專利名稱：一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法及其制品的制作方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品技術領域，更具體是涉及一種用傳代細胞源生產偽狂犬
病活疫苗的方法及其制品。
背景技術：
偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(PRV)引起多種動物的一種急性傳染病。該傳染病遍 布世界主要養豬國家。免疫接種是防制偽狂犬病的主要策略。 我國目前生產偽狂犬病活疫苗所用的細胞為雞胚成纖維細胞。因每批雞胚原材料 的差異，雞胚成纖維原代細胞的批間差異較大；用雞胚成纖維細胞培養偽狂犬病病毒，產毒 滴度不高，給疫苗產量、效力的提高帶來困難，而且細胞碎片與雜蛋白多，易引起過敏反應。

發明內容
為克服上述技術缺陷，本發明的目的是提供一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫 苗的方法及偽狂犬病活疫苗產品。 為實現上述目的，本發明首先提供了一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方 法。該方法包括如下步驟 (1)用傳代細胞培養偽狂犬病病毒弱毒株；
(2)收獲所述步驟(1)得到的細胞培養毒液； (3)在所述步驟(2)得到的細胞培養毒液中加穩定劑和抗生素，經冷凍真空干燥
得到傳代細胞源偽狂犬病活疫苗。
優選的，所述步驟(1)包括如下步驟 (la)制苗用細胞的傳代與培養所述傳代細胞經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳 代，用細胞生長液繼續培養，形成傳代細胞單層； (lb)細胞毒種的繁殖將所述偽狂犬病病毒弱毒株接種至所述步驟(la)中得到 的傳代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；2 3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；
(lc)制苗毒液的繁殖取所述步驟(la)中得到的傳代細胞單層，棄去所述細胞生 長液，接種所述步驟(lb)中得到的含毒的細胞維持液，繼續培養。 優選的，所述步驟(la)、 (lb)和(lc)中的細胞培養所用的溫度為36t: 37t:。
優選的，所述步驟(lb)和(lc)中的接種時的接種量為1% 2%體積百分比的生 產用細胞毒種的維持液。 優選的，所述步驟(la)中的細胞生長液含90X 92X體積百分比的MEM液、抗菌 素和8% 10%體積百分比的犢牛血清，所述細胞生長液的pH值為7. 0 7. 2。
優選的，所述步驟(lb)和(lc)中的細胞維持液含95% 98%體積百分比的MEM 液、抗菌素和2% 5%體積百分比的犢牛血清，所述細胞維持液的pH值為7. 2 7. 4。
優選的，所述步驟(2)包括如下步驟接毒后2 3日收獲細胞培養毒液，收獲的
毒液置-i5t:以下保存。
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優選的，所述傳代細胞為豬睪丸傳代細胞ST、豬腎傳代細胞PK15或豬腎傳代細胞 I服S-2。 本發明的目的之二是提供一種偽狂犬病活疫苗制品，該偽狂犬病活疫苗制品通過 上述方法得到。 與現有技術相比，本發明的用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法具有生產工 藝簡單且穩定、易操作、病毒含量高、批間差異小、質量易控、可顯著提高疫苗產量和質量、 減少過敏反應等優點。利用本發明的生產方法得到的偽狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力 高、對偽狂犬病強毒攻擊具有較好的免疫保護作用。
具體實施例方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。 用傳代細胞(細胞系)生產偽狂犬病活疫苗的生產工藝方法，具體步驟如下 (1)選擇傳代細胞作為制苗用細胞在本實施例中，選擇豬睪丸(ST)傳代細胞，在
另兩個實施例中，分別選擇豬腎(PK15)傳代細胞和豬腎(IBRS-2)傳代細胞。 (2)制苗用細胞的傳代與培養上述傳代細胞經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，
以細胞生長液繼續培養，形成良好單層時，用于繼續傳代或接種病毒。
(3)細胞毒種的繁殖將偽狂犬病病毒弱毒株接種生長良好的上述傳代細胞單 層，用細胞維持液繼續培養；2 3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種。
細胞毒種鑒定細胞毒種鑒定完全符合偽狂犬病病毒弱毒株毒種標準，對豬安全 無副作用，細胞毒種每lml含病毒^ 108TCID5。。 (4)制苗毒液的繁殖取已形成良好單層的上述傳代細胞培養瓶，棄去細胞生長 液，接種上述含毒的維持液，繼續培養；接毒后2 3日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液 置-15"以下保存。 制苗毒液的檢驗按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)附錄15、19頁進行檢 驗，無細菌、霉菌、支原體生長。細胞毒液對豬安全無副作用，各收次病毒培養液分別用細胞 測定效價，每lml含病毒^ 108TCID5。。 (5)配苗、分裝及凍干將檢驗合格的病毒培養液，混合于同一容器內，加入穩定
劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后迅速進行冷凍真空干燥后即得成品。 成品檢驗按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)進行檢驗，符合"偽狂犬病活
