專利名稱：一種利用細胞工廠生產雞馬立克氏病疫苗的方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥技術領域，具體涉及一種生產雞馬立克氏病液氮苗(814株) 的方法，尤其是公開了一種利用細胞工廠制備雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的方法。
背景技術：
雞馬立克病是由細胞結合性皰疹病毒(MDV)引起的雞的一種高度傳染的淋巴組 織增生性疾病，雞群感染馬立克病毒后危害較大，對養禽業造成嚴重的危害。隨著疫苗的廣 泛應用和雞品系的不斷選育，MDV在自然選擇和免疫壓力的雙重作用下，其毒力不斷增強， 一次次地突破了疫苗所能提供的保護力。20世紀70年代所分離到的為標準強毒(VMDV)，70年代末到80年代MDV發生了很 大變化，毒力增強，成為超強毒；90年代出現了更強的超強毒(VV+MDV)。因此HVT凍干苗對 MD強毒和VV+MDV免疫效果差，可以說血清III型HVT疫苗的歷史使命基本完成。目前，普遍使用的能夠抵御超強毒和超超強毒的疫苗毒株主要有814株和 CVI988。814株是我國哈爾濱獸醫生物藥品研究所的童昆周先生從沒有免疫過馬立克疫苗 的健康雞群分離出的一株沒有致瘤性的馬立克病毒，與CVI988同屬于血清I型毒株。但 814株屬于自然弱毒株，無致瘤性，是我國惟一沒有致瘤性的血清I型疫苗株，因此，不存在 毒力返強的問題。本毒株遺傳性能好，具有良好的免疫原性，不受母源抗體影響。傳統的病毒性疫苗制備，關鍵是為病毒提供適宜其增殖的細胞基質，通常采用貼 壁培養的生長方式。貼壁培養系統主要有轉瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統等。轉瓶培 養是小量培養到大規模培養的過度方式，或作為生物反應器接種細胞的準備途徑。轉瓶培 養是目前國內疫苗生產廠家普遍采用的細胞培養方式，具有結構簡單、投資少、技術成熟、 重復性好、容易擴大等優點，同時也存在著細胞生長密度低、轉瓶間細胞生長差異大、勞動 強度大、占用空間大、能耗高、水耗量大等缺點。

發明內容
本發明提供一種利用細胞工廠生產的雞馬立克氏病液氮疫苗，包括如下組分每支成品(2mL)含以下組分及含量199綜合營養液1. 4 1. 7mL犢牛血清0. 2 0. 4mL冷凍保護液 0. 1 0. 2mL病毒量所含病毒蝕斑數不低于6X IO6PFU的馬立克氏病814株病毒。其中所述的199綜合營養液購自美國Invitrogen公司。本發明還提供制備上述疫苗的方法，包括如下步驟1)、制備雞成纖維細胞懸浮液選擇9-10日齡發育良好的無特定病原體(SPF)雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位， 用75%酒精脫碘，無菌取出雞胚，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用Hank’ s液洗滌3次后；按每個雞胚4 6mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)， 在38°C消化20 30min后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；加入營養液，分散細胞，靜置 后用10 15層紗布過濾，再次加入乳漢液，反復分散細胞，確認組織塊被分散成單個細胞， 制成每一毫升含活細胞數80 120萬的雞成纖維細胞懸浮液，混合均勻后備用；2)接種及更換維持液往制備的雞成纖維細胞懸浮液中加入工作毒種，分裝在細胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進液口蓋，放38°C的溫室內靜置培養。培養24 36h后棄去細胞生長液，加入 含有2 5%血清的199營養液，將營養液分勻擰緊瓶口帽，放入38°C溫室培養；或者將制 備的雞胚成纖維細胞懸浮液分裝在細胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進液口蓋，放38°C 的溫室內靜置培養。培養24 36h后棄去細胞生長液，加入含有工作毒種的199營養液， 將營養液分勻擰緊瓶口帽，放入38°C溫室培養48 72h ；其中，優選的是，每平方厘米細胞工廠的平面上接種5-10萬個雞胚成纖維細胞。