K2HP04 1. 0-2. Og， KH2P04 0 . 3-0 . 8g/L， MgS04 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母提取物0. 05-0. 2g/L，調
3pH7. 0-7. 2后，按50-100mg/L添加辛硫磷，于28-37°C， 120-180rpm搖床培養；
2)上述培養液每1-2周轉接移種一次，以5_10%的接種量接入新鮮培養基中，如 此馴化3-6個月；將最終的培養菌液用平板稀釋法進行細菌分離，從中獲得生長快、菌落規 則的單菌落30多個； 3)將單菌接入LB試管中培養后，加入含50-100mg/L辛硫磷的無機鹽培養基中，3d 后檢測辛硫磷含量，經過降解性能驗證，篩選得到降解率最高的菌株(編號為X-l)，經生理 生化鑒定，確定該菌株屬假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，命名為Y幾-l ;保存于LB斜面或 甘油凍存管中，使用時在含辛硫磷的培養基上進行活化；該菌株的主要特征為革蘭氏陰 性、無芽孢的桿狀菌，菌落為淡黃色，邊緣規則，表面光滑，無褶皺，好氧，化能異樣，氧化酶 陰性、接觸酶陽性；最適生長溫度為28-3(TC，最適生長pH為7. 0_7. 2，在無機鹽培養基中以 (100mg/L)辛硫磷為唯一碳源生長，3-5天降解率達90-95% ; 該菌已于2009年7月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏編號為CGMCC No. 3211。 —種降解辛硫磷農藥的微生物菌劑，該菌劑可以LB為斜面或液體培養基，以 NaCl 0. 5-1. 5g/L， NH4N03 0. 5—1. 5g/L， K2HP04 1. 0—2. 0g， KH2P04 0 . 3—0 . 8g/L， MgS04 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母提取物0. 05-0. 2g/L，調pH7. 0_7. 2為無機鹽培養基；以葡萄糖5-15g/L， 酵母膏l-2g/L， (NH4)2S041. 0-2. Og/L， NaClO. 5-lg/L為發酵培養基；以保藏編號為CGMCC No.3211的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) Y幾-l菌株為菌種，經活化、擴增及菌劑發酵制 備而獲得。 —種降解辛硫磷農藥微生物菌劑的制備方法，該方法按以下步驟進行
1)各種培養基的配制包括①LB培養基2. 5-7. 5g/LNaC1，2. 5-7. 5g/L酵母膏，5-15g/L蛋白胨；
②無機鹽培養基NaCl 0. 5-1. 5g/L， NH4N03 0. 5—1. 5g/L， K2HP04 1. 0—2. Og/L， KH2P04 0 . 3-0 . 8g/L， MgS04 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母提取物0. 05-0. 2g/L，調pH7. 0-7. 2 ;
③發酵培養基葡萄糖5-15g/L，酵母膏l-2g/L， (NH4)2S041. 0-2. Og/L， NaClO. 5-lg/L ; 2)菌種的制備將保藏編號為CGMCC No. 3211的Y幾-l菌株接種于LB斜面上， 30-35t:培養18-24h，斜面保存于0-4t:冰箱中冷藏、備用；或將Y幾-l菌株接種于LB試管 中，120-180rpm振蕩，30-35。C培養18-24h，將菌液加入50-70%的甘油中，-40°C至_80°C低 溫保存、備用； 3)菌種的活化從LB斜面或甘油凍存管中劃線至固體LB平板中，30-35。C活化 培養18-24h ;將活化后的單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷，30-35t:， 120-180rpm搖床培養至對數生長期；將上述培養液離心，用pH7. 0_7. 2磷酸緩沖液(PSB) 清洗后，以5-10%接種量加入含50-100mg/L辛硫磷的無機鹽培養基中，30°C ， 150rpm搖床 培養，3d后檢測辛硫磷濃度，當降解率達到90X以上時，作為菌種使用；