疫苗"的規定，對豬安全無副作用，每頭份疫苗含病毒^ 106TCID5。。 其中，各步驟中所涉及到的具體條件如下 步驟(2) 、 (3) 、 (4)中所述的傳代細胞培養溫度是36 37°C 。 步驟(3) 、 (4)中所述的接種量為1% 2%體積百分比的生產用細胞毒種的維持液。 步驟(2)中所用生長液的配方是90X 92X體積百分比的MEM液、8X 10%體 積百分比的犢牛血清、并加適量的抗菌素，pH值調整為7. 0 7. 2。 步驟(3)及(4)中所用維持液的配方是95X 98XMEM液、2X 5X犢牛血清、加適量的抗菌素，pH值調整為7. 2 7. 4。 按上述方法制備得到的偽狂犬病活疫苗按《中華人民共和國獸藥典》(2005年 版)進行檢驗，符合"偽狂犬病活疫苗"的規定，對豬安全無副作用，每頭份疫苗含病毒 > 106TCID50。 最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當 理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質 和范圍。
權利要求
一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用傳代細胞培養偽狂犬病病毒弱毒株；(2)收獲所述步驟(1)得到的細胞培養毒液；(3)在所述步驟(2)得到的細胞培養毒液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空干燥得到傳代細胞源偽狂犬病活疫苗。
2. 根據權利要求1所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(1)包括如下步驟(la)制苗用細胞的傳代與培養所述傳代細胞經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，用 細胞生長液繼續培養，形成傳代細胞單層；(lb)細胞毒種的繁殖將所述偽狂犬病病毒弱毒株接種至所述步驟(la)中得到的傳 代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；2 3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；(lc)制苗毒液的繁殖取所述步驟(la)中得到的傳代細胞單層，棄去所述細胞生長 液，接種所述步驟(lb)中得到的含毒的細胞維持液，繼續培養。
3. 根據權利要求2所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(la)、 (lb)和(lc)中的細胞培養所用的溫度為36°C 37°C。
4. 根據權利要求2所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(lb)和(lc)中的接種時的接種量為1% 2%體積百分比的生產用細胞毒種 的維持液。
5. 根據權利要求2所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(la)中的細胞生長液含90X 92X體積百分比的MEM液、抗菌素和8X 10%體積百分比的犢牛血清，所述細胞生長液的pH值為7. 0 7. 2。
6. 根據權利要求2所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(lb)和(lc)中的細胞維持液含95X 98X體積百分比的MEM液、抗菌素和 2% 5%體積百分比的犢牛血清，所述細胞維持液的pH值為7. 2 7. 4。
7. 根據權利要求1 6之一所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法， 其特征在于，所述步驟(2)包括如下步驟接毒后2 3日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液 置-15"以下保存。
8. 根據權利要求1 6之一所述的一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法， 其特征在于，所述傳代細胞為豬睪丸傳代細胞ST、豬腎傳代細胞PK15或豬腎傳代細胞 I服S-2。
9. 一種偽狂犬病活疫苗，其特征在于，所述偽狂犬病活疫苗通過權利要求1 6之一所 述的方法得到。
全文摘要
本發明提供了一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法及其偽狂犬病活疫苗產品。該方法包括如下步驟用傳代細胞培養偽狂犬病病毒弱毒株；收獲得到的細胞培養毒液；再加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空干燥得到傳代細胞源偽狂犬病活疫苗。傳代細胞為豬睪丸傳代細胞ST、豬腎傳代細胞PK15或IBRS-2。本發明用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法具有生產工藝簡單且穩定、易操作、病毒含量高、批間差異小、質量易控、可顯著提高疫苗產量和質量、減少過敏反應等優點。利用本發明的生產方法得到的偽狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高、對偽狂犬病強毒攻擊具有較好的免疫保護作用。
文檔編號C12N7/00GK101695573SQ20091019331
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者任向陽, 司徒劍謀, 吳文福, 周澤標, 岑小清, 廖潤科, 張木輝, 張毓金, 林旭野, 游啟有 申請人:廣東永順生物制藥有限公司;