專利名稱：狗魚幼魚彈狀病毒實時熒光rt-pcr檢測法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及病毒的檢測方法和檢測試劑盒，特別是涉及狗魚幼魚彈狀病毒實時熒 光RT-PCR檢測法和試劑盒。
背景技術：
根據國際病毒學分類委員會(International comittee on taxonomy ofviruses, ICTV)第8次報告，彈狀病毒科(lihabdoviridae)分為6個屬，包括感染植物的質型彈狀 病毒屬(Cytorhabdovirus)和核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus),以及感染脊椎動 物的水皰性口膜炎病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)、短晳熱病毒屬 (Ephemerovirus)和粒外彈狀病毒屬(也稱非毒粒蛋白彈狀病毒屬)(Novirhabdovirus)， 還有部分彈狀病毒尚未分類，如Sigma virus, Flanders virus等。迄今報道感染魚類的 彈狀病毒已有十幾種，包括傳染性造血器官壞死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus, IHNV)、__個生(Viralhaemorrhagic septicemia virus, VHSV) >
(Hirame rhabdovirus, HRV) >(Snakehead rhabdovirus, SHRV)、鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、狗魚幼魚彈狀病 毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、彈狀病毒 903/87 (Rhabdovirus 903/87，903/87)、鱖魚 彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)、胭脂魚彈狀病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鮭彈狀病毒沘/97 (ka trout rhabdovirus 28/97, STRV)等(Granoff and Webster, 1999 ；張奇亞和李正秋，1999 ；Zhang et al.，2000 Johansson et al.，2001， 2002)。在ICTV第6次報告上，SVCV, PFRV被列為水皰性口膜炎病毒屬暫定種(Wurmer et al.，1995)。在ICTV第7次報告中，正式把IHNV、VHSV, HRV、SHRV列為粒外彈狀病毒屬， SVCV、PFRV等仍歸為水皰性口膜炎病毒屬的暫定種(Walker et al.，2000)。其他魚類彈狀 病毒的分類地位尚未確定。隨著魚類養殖業的快速發展，魚類病毒病已成為養殖魚類的最大病害。由于缺乏 有效的治療方法，魚類病毒性疾病的控制以預防為主，因而病毒的診斷與檢測技術研究成 了魚類病毒研究中非常活躍的領域。魚類彈狀病毒有很強的致病性，特別是VHSV、IHNV、 HRV, SHRV和SVCV在世界各地廣泛流行，給水產養殖業造成重大的經濟損失。因而這些病 毒的流行病學備受科研工作者的關注。狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)是一種與鯉春病毒血癥病毒(SVCV)同源性很高的病 毒，目前還未引起人們高度重視。PFRV主要在歐洲狗魚幼魚中流行(Wolf，1988)。1972年 該病毒在荷蘭感染狗魚幼魚，引起大規模死亡，第一株PFRV從此批患病的狗魚幼魚中分離 出來(De Kinkelin, 1973) ο PFRV與SVCV親緣關系最近，G蛋白的同源性> 70%。對PFRV、 SVCV及與它們血清學相關的魚類彈狀病毒G蛋白部分核苷酸序列進行系統進化分析，結果 顯示它們形成4個基因型，PFRV和SVCV分別形成一個基因型，分別為基因型III和I，其他 病毒形成基因型II和IV (Stone et al. , 2003) 0 SVC主要感染鯉科魚類，被世界動物衛生 組織列為必須申報的疾病，中國農業部將SVC列為二級動物疫病。隨著對SVC的日益重視，對SVCV監控力度的加大，這些與SVCV親緣關系高的病毒也將會越來越引起人們的重視。因 而尋找特異、靈敏快速的檢測方法，對于防控疾病的發生和發展十分關鍵。在中國，魚類病毒SVCV已經引起人們高度的重視，并于每年春秋兩季對全國鯉魚 進行SVCV監測。但是與SVCV親緣關系很高的魚類病毒PFRV目前還沒有引起人們的重視， 沒有納入檢測的范圍。隨著與這2種病毒血清學相關的病毒相繼分離(Ahne，1975 ;Ahne et al. ,1982 ；Fijan et al. ,1984 ；Ahne and Thomsen,1986 ；Haenen and Davidse,1989 ； Jorgensen et al. ,1989；Rowley et al. ,2001 ；Stone et al. ,2003 ；Way et al. ,2003), 人們對這些病毒的關注會越來越多。因而需要建立切實可行的檢測方法。目前，鑒定PFRV及與其血清學相關的病毒一般采取先用敏感細胞分離，然后用血 清學方法鑒定的方式(De Kinkelin, 1973 ；Ahne, 1975 ；Ahne etal. , 1982 ；Fijan et al.， 1984 ；Ahne and Thomsen, 1986 ；Haenen and Davidse,1989 ；Jorgensen et al. , 1989 ； Rowley et al.，2001 ；Stone et al.，2003 ；Way et al. ,2003) 采用這種檢測方式不僅周 期長，而且使用免疫學方法，如間接熒光抗體試驗或酶聯免疫吸附試驗，PFRV與SVCV之間 存在交叉反應(J0gensen et al.，1989 ；Way，1991)，檢測結果不準確。實時熒光技術，是近年來新問世的一種高敏感性的檢測技術，它融合了 PCR技術 的核酸高效擴增，探針技術的高特異性，光譜技術的高敏感性和高精確定量等優點，直接 探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果，它可以做到每循環一次就收集一個數 據，建立實時擴增曲線，做到真正意義上的定量。