3)收獲培養至80%以上的細胞出現致細胞病變效應(CPE)時，即可收獲，棄去營養液，加 入EDTA-胰酶混合消化液250 350mL/層，使消化液與細胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入 199營養液300 400mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后，分至離心瓶中；4)離心、提取細胞于2_8°C、1500r/min離心10 20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細胞；5)配苗與分裝收集沉淀細胞，調節pH值7. 0 7. 4，加入配苗體積70 85 %的199綜合營養液、 配苗體積10 20%的犢牛血清和配苗體積5 10%的冷凍保護劑，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進行活細胞計數后，定量分裝到無菌安瓶中封口 ；其中，冷凍保護劑可選用任何本 領域超低溫保存的冷凍保護劑，優選為二甲基亞砜(DMSO)。6)程序降溫利用程序降溫儀進行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存；7)清洗細胞工廠用消毒純化水反復清洗用過的細胞工廠3 4次，包裝好，進行鈷源照射消毒后重 復使用。其中步驟2)中加入的工作毒種為血清I型的禽馬立克氏病毒814株，接種量為每 平方厘米接種1000 2000PFU含量的種毒，優選為1500PFU。本發明通過細胞工廠生產的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的質量優良，免疫效 力高，免疫效果穩定，與國外進口同類疫苗相比具有相同的預防效果，除此之外，其還有代 次低、蝕斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在較短的時間內產生免疫保護等優點。此外，在疫苗制劑中特別添加了犢牛血清，在解凍和使用過程中有助于提高細胞 存活率，減少病毒損失，提高免疫效力。本發明提供的利用細胞工廠生產雞馬立克氏病疫苗的方法，具有如下優點在細 胞工廠中，細胞生長更接近自然狀態，可形成均一的細胞單層；由于材料對細胞的影響非常 小，細胞的活力更強，病毒在細胞內生長更快，感染細胞率明顯提高；細胞與外界接觸的機會更少，人為污染的幾率就更低；此外還有體積小，節省空間，更容易操作等優點。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1選用美國CORNING公司出品的Cell STACK 10層(636cm2/層)，采用同步感染法 制備雞馬立克氏病液氮苗的制備工藝。液氮疫苗制備工藝主要步驟如下(1)雞胚成纖維細胞單層的制備選擇10日齡發育良好的SPF雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫 碘，無菌取出雞胚，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用 Hank's液洗滌3次后；按每個雞胚4mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)，在38°C消化30min 后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；按每個雞胚加入2mL的營養液，制成每一毫升含活細 胞數300萬的細胞懸液。混合均勻后備用。(2)接毒及更換維持液往細胞懸液中加入工作毒種，接種量為每平方厘米接種1500PFU含量的種毒，分 裝在細胞工廠中，每層150mL，蓋好進液口蓋，放38°C的溫室內靜置培養。培養36h后棄去 細胞生長液，加入含有血清的199營養液，細胞工廠每層150mL，將營養液分勻擰緊瓶口帽， 火焰消毒瓶口，用錫紙包好，放入37°C 士0.5°C溫室培養。(3)培養與觀察接毒24h后每日觀察1 2次，待80%以上細胞出現CPE時，即可收獲。(4)收獲棄去營養液，加入EDTA-胰酶混合消化液250mL/層，使消化液與細胞充分接觸一 段時間后，棄去胰酶液，立即加入199綜合營養液400mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后， 分至離心瓶中；(5)離心、提取細胞于2_8°C、1500r/min離心10分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細胞。(6)配苗與分裝收集沉淀細胞，調節pH值7. 0，加入配苗體積10%的犢牛血清、配苗體積5%的冷 凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)和配苗體積的85%的199綜合營養液，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進行病毒計數，每毫升中所含病毒蝕斑數不低于3 X 106PFU。