本發(fā)明屬于水產(chǎn)飼料領(lǐng)域，涉及牛磺酸復(fù)合制劑在石斑魚飼料中的應(yīng)用，具體涉及石斑魚飼料中使用石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑降低石斑魚體脂沉積，提高機體抗氧化能力的作用。

背景技術(shù)：

隨著我國集約化、工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，各種不利的養(yǎng)殖環(huán)境條件和因子成為影響?zhàn)B殖魚類正常生長的重要制約因素。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中因養(yǎng)殖環(huán)境條件改變使養(yǎng)殖魚類處于應(yīng)激狀態(tài)而引起機體代謝機能低下、生產(chǎn)性能下降，甚至病害等現(xiàn)象發(fā)生，其中，最具代表性的一種病征是一種營養(yǎng)代謝性疾病——脂肪肝。病魚表現(xiàn)為生長速度、免疫力下降，易受病原感染而爆發(fā)疾病；此外，病魚的抗應(yīng)激能力也下降，抗高溫、高氨氮等不利環(huán)境因子應(yīng)激的能力較弱，時有大量死亡的病例報告，造成很大經(jīng)濟損失。雖經(jīng)多年防控實踐，但因缺乏對其發(fā)生機制的深入了解而不能有效遏制其發(fā)生。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，高脂低蛋白飼料對維持養(yǎng)殖環(huán)境與保護生態(tài)資源意義重大，是目前水產(chǎn)飼料發(fā)展的趨勢，但高脂飼料的應(yīng)用加劇了養(yǎng)殖魚類脂肪肝的發(fā)生，成為脂肪肝發(fā)生的主要誘因，因此，開發(fā)有效的魚類脂肪肝防控技術(shù)對于促進魚類健康養(yǎng)殖具有積極意義。

牛磺酸的化學(xué)名為2-氨基乙磺酸，是一種β含硫氨基酸，是動物體內(nèi)不參與蛋白質(zhì)合成的含量最多的游離氨基酸，也是一種具有多種生物活性功能的氨基酸，對于維持機體正常的生理功能起著至關(guān)重要的作用。目前牛磺酸全球總產(chǎn)量達5萬噸，我國生產(chǎn)量在4萬噸左右，主要用在功能性食品添加劑和傳統(tǒng)醫(yī)藥領(lǐng)域，如乳制品、飲料、保健品、醫(yī)藥品、化妝品等，用途廣泛。目前，雖然已有牛磺酸復(fù)合制劑出現(xiàn)，但主要是作為降血脂、降血糖等臨床應(yīng)用。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，牛磺酸是大多數(shù)養(yǎng)殖魚類的一種條件性必需氨基酸。飼料中補充適量牛磺酸可以促進大菱鲆、真鯛、斜帶石斑魚、羅非魚和牙鲆等魚類的生長，當(dāng)飼喂牛磺酸缺乏的飼料時，黃鰤魚、五條鰤、石斑魚、羅非魚的生長變得遲緩，黃鰤魚還出現(xiàn)綠肝綜合征。海水魚依賴牛磺酸的程度一般高于淡水魚。目前牛磺酸主要是作為營養(yǎng)物質(zhì)添加到飼料中以滿足養(yǎng)殖魚類正常生長發(fā)育需要，如外源補充牛磺酸可減輕因植物蛋白源大比例替代魚粉而引起的飼料適口性下降、牛磺酸含量不足等問題。此外，牛磺酸還用于仔魚生物餌料(如鹵蟲、輪蟲)的營養(yǎng)強化培養(yǎng)。然而，人們對牛磺酸的生物活性功能之于養(yǎng)殖魚類的生長發(fā)育、保健的作用仍缺乏深入了解，難以有效指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)，在使用上還缺乏一定的盲目性，進一步研究牛磺酸對養(yǎng)殖魚類的生物學(xué)功能對開發(fā)高效安全的水產(chǎn)飼料和飼料添加劑，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖持續(xù)健康發(fā)展具有積極意義。