同時該技術在密閉系統內完成檢測，不需 要常規PCR的電泳觀察環節，減少了對工作環境的污染，降低假陽性結果發生。因此，自從 該技術建立以來，迅速、廣泛地應用于植物、動物和人類的寄生蟲，病毒和細菌等病原的檢 測研究中。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種能夠快速、高靈敏度的狗魚幼魚 彈狀病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。本發明的另一目的在于提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的檢測試劑盒。為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的實時熒光 RT-PCR檢測方法，所述方法包括利用特異性探針和引物對，以病毒基因組RNA為模板進行 實時熒光RT-PCR反應，所述引物對為能擴增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對，并且分別 含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5，-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探針為能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對之間的序列相同或互 補、且長度為20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標記有熒光報
告基團和熒光淬滅基團。在本發明優選的實施方式中，所述探針含有kq ID No. 3所示的序列，Seq ID No. 3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
優選的，所述探針5’端標記的熒光報告基團為HEX，3’端標記的熒光淬滅基團為 TAMRA0本發明的檢測方法中，RT-PCR反應的引物終濃度優選為0. 9 1. 1 μ mol/L，更優 選1 μ mol/L,探針終濃度優選為0. 4 0. 6 μ mol/L,更優選0. 5 μ mol/L。所述RT-PCR的反應的退火溫度優選為55°C 60°C，更優選60°C。本發明具體的實施方式中，所述RT-PCR的反應條件包括50°C反轉錄30min，94°C 預變性％iin，40個循環94°C變性15s，60°C退火及收集熒光信號lmin。本發明開公開了一種狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的檢測試 劑盒，所述試劑盒含有能擴增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對，所述引物 對分別含有ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列。進一步地，所述檢測試劑盒用于實時熒光RT-PCR檢測，并且所述試劑盒還含有能 與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對之間的序列相同或互補、且長度為20 40bp 的寡核苷酸探針，并且所述探針的5’端和3’端分別標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。優選的，所述探針含有kq ID No. 3所示的序列。進一步優選的，所述探針5’端標記的熒光報告基團為HEX，3’端標記的熒光淬滅 基團為TAMRA。由于采用了以上技術方案，使本發明具備的有益效果在于本發明的實時熒光RT-PCR檢測方法和試劑盒用于檢測PFRV時，比RT-PCR/PCR及 細胞培養(TCID5tl)檢測方法的靈敏度高；其中所用的特異性的引物對和探針，能夠在PFRV、 HRV、IHNV, VHSV, SVCV, IPNV和VNNV病毒中特異性地檢測出PFRV病毒；重復性好，可穩定 地進行檢測；靈敏度高，相應的靈敏度為101· 5TCID5qij


圖1為不同引物和探針濃度對擴增曲線的影響結果圖；圖2為實時熒光RT-PCR檢測PFRV的特異性實驗結果圖；圖3為PFRV實時熒光RT-PCR檢測的重復性實驗結果圖；圖4為PFRV實時熒光RT-PCR檢測的靈敏度實驗結果圖。
具體實施例方式實時熒光技術，是近年來新問世的一種高敏感性的檢測技術，它融合了 PCR技術 的核酸高效擴增，探針技術的高特異性，光譜技術的高敏感性和高精確定量等優點，直接 探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果，它可以做到每循環一次就收集一個數 據，建立實時擴增曲線，做到真正意義上的定量。同時該技術在密閉系統內完成檢測，不 需要常規PCR的電泳觀察環節，減少了對工作環境的污染，降低假陽性結果發生。因此， 自從該技術建立以來，迅速、廣泛地應用于植物、動物和人類的寄生蟲，病毒和細菌等病原 的檢測研究中。目前已經進行該項研究的魚類病毒有ISAV(Munir and Kibenge，2004)、 KHV (Gilad et al. ,2004), Betanodavirus (ValIe et al. ,2005), SVCV (張利峰等，2005 ； Yue et al. ,2007)、VHSV (Chico et al.，2006)、IHNV(Dhar et al.，2008)、IPNV(Bowers et al. ,2008)和VNNV(羅衛等，2008)。而本發明則建立了實時熒光RT-PCR方法檢測PFRV。