4)搖瓶菌種擴增按照步驟(3)的方法將菌體培養至對數生長期，按5-10%的接 種量接入100mlLB培養基中，在pH7. 0_7. 2，搖床轉速120-150rpm下培養18-24h，菌液直接
用于接種或o-4t:冰箱中冷藏、備用； 5)菌劑發酵將步驟(1)發酵培養基加入發酵罐中，罐內溫度12rC保持30分鐘后，保壓至0. 02-0. 18MPa之間，進行蒸汽高溫滅菌后冷卻至30_35°C ;在火焰保護下迅速通 過接種閥門向種子罐內接入步驟(4)搖瓶菌種，接種量為5-10%;攪拌機轉速為110-220轉 /分，溫度30-35°C ，通氣量2-4m3/h，罐壓0. 02-0. 18MPa，pH自然，培養18-24小時至菌體數 達到108個/ml以上，發酵菌液灌裝于無菌塑料瓶中即成菌劑產品，直接應用或于室溫下保 存。 本發明菌劑在應用時，將菌劑稀釋500-1000倍，噴施于土壤、作物或農產品上，即
可對上述物體上的辛硫磷農藥殘留進行有效的降解。 本發明的有益效果 1、本發明分離、篩選得到的假單胞菌屬Y幾-1菌株，在目前已報道的有關降解辛 硫磷的細菌中尚屬首次，該菌株降解辛硫磷性能強而穩定，不僅可在三角瓶中降解，還可以 降解殘留于土壤、農作物和農產品上的辛硫磷，降解效率高達80-90% (見實施例4、5、6);
2、Y幾-l菌株具有活力強，生長速度快，培養方法簡單，降解能力穩定，環境適應能 力強等優勢，在LB培養基中只需培養18-24h就可以收獲，適合用于對土壤等自然環境與農 產品農藥殘留的修復(見實施例1、2、3); 3、該菌有望在減少農產品農藥殘留，降解土壤環境中農藥殘留中得到推廣應用， 在環境污染治理和保護人們身體健康方面發揮作用。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明作更詳細的說明，但以下實施例僅是說明性的，本發明 并不受這些實施例的限制。
實施例1 :(降解辛硫磷農藥微生物制劑制備1) 按以下步驟進行 1)各種培養基的配制包括 ①LB培養基2. 5g麵Cl ， 7. 0g/L酵母膏，5g/L蛋白胨； ②無機鹽培養基NaCl 0. 5g/L， NH4N031. 5g/L， K2HP041. 0g/L， KH2P040 . 8g/L， MgS04 7H20 0. 2g/L，酵母提取物0. 2g/L，調pH7. 0 ; ③發酵培養基葡萄糖10g/L，酵母膏lg/L， (NH4)2S042. Og/L， NaCl 0. 5g/L ;
2)菌種的制備將保藏編號為CGMCC No. 3211的Y幾-l菌株接種于LB斜面上， 3(TC培養24h，斜面保存于Ot:冰箱中冷藏、備用； 3)菌種的活化從LB斜面中劃線至固體LB平板中，3(TC活化培養24h ;將活化后 的單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷，35t:， 180rpm搖床培養至對數生長 期；將上述培養液離心，用pH7. 0-7. 2磷酸緩沖液(PSB)清洗后，以5%接種量加入含50mg/ L辛硫磷的無機鹽培養基中，30°C ， 150rpm搖床培養，3d后檢測辛硫磷濃度，當降解率達到 90%以上時，作為菌種使用； 4)搖瓶菌種擴增按照步驟(3)的方法將菌體培養至對數生長期，按10%的接種 量接入100mlLB培養基中，在pH7. 0_7. 2，搖床轉速150rpm下培養18h，菌液直接用于接種