近年來，人們對牛磺酸在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用進行了有益探索，提出了各種技術(shù)解決方案。

公開號為CN104012799A的發(fā)明專利申請公開了牛磺酸在制備低魚粉青魚用飼料中及制備青魚用抗擁擠應(yīng)激劑中的應(yīng)用，通過在低魚粉(魚粉5-10％)飼料中添加0.1％～0.4％的牛磺酸，可使肉食性魚類飼料中魚粉含量降低10％左右，并且可以提高魚類的抗擁擠應(yīng)激能力，其飼料成本可降低300元/噸以上。

公開號為CN104171648A的發(fā)明專利申請公開了一種促進魚類肝臟健康的飼料添加劑，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)100％計，由以下組分組成：膽汁酸15～20％，牛磺酸10～15％，β-葡聚糖10～15％，甘露寡糖8～12％，L-肉堿5～8％，膽堿6～10％，其余為填充物。本發(fā)明的促進魚類肝臟健康的飼料添加劑的添加量為飼料總質(zhì)量的0.1～0.2％。該發(fā)明能夠減少脂肪在魚類肝臟中的積累，提高魚類肝臟轉(zhuǎn)運脂肪的能力，減輕肝臟代謝負(fù)擔(dān)，改善魚體健康狀況和促進生長。

公開號為CN1281149C的發(fā)明專利申請公開了一種石斑魚誘食劑及其制備方法，該誘食劑的成分組成按重量比為：動物蛋白酶解物干粉70-85％、核苷酸2-10％、含硫化合物0.4-3％、復(fù)合氨基酸5-15％、甜菜堿2-20％、色素0.5-5％和抗氧化劑0.1-0.5％。該誘食劑能有效地吸引水產(chǎn)養(yǎng)殖動物攝食飼料，提高飼料利用率，促進生長，增強疾病抵抗力，提高成活率。

已公開的相關(guān)專利主要以牛磺酸與免疫增強劑或中草藥配伍來改善魚體肝功，增強免疫功能，但因這類產(chǎn)品過多強調(diào)了免疫促進作用，沒有考慮其免疫增強時效性，應(yīng)用時需要采取相應(yīng)的措施才能取得一定效果，使用技術(shù)難度大，操作復(fù)雜，長期連續(xù)使用還可能引起免疫抑制的潛在風(fēng)險。

綜上所述，目前提出了一些將牛磺酸作為飼料添加劑用于促進養(yǎng)殖魚類攝食與生長或增強機體免疫功能的技術(shù)方案，這些技術(shù)方案在一定程度上解決了現(xiàn)有技術(shù)的不足，但是，牛磺酸作為生物活性物質(zhì)在魚類的抗氧化和降脂等方面的作用還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種配方簡單、使用安全、能降低石斑魚體脂沉積、提高機體抗氧化能力的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述的能降低石斑魚體脂沉積、提高機體抗氧化能力的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑由以下重量份的原料組成：牛磺酸30-70份、丙氨酰谷氨酰胺10-40份、維生素C多聚磷酸酯2-6份、維生素E 1-5份、玉米淀粉4-19份。

作為優(yōu)選，所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑由以下重量份的原料組成：牛磺酸40-70份、丙氨酰谷氨酰胺10-30份、維生素C多聚磷酸酯2-4份、維生素E 1-3份、玉米淀粉4-15份。

更為優(yōu)選，所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑由以下重量份的原料組成：牛磺酸66份、丙氨酰谷氨酰胺20份、維生素C多聚磷酸酯3份、維生素E 2份、玉米淀粉9份。

