病毒樣顆粒內標實時熒光rt-pcr檢測新城疫病毒的方法
【專利摘要】本發明公開了病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，根據新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點設計特異性引物和TaqMan探針；根據擴增目標片段的特點，設計內標探針序列。上述特異性引物的上游引物序列為：tgcagagatc?actcacactc?at；上述特異性引物的下游引物序列為：gatggaacgc?agagtagaaa?ag；上述TaqMan；探針的目標探針序列為：FAM-cctgttgcag?atgtccggagcac-BHQ1;上述TaqMan探針的內標探針序列為：VIC-gctcattcgg?ctcgacgggc?aat-BHQ2。本發明的優點在于快速、特異性強、靈敏度高，應用于臨床，能在3小時內準確的對新城疫進行診斷，為動物疫病治療方案的制定提供依據，提高科學養殖水平。
【專利說明】病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]核酸診斷技術是對新城疫病毒進行確診最有效的手段，目前主要采用普通RT-PCR和熒光RT-PCR技術，普通RT-PCR方法雖能夠對新城疫病毒進行檢測，但存在檢測過程繁瑣、易造成假陽性、假陰性、污染嚴重等問題；實時熒光RT-PCR技術以重復性好、靈敏度高、特異性強、操作簡單、所需時間短、無污染等優點被廣泛應用于各種病原的快速檢測。因熒光RT-PCR檢測技術要求高，試劑容易失效，加上檢測新城疫所用雙拭子或組織樣本成分復雜，一些樣本中可能含有抑制RT-PCR擴增的物質，造成檢測結果出現假陰性，采用病毒樣顆粒內標監控整個實驗過程，能有效控制假陰性結果的出現。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法。
[0004]本發明是通過以下技術方案來實現的。
[0005]一種病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，根據新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點設計特異性引物和TaqMan探針；根據擴增目標片段的特點，設計內標探針序列。
[0006]上述特異性引物的上游引物序列為:tgcagagatc actcacactc at
[0007]上述特異性引物的下游引物序列為:gatggaacgc agagtagaaa ag
[0008] 上述TaqMan 探針的目標探針序列為:FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQl;
[0009] 上述TaqMan 探針的內標探針序列為:VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat_BHQ2。
[0010]通過人工合成、克隆、表達過程制備了監控提取和反應的病毒樣顆粒內標，所制備的內標序列包含新城疫引物識別序列和特有的內標探針識別序列，內標突光報告基團用VIC標記，可對檢測進行全過程監控，有效防止假陰性出現。
[0011]本發明的有益效果:本發明提供了一種快速、特異性強、靈敏度高、能監控整個檢測過程的新城疫檢測方法，應用于臨床，能在3小時內準確的對新城疫進行診斷，為動物疫病治療方案的制定提供依據，提高科學養殖水平。
【具體實施方式】
[0012]下面根據實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0013]實施案例:
[0014]具體設計與操作步驟:
[0015]1、檢測用引物與探針的設計[0016]根據新城疫基因全序列，設計上、下游引物和目標探針序列；根據目標探針序列，設計內標探針序列如下:特異性引物的上游引物序列為:tgcagagatc actcacactc at
[0017]特異性引物的下游引物序列為:gatggaacgc agagtagaaa ag
[0018]TaqMan 探針的目標探針序列為:FAM_cctgttgcag atgtccggagcac-BHQl;
[0019]TaqMan 探針的內標探針序列為:VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat_BHQ2。
[0020]2、病毒樣顆粒內標的制備
[0021](1)MS2噬菌體包裹蛋白基因片段的擴增。MS2上游引物序列為:atggatcctgggaccccttt cggggtcctg ct, MS2 下游引物序列為:gcaagctttc aatacataaa gagttgaacttct,擴增片段長度為1798bp，引物首尾分別含有BamH I和Hind III酶切位點。以MS2噬菌體RNA為模板，一步法RT-PCR擴增，擴增產物分別用瓊脂糖凝膠電泳和雙酶切鑒定。
[0022](2)PET-32a_MS2重組質粒的構建。將以上擴增產物純化，純化產物和PET_32a載體雙酶切后，再用DNase Ligase連接，轉化大腸桿菌BL21，采用雙酶切和PCR篩選陽性質粒，獲得重組質粒PET-32a-MS2。