或o-4t:冰箱中冷藏、備用； 5)菌劑發酵將步驟(1)發酵培養基加入發酵罐中，罐內溫度12rC保持30分鐘 后，保壓至0. 02MPa，進行蒸汽高溫滅菌后冷卻至30-35°C ;在火焰保護下迅速通過接種閥門
5向種子罐內接入步驟(4)搖瓶菌種，接種量為5%;攪拌機轉速為110轉/分，溫度35t:，通 氣量2mVh，罐壓0. 18MPa，pH自然，培養18小時，發酵菌液灌裝于無菌塑料瓶中即成菌劑產 品，直接應用或于室溫下保存；經菌落計數檢測，培養好的菌液中菌體數達到108個/ml以 上。 實施例2 :(降解辛硫磷農藥微生物制劑制備2) 本例中，步驟1)各種培養基的配制為①LB培養基4. 5g/LNaC1，4. Og/L酵母膏， 10g/L蛋白胨；②無機鹽培養基NaCl 1. Og/L， NH4N031. Og/L， K2HP041. 5g/L， KH2P040. 5g/L， MgS04 7H20 0. 3g/L，酵母提取物0. 05g/L，調pH7. 1 ;③發酵培養基葡萄糖5g/L，酵母膏
1. 5g/L， (NH4)2S041. 5g/L， NaCl 0. 75g/L ; 步驟2)菌種的制備將YJL-l菌株接種于LB試管中，180rpm振蕩，3(TC培養21h， 將菌液加入60%的甘油中，-S(TC低溫保存.備用； 步驟3)菌種的活化從LB甘油凍存管中劃線至固體LB平板中，33t:活化培養 21h ;將活化后的單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷，30°C ， 150rpm搖床 培養至對數生長期；將上述培養液離心，用PH7. 0-7. 2磷酸緩沖液(PSB)清洗后，以7%接 種量加入含100mg/L辛硫磷的無機鹽培養基中； 步驟4)搖瓶菌種擴增按8%的接種量接入100mlLB培養基中，在pH7. 0_7. 2，搖 床轉速135rpm下培養21h ; 步驟5)菌劑發酵發酵罐中保壓至0. lOMPa ;接種量為8% ;攪拌機轉速為150轉 /分，溫度30。C，通氣量3mVh，罐壓0. 02MPa，pH自然，培養21小時; 其余步驟、工藝同于實施例1。經菌落計數檢測，培養好的菌液中菌體數達到108 個/ml以上。 實施例3 :(降解辛硫磷農藥微生物制劑制備3) 本例中，步驟1)各種培養基的配制為①LB培養基7. 5g/LNaC1，2. 5g/L酵母膏， 15g/L蛋白胨；②無機鹽培養基NaCl 1. 5g/L， NH萬O. 5g/L， K2HP042. Og/L， KH2P04 0. 3g/ L，MgS04 *7H20 0. lg/L，酵母提取物0. lg/L，調pH7. 2 ;③發酵培養基葡萄糖15g/L，酵母膏
2. Og/L， (NH4)2S041. Og/L， NaCl 1. Og/L ; 步驟2)菌種的制備將Y幾-1菌株接種于LB斜面上，35t:培養18h，斜面保存于
4t:冰箱中冷藏、備用； 步驟3)菌種的活化從LB斜面中劃線至固體LB平板中，35。C活化培養18h ;將活 化后的單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷，32°C ， 120rpm搖床培養至對數 生長期；將上述培養液離心，用pH7. 0-7. 2磷酸緩沖液(PSB)清洗后，以10%接種量加入含 75mg/L辛硫磷的無機鹽培養基中； 步驟4)搖瓶菌種擴增按5%的接種量接入100mlLB培養基中，在pH7. 0_7. 2，搖 床轉速120rpm下培養24h ; 步驟5)菌劑發酵發酵罐中保壓至O. 18MPa ;接種量為10%;攪拌機轉速為220轉 /分，溫度33t:，通氣量4mVh，罐壓0. lOMPa， pH自然，培養24小時； 其余步驟、工藝同于實施例1。經菌落計數檢測，培養好的菌液中菌體數達到108 個/ml以上。 實施例4 :(本發明有機磷降解菌對辛硫磷的降解效果試驗)