所述石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑的用量為飼料重量的1-2％。

本發(fā)明所述牛磺酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生的必需營養(yǎng)物質(zhì)，有利于神經(jīng)細(xì)胞的增殖、存活以及神經(jīng)軸突的延長；牛磺酸還參與糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝，促進脂肪消化吸收，胰腺β細(xì)胞釋放胰島素，促進糖酵解，行駛信號分子作用，促進細(xì)胞生長和增殖。牛磺酸可作為內(nèi)源性細(xì)胞保護劑和抗氧化劑，穩(wěn)定細(xì)胞膜，維持細(xì)胞鈣離子穩(wěn)定和滲透壓調(diào)節(jié)，清除機體活性氧或增強機體抗氧化酶系統(tǒng)功能，維持胰島β細(xì)胞分泌功能和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常，并通過維持肝內(nèi)谷胱甘肽水平而發(fā)揮去毒保肝及預(yù)防脂肪肝的作用，保證體內(nèi)糖代謝和脂質(zhì)代謝的正常，預(yù)防高血脂、高血糖，動脈粥樣硬化引發(fā)的一系列組織細(xì)胞代謝紊亂和結(jié)構(gòu)損傷。此外，牛磺酸還可降低炎性因子水平，減輕炎性反應(yīng)。

本發(fā)明所述丙氨酰谷氨酰胺是2-氨基-5-羧基戊酰胺與谷氨酸作用生成的一種二肽，其溶解性好，穩(wěn)定性高，在體內(nèi)能夠迅速降解為谷氨酰胺，發(fā)揮谷氨酰胺的營養(yǎng)生理作用，可作為養(yǎng)殖動物生產(chǎn)中谷氨酰胺的有效替代品。作為谷氨酰胺的供體，丙氨酰谷氨酰胺為腸道粘膜細(xì)胞代謝細(xì)胞發(fā)育提供能量，維持腸道粘膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性，維持腸道免疫功能，改善腸道健康；可通過維持和增加細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平，增強機體抗氧化能力，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，維持臟器的正常功能；可促使淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的分化增殖，增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善機體代謝狀況和免疫功能。

維生素C多聚磷酸酯是維生素C的衍生物，是維生素C的一種穩(wěn)定型產(chǎn)品，在動物體內(nèi)經(jīng)酶解析出游離維生素C，發(fā)揮維生素C特有的營養(yǎng)生理功能，是在畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中的一種理想的營養(yǎng)物質(zhì)添加劑。維生素C可促進膠原蛋白的生物合成，維持骨骼和牙齒穩(wěn)固，還可有效清除組織細(xì)胞內(nèi)的自由基，阻止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的危害，保護肝臟解毒能力和維持細(xì)胞完整性及正常代謝功能。維生素C有利于組織創(chuàng)傷口的愈合，促進酪氨酸和色氨酸的代謝，促進膽固醇排泄，預(yù)防動脈硬化，增強機體對外界環(huán)境的抗應(yīng)激能力和免疫力。

維生素E是一種脂溶性維生素，又名生育酚，既是一種營養(yǎng)物質(zhì)，又是一種天然的抗氧化劑。維生素E可維持正常胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，提高機體胰島素敏感性，有效地調(diào)節(jié)血脂和血糖，同時維生素E能減輕機體細(xì)胞免受自由基的毒害，改善脂質(zhì)代謝，預(yù)防冠心病、動脈粥樣硬化。

玉米淀粉用作上述生物活性物質(zhì)的載體。

丙氨酰谷氨酰胺主要參與腸粘膜細(xì)胞的能量代謝，為腸粘膜細(xì)胞提供能量，維持腸細(xì)胞的正常代謝功能，而牛磺酸主要參與脂類代謝，促進脂肪消化吸收，并作為滲透壓調(diào)節(jié)劑維持正常的魚體組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，因此，腸粘膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定有利于牛磺酸、維生素C和維生素E的吸收和轉(zhuǎn)運，同時有利于牛磺酸在腸道內(nèi)與膽汁酸結(jié)合，促進脂肪的消化和吸收。維生素C和維生素E進入體內(nèi)后進一步發(fā)揮其各自的營養(yǎng)生理功能，維持正常的新陳代謝。