[0023](3)內標片段的合成與PCR擴增。擴增的內標片段包括Hind III和Not I兩個酶切位點、上游引物序列、下游引物互補序列、內標探針序列。先分段化學合成內標片段，每段78bp，每片段首尾之間存在互補區域，采用Klenow酶對所合成的片段進行連接，再采用以下兩條引物下兩條引物擴增:引物1:gcaagctttg cagagatcac tcaca引物2:cagcggccgcgatggaacgc agagt ;對？0?擴增產物進行純化,獲得99bp的內標片段序列如下:gcaagctttgcagagatcac tcacactcat cgttagctca ttcggctcga cgggcaatcg attgccctct tttctctctgcgttccatcg cggccgctgo
[0024](4)內標片段的克隆。將PCR擴增產物純化，純化產物和PET-32a_MS2重組質粒分別采用Hind III和Not I雙酶切，再用DNase Ligase連接，轉化大腸桿菌BL21，采用雙酶切和PCR篩選陽性質粒，獲得重組質粒PET-32a-MS2-1C。
[0025] (5)重組質粒PET-32a-MS2_IC的原核表達。挑取重組菌(含重組質粒PET32a-MS2-1C)的一個單菌落，接入2mL含Amp (100ug/ml)的LB液體培養基中，37°C靜置培養過夜；取500 u L過夜培養物接入50mL含Amp (100ug/ml)的LB液體培養基中，37°C振蕩培養2.0h至細菌對數生長期；在培養物中加入誘導劑IPTG至終濃度為1.0mmol/L, 37°C繼續振蕩培養；誘導16h后取出。
[0026](6)原核表達產物的前處理。將誘導后的菌液移至IOml離心管，5000rpm收集菌體，每 IOml 菌液用 3mlPBS 和 3ml DNase Buffer (IOmMTris-HCl; 2.5mM MgCl2; 0.5mMCaCl2)各懸浮清洗一次，最后用ImlDNase Buffer懸浮菌體；將懸浮菌于_80°C反復凍融三次,按10ug/ulRNase量對凍融物進行37°C消化2h，12000rpm離心5min，取上清；將上清分裝，按IOOul/管進行分裝，每管加入5U的DNase于37°C條件下消化3h。
[0027](7)病毒樣顆粒內標耐核酸酶的鑒定。取IOul以上用DNase消化后的上清，補水至IOOul，采用Trizol經典法提取核酸，熒光RT-PCR檢測提取產物(反應體系為25yL，上游引物濃度為0.25 u M,下游引物濃度為0.30 u M，內標探針濃度0.20 u M,內標探針濃度為0.20 ii M，dNTP濃度為0.30mM, Mg+濃度5mM，RNA溶解液10 y L ;反應條件為:反應程序為 52°C 25min,95°C 3min ；95°C 5sec，62°C 45sec，在 62°C 時設定 VIC 熒光信號，40 個循環)。分別設加AMV和不加AMV的對照，用以檢測DNA和RNA的含量，檢測結果表明耐核酸酶病毒樣顆粒內標的制備成功。
[0028] 3、病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒具體操作
[0029](I)核酸提取。將咽喉拭子或泄殖腔拭子置于500 ULPBS液內(含青霉素1000IU/mL，鏈霉素1000IU/mL)30min，2000rpm離心lOmin，取190 u L以上經過處理的上清液和前處理過的內標液10 u L，加入600 u LTrizol裂解液，用移液器反復吹打混勻5_10次，靜置裂解5min ;加入200 u L氯仿,震蕩混勻15秒,靜置2min, 12000rpm, 4°C條件下離心IOmin ;吸取上清于一新的離心管中，加入等體積于_20°C已經預冷的異丙醇，顛倒混勻10次，置-20°C條件下冷卻lOmin, 12000rpm, 4°C條件下離心IOmin ;吸棄上清,加入500 u L75%的乙醇,顛倒洗漆；5000rpm,4°C條件下離心5min,棄上清,室溫干燥3min。加入30 u LTE溶解RNA。
[0030](2)PCR擴增。反應體系為25iiL，上游引物濃度為0.30UM，下游引物濃度為
0.35 u M，目標探針濃度0.22 u M,內標探針濃度為0.18 u M，dNTP濃度為0.35mM, Mg+濃度6mM，RNA 溶解液 10 y L ;反應條件為:52°C 25min,95°C 3min ；95°C 5sec，62°C 45sec，在 62°C時設定檢測FAM和VIC熒光信號，40個循環。
[0031](3)檢測結果判斷。根據儀器軟件判定結果。
[0032]上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本
【發明內容】
并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.病毒樣顆粒內標實時熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，其特征在于，根據新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點設計特異性引物和TaqMan探針；根據擴增目標片段的特點，設計內標探針序列。
【文檔編號】C12Q1/70GK103602760SQ201310594028
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】趙宏波, 陳幫照 申請人:安徽華衛集團禽業有限公司