將活化后的Y幾-l菌株單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷， 30°C， 150rpm搖床培養24h ;將上述培養液離心，用磷酸緩沖液(pH7. 0-7. 2)清洗、離心2 次，再用磷酸緩沖液將菌體0D6。。調至0. 1-0. 2，以10%接種量加入含100mg/L辛硫磷的無 機鹽培養基中，28-30°C ， 120-150rpm搖床培養，3d后檢測辛硫磷濃度和0D6。。值，驗證降解 效果和菌體生長情況。經檢領"辛硫磷降解率在90%以上，菌體006。。達到0.6以上，說明 Y幾-l菌株對辛硫磷有很好的降解效果，并能利用辛硫磷生長。所述的LB液體培養基與無 機鹽培養基同于實施例1、2或3。 實施例5 :(本發明有機磷降解菌劑對青菜上辛硫磷殘留的降解) 試驗地點為浙江省農科院試驗基地，時間為2008年10月，各實驗小區面積為1
畝，對照與處理小區各3塊。在對照與處理的青菜葉面上均噴0. 5mg/mL的辛硫磷溶液，3d
后再在處理的青菜葉面上噴實施例1制備的Y幾-l菌劑稀釋液(約107mL) ，6kg/畝。至
噴后第3，7，15，21d時分別測定青菜中辛硫磷的含量(由農業部農產品質量監督檢驗測試
中心(杭州)檢測)。結果(表l)顯示，在使用Y幾-l菌劑后第2d青菜中有機磷比對照
有所下降，在第6d已下降到對照的50%左右，而到第14d時，與對照相比，處理已降解了約
70%，到第20d時，處理中辛硫磷的濃度已降到0. Olmg/kg以下，幾乎完全降解。 表1Y幾-1對青菜上辛硫磷的降解(辛硫磷殘留量mg/kg)
項目取樣時間(d)261420
對照0.2980.2240.1370.095
處理0.2050.1280.0350.006 實施例6 :(本發明有機磷降解菌劑對土壤中辛硫磷殘留的降解)
土壤取自浙江省農科院實驗田，土壤類型為黃棕壤，有機質含量14.5g/kg，含氮 1. 2g/kg，pH值7. 2，土壤含水量60-70%。選擇土壤中無辛硫磷農藥殘留的表層土，每個樣 品10kg 土壤，再在該土壤中人為添加辛硫磷濃度至50mg/kg，實施例1制備的Y幾-l菌液使 用量為107g干土。施菌后，分別于第7，14，20d測定土壤中辛硫磷的含量。結果顯示，在接 種Y幾-1的自然土壤中，辛硫磷的降解要比對照土壤中快得多，明顯地加快了農藥的降解。 在加菌7d后，對照土壤中辛硫磷只降解了 24.4X，而在接種Y幾-1的土壤中辛硫磷已降解 了 71 % 。到了第20d，接種Y幾-l的土壤中辛硫磷濃度已降到5mg/kg，而在對照土壤中辛硫 磷的濃度仍有24. 9mg/kg。顯然，Y幾-l加速了辛硫磷在自然土壤中的降解。
權利要求
假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)YJL-1菌株，其菌株保藏號為CGMCCNO.3211。
2. —種降解辛硫磷農藥的微生物菌劑，其特征在于該菌劑可以LB為斜面或液體培養基；以NaCl 0. 5-1. 5g/L， NH4N03 0. 5—1. 5g/L， K2HP04 1. 0—2. Og， KH2P040 . 3—0 . 8g/L，MgS04 *7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母提取物0. 05-0. 2g/L，調pH7. 0-7. 2為無機鹽培養基；以葡萄糖5-15g/L，酵母膏l-2g/L， (NH4)2S04 1. 0-2. 0g/L，NaC10. 5-lg/L為發酵培養基；以保藏編號為CGMCC No. 3211的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) ， Y幾-l菌株為菌種，經活化、擴增及菌劑發酵制備而獲得。