本發(fā)明首次使用牛磺酸與丙氨酰谷氨酰胺、維生素C多聚磷酸酯和維生素E進行配伍，不僅能改善腸道功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，而且能有效改善包括魚類肝組織在內(nèi)的多種組織的代謝功能，增強魚體蛋白質(zhì)、脂肪和糖代謝，改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，促進細(xì)胞生長和增殖，降低脂肪在組織中堆積，保護細(xì)胞代謝產(chǎn)生的各種自由基對魚體組織細(xì)胞的損害，從而維持魚體代謝穩(wěn)態(tài)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、在石斑魚飼料中使用本發(fā)明所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑，可促進石斑魚生長，并可以有效地降低魚體脂肪沉積及降低肝脂含量；

2、在石斑魚飼料中使用本發(fā)明所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑，可以有效地提高魚體抗氧化能力。

3、本發(fā)明所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑為粉劑，制備時，只需按配方稱取原料，再混勻即可。該制劑在飼料中的添加比例為1-2％，配制飼料時，直接添加，無需再對飼料配方做特別調(diào)整，操作簡單。

通過實施例2的驗證試驗可得本發(fā)明所述的石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑具有促進石斑魚生長和飼料轉(zhuǎn)化效率、降低肝體比、降低石斑魚體脂和肝脂沉積、可明顯提高斜帶石斑魚肝臟和血漿中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、血清抗氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力，同時明顯降低丙二醛含量的效果。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑制備

原料見表1；

表1各石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑所用原料表(重量份)

制備方法：按配伍稱取各原料，放入攪拌機中充分混合均勻，即得各石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑。

實施例2：

表2為基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分表。

表2基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分表

配制試驗飼料時，分別以1％、1.5％、2％的比例添加石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑(用石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑3配制)，同時相應(yīng)減少表2中微晶纖維素的比例。

以酪蛋白和明膠(4:1)作為蛋白源，魚油、豆油和大豆卵磷脂作為脂肪源，以玉米淀粉作為淀粉源，以結(jié)晶纖維素作為填充劑，配制一種不含牛磺酸復(fù)合制劑的基礎(chǔ)飼料(對照料)，然后，將石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑按1％、1.5％、2％比例添加到基礎(chǔ)飼料中同時相應(yīng)減少表2中微晶纖維素的比例，配制成兩種不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑添加比例的試驗料(飼料1、飼料2、飼料3)：酪蛋白、明膠和蝦粉用粉碎機粉碎后過60目篩網(wǎng)，根據(jù)飼料配方混合原料，加水適量水拌勻，用雙螺桿制粒機制成2.5mm的顆粒飼料。斜帶石斑魚幼魚在水族箱中暫養(yǎng)2周后，挑選健康無病、大小基本一致的幼魚隨機分配到12個有循環(huán)水裝置的養(yǎng)殖桶內(nèi)(150L)，每桶20尾。將12個圓桶隨機分成4個處理組，每組3個重復(fù)。

每天在8:30和18:30投喂，每次投喂至飽食。每次投喂半小時后用虹吸法收集剩料，隨后清污，清污后用新鮮過濾海水補足箱內(nèi)排掉的海水。養(yǎng)殖過程中，每天觀察和記錄斜帶石斑魚的攝食和行為活動，養(yǎng)殖周期56d。養(yǎng)殖期間用增氧泵持續(xù)增氧，自然光照。養(yǎng)殖期間水溫25-31℃，溶氧量保持在5.9mg/L以上。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，分別所有養(yǎng)殖桶中試驗魚稱重，以計算增重率、飼料系數(shù)，稱重后放回養(yǎng)殖桶內(nèi)穩(wěn)定24h。從每桶取6尾魚，丁香酚麻醉，稱重，尾靜脈取血，全血4℃過夜，離心(3000r/min離心10min)，取血清保存于-80℃冰箱，用于測定生化指標(biāo)。將采完血的試驗魚解剖，取肝臟，稱重，置于凍存管，用液氮速凍后，再在-80℃凍存，用于測定生化指標(biāo)。另從每桶取5尾魚合并為一個全魚樣本，并裝入自封袋，-20℃保存，用于體成分的測定。實驗結(jié)果見表3。