實施例11材料與方法1. 1病毒及細胞PFRV為F4株，由中國科學院水生生物研究所贈送，SVCV和IHNV參考株由英國 CEFAS的OIE參考實驗室B. Hill教授惠贈；VHSV參考株由挪威國家獸醫研究所OIE參考實 驗室Roar Gudding博士惠贈、IPNV、HRV、VNNV由本室分離。IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV 和 PFRV 分別用 EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、 FHM和BF-2細胞擴增。SSN-I細胞購自泰國Kasetsart大學水生動物健康研究所，RTG-2 細胞由水生生物研究所贈送，BF-2細胞由檢疫研究所(布雷西亞)細胞保藏中心贈送， CHSE-214細胞、EPC細胞由英國環境、漁業和水產養殖科學研究中心贈送、FHM細胞由德國 慕尼黑大學和中國科學院水生生物研究所贈送，CO細胞由中國科學院水生生物研究所贈 送。EPC、C0、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2細胞均用含10%胎牛血清的199培養液培 養，SSN-I細胞用含10% FBS的L-15培養液培養。接種病毒后，用加抗生素(100IU/mL青 霉素；100 μ g/mL鏈霉素)的相應培養液培養。1. 2設備與試劑ABI7500 熒光定量 PCR 儀；試劑盒 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit、TaKaRa One Step RNA PCR Kit均購于大連寶生物工程有限公司。1. 3引物和探針的設計與合成根據Genbank 中 PFRV G 基因(AJ538069)，使用 Primer Express 3. 0 (Applied Biosystems,Foster City,CA)和 Primer Premier 5. 0 軟件設計引物和 Taqman 熒光探針。 并通過NCBI數據庫進行BLAST驗證特異性后，由上海生工生物工程技術服務有限公司合 成。引物和探針序列見表1。表IPFRV實時熒光RT-PCR檢測的引物和探針
權利要求
1.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的實時熒光RT-PCR檢測方法， 所述方法包括利用特異性探針和引物對，以病毒基因組RNA為模板進行實時熒光RT-PCR反 應，其特征在于所述引物對為能擴增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對，并 且分別含有Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No.2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探針為能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對之間的序列相同或互補、且 長度為20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標記有熒光報告基 團和熒光淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述探針含有^^皿No.3所示的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述探針5’端標記的熒光報告 基團為HEX，3，端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。
4.根據權利要求1 3任意一項所述的檢測方法，其特征在于所述RT-PCR反應的引 物終濃度為0. 9 1. 1 μ mol/L,探針終濃度為0. 4 0. 6 μ mol/L。
5.根據權利要求1 4任意一項所述的檢測方法，其特征在于所述RT-PCR的反應的 退火溫度為55°C 60°C。
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述RT-PCR的反應條件包括50°C 反轉錄30min，94°C預變性％iin，40個循環94°C變性15s，60°C退火及收集熒光信號lmin。
7.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的檢測試劑盒，其特征在于所 述試劑盒含有能擴增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對，所述引物對分別含 有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3，。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒用于實時熒光 RT-PCR檢測，并且所述試劑盒還含有能與狗魚幼魚彈狀病毒G基因位于所述引物對之間的 序列相同或互補、且長度為20 40bp的寡核苷酸探針，并且所述探針的5’端和3’端分別 標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。
9.根據權利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于所述探針含有％(1ID No. 3所示 的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
10.根據權利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于所述探針5’端標記的熒光報告 基團為HEX，3，端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。
全文摘要
本發明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)的實時熒光RT-PCR檢測方法和試劑盒。本發明的方法和試劑盒利用特異性的引物對和探針，能夠特異性地檢測出PFRV病毒；重復性好，可穩定地進行檢測；靈敏度高，相應的靈敏度為101.5TCID50。
文檔編號C12Q1/70GK102108414SQ200910189339
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者何俊強, 劉葒, 盧體康, 鄭曉聰, 陳紅蓮 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心