3. —種降解辛硫磷農藥微生物菌劑的制備方法，其特征在于按以下步驟進行(1) 各種培養基的配制包括① LB培養基2. 5-7. 5g/LNaCl，2. 5-7. 5g/L酵母膏，5-15g/L蛋白胨；② 無機鹽培養基NaCl 0. 5-1. 5g/L， NH4N03 0. 5—1. 5g/L， K2HP04 1. 0—2. 0g/L， KH2P04(0. 3-0. 8g/L， MgS04 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母提取物0. 05-0. 2g/L，調pH7. 0-7. 2 ;③ 發酵培養基葡萄糖5-15g/L，酵母膏l-2g/L， (NH4)2S04 1. 0-2. 0g/L， NaC10. 5_lg/L ;(2) 菌種的制備將保藏編號為CGMCC No. 3211的Y幾-l菌株接種于LB斜面上，30_35°C培養18-24h，斜面保存于0-4t:冰箱中冷藏、備用；或將Y幾-1菌株接種于LB試管中，120-180rpm振蕩，30-35。C培養18-24h，將菌液加入50-70%的甘油中，-40。C至-80。C低溫保存、備用；(3) 菌種的活化從LB斜面或甘油凍存管中劃線至固體LB平板中，30-35t:活化培養18-24h ;將活化后的單菌落接種于LB液體培養基中，加入100mg/L辛硫磷，30-35°C，120-180rpm搖床培養至對數生長期；將上述培養液離心，用pH7. 0_7. 2磷酸緩沖液清洗后，以5-10%接種量加入含50-100mg/L辛硫磷的無機鹽培養基中，30°C ， 150rpm搖床培養，3d后檢測辛硫磷濃度，當降解率達到90%以上時，作為菌種使用；(4) 搖瓶菌種擴增按照步驟(3)的方法將菌體培養至對數生長期，按5-10%的接種量接入100mlLB培養基中，在pH7. 0_7. 2，搖床轉速120-150rpm下培養18_24h，菌液直接用于接種或o-4t:冰箱中冷藏、備用；(5) 菌劑發酵將步驟(1)發酵培養基加入發酵罐中，罐內溫度12rC保持30分鐘后，保壓至0. 02-0. 18MPa之間，進行蒸汽高溫滅菌后冷卻至30_35°C ;在火焰保護下迅速通過接種閥門向種子罐內接入步驟(4)搖瓶菌種，接種量為5-10%，攪拌機轉速為110-220轉/分，溫度30-35t:，通氣量2-4mVh，罐壓0. 02-0. 18MPa， pH自然，培養18-24小時至菌體數達到108個/ml以上，發酵菌液灌裝于無菌塑料瓶中即成菌劑產品，直接應用或于室溫下保存。
全文摘要
本發明公開了一種降解辛硫磷農藥的微生物制劑及其制備方法，屬于微生物利用技術領域。本發明以篩選獲得的假單胞菌屬YJL-1菌株為菌種，保藏編號為CGMCC No.3211；經1)培養基的配制；2)菌種的制備；3)菌種的活化；4)搖瓶菌種擴增；5)菌劑發酵等步驟制備成菌劑產品。該菌劑使用時，稀釋500-1000倍噴施于土壤和農作物上，即可對殘留于土壤、農作物上的辛硫磷農藥進行降解，降解效率高達80-90％。本發明可在農業生產、農產品加工等部門推廣應用。
文檔編號C12N1/20GK101693883SQ200910153498
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月15日 優先權日2009年10月15日
發明者喻曼, 奚輝, 張棋, 景金富, 肖華, 薛智勇, 許育新, 陳喜靖 申請人:浙江省農業科學院;