表3飼料中不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑添加劑量對斜帶石斑魚生長性能的影響表

同一列數(shù)字上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3為攝食含不同劑量石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑的飼料后斜帶石斑魚生長試驗結(jié)果。由表3可見，飼料1組、飼料2組、飼料3組石斑魚增重率大于對照料組，可見，對照料組生長速度明顯慢于飼料1、飼料2組和飼料3組。飼料1組、飼料2組和飼料3組的飼料效率高于對照料組，而對照料組的肝體比明顯高于飼料1、飼料2組和飼料3組。結(jié)果表明添加石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑能明顯促進石斑魚生長和飼料轉(zhuǎn)化效率，降低肝體比。

飼料水分采用干燥法(105℃)測定，粗蛋白質(zhì)采用FOSS公司Kjeltec8400型自動定氮儀測定，粗脂肪采用索氏抽提法測定，灰分采用灼燒法(550℃)測定。

全魚稱重后用絞肉機絞碎，置于玻璃器皿中，70℃干燥箱干燥，置于室內(nèi)，48h后稱重，用粉碎機粉碎制備成全魚風(fēng)干樣品。魚體常規(guī)成分測定方法同飼料常規(guī)成分測定方法。肝糖元(mg/g肝濕重)用堿消化法測定，試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。肝脂(肝濕重，％)采用氯仿-甲醇提取法測定。實驗結(jié)果見表4。

表4飼料中不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑添加劑量對斜帶石斑魚魚體成分、肝糖原和肝脂含量的影響表

同一列數(shù)字上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表4為攝食含不同劑量石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑的飼料后斜帶石斑魚體成分、肝糖原及肝脂含量結(jié)果。由表4可見，飼料中添加石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑可明顯提高體蛋白質(zhì)含量而降低體脂肪含量，對魚體水分和灰分沒有影響；飼料中添加不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑水平不影響魚體成分。飼料中添加不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑可明顯降低魚肝脂含量，但是牛磺酸復(fù)合制劑添加組肝脂含量差異不明顯。說明飼料中添加牛磺酸復(fù)合制劑有利于降低石斑魚體脂和肝脂沉積。

血漿和肝臟組織中總抗氧化能力采用ABTS法測定，超氧化物歧化酶活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶活性采用可見分光光度法測定，谷胱甘肽過氧化物酶活性采用DTNB法測定，丙二醛含量采用TBA法測定。實驗結(jié)果見表5、表6。

表5飼料中不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑添加劑量對斜帶石斑魚肝臟抗氧化能力的影響表

同一列數(shù)字上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表5為攝食含不同劑量石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑的飼料后斜帶石斑魚肝臟抗氧化能力結(jié)果。由表5可見，飼料中添加石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑可明顯提高斜帶石斑魚肝臟超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力，同時明顯降低丙二醛含量。

表6飼料中不同石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑添加劑量對斜帶石斑魚血清抗氧化能力的影響表

同一列數(shù)字上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表6為攝食含不同劑量石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑的飼料后斜帶石斑魚血清抗氧化能力結(jié)果。與表5的結(jié)果類似，飼料中添加石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑明顯促進血清抗氧化酶活性、總抗氧化能力，同時降低血清丙二醛含量。

石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑1、石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑2、石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑4、石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑5與石斑魚用牛磺酸復(fù)合制劑3同樣具有促進石斑魚生長和飼料轉(zhuǎn)化效率、降低肝體比、降低石斑魚體脂和肝脂沉積、可明顯提高斜帶石斑魚肝臟和血漿中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、血清抗氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力，同時明顯降低丙二醛含量的效果。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。