2mL分裝到無菌安瓶 中封口。(7)程序降溫利用程序降溫儀進行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗細胞工廠用消毒純化水反復清洗用過的細胞工廠3次，包裝好，進行鈷源照射消毒后重復使用。實施例2選用美國CORNING公司出品的Cell STACK 40層(636cm2/層)，采用單層感染法 制備雞馬立克氏病液氮苗的制備工藝。液氮疫苗制備工藝主要步驟如下(1)雞胚成纖維細胞單層的制備選擇9日齡發育良好的SPF雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫碘， 無菌取出雞胚，去除頭、內臟，放入無菌的玻璃器皿內，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪 刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用Hank’ s液洗滌3次后，按每個雞胚6mL的比例加入 0. 25%胰酶，在38°C消化20min后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；按每個雞胚加入4mL 的營養液，制成每一毫升含活細胞數約200萬的細胞懸液，放38°C的溫室內靜置培養。將細 胞懸液分裝在細胞工廠中，每層250mL，蓋好進液口蓋，形成單層后備用。(2)接毒及更換維持液棄去細胞生長液，加入含有工作毒種的199營養液，細胞工廠每層250mL，其中，接 種量為每平方厘米接種2000PFU含量的種毒。將營養液分勻擰緊瓶口帽，火焰消毒瓶口，用 錫紙包好，放入38°C溫室培養。(3)培養與觀察接毒24h后每日觀察1 2次，待80%以上細胞出現CPE時，即可收獲。(4)收獲棄去營養液，加入EDTA-胰酶混合消化液350mL/層，使消化液與細胞充分接觸一 段時間后，棄去胰酶液，立即加入199綜合營養液300mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后， 分至離心瓶中；(5)離心、提取細胞于2_8°C、1500r/min離心20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細胞。(6)配苗與分裝收集沉淀細胞，調節pH值7. 4，加入配苗體積20 %的犢牛血清、和配苗體積10 %的 冷凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)和配苗體積70%的199綜合營養液，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進行病毒計數，每毫升中所含病毒蝕斑數不低于3 X IO6PFU, 2mL分裝到無菌安瓶中 封口。(7)程序降溫利用程序降溫儀進行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗細胞工廠用消毒純化水反復清洗用過的細胞工廠4次，包裝好，進行鈷源照射消毒后重復 使用。實施例3設計實驗，比較利用實施例1生產的經檢查合格的雞馬立克氏病液氮疫苗(814 株)與國外2個廠家生產的CVI988疫苗預防雞馬立克氏病的療效。一、將1齡SPF白來航雛雞(由北京梅里亞維通實驗技術有限公司提供)132只隨機分成6組，每組22只。免疫組共4組，分別接種814低代毒疫苗、814株疫苗、CVI988-A、 CVI988-B，每只頸背部皮下注射3000PFU。非免疫組2組，免疫后在隔離器中分別隔離飼養 21d。免疫后21d，將免疫組和陽性對照組的22只分別接種馬立克氏病(MD)標準強毒株 京-1株(購自由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，經農業部批準發放，批號980603， 2mL/支，攻毒時，用乳漢液稀釋10倍，每只雞腹腔注射0. 5mL)，連同陰性對照組22只，在進 口隔離器中繼續隔離飼養。每天觀察、記錄發病和死亡情況，對死亡雞及時剖檢，觀察大體 病變。攻毒2個月后，對所有存活雞進行解剖，觀察病變，計算病變指數和保護指數。試驗 結果用SPSS軟件進行t檢驗。通過實驗觀察和結合統計表1、2可知①陽性對照組雞攻毒后，最早發病日齡為15日齡，最早發生死亡的日齡為17日 齡，死亡時間集中在17 40日齡，死亡比例為72. 73%。剖檢死亡雞均為典型的內臟型病 變，肌肉、皮膚和神經型病變少見，至62日齡時，存活的6只中有3只雞呈陽性病變，脾臟病 變均明顯，有1只雞的卵巢有小雞蛋大小的病變，總陽性率為86.4%。陰性對照組到實驗結 束均表現健康生長，剖檢器官無異常，表明本次實驗陰陽性對照均成立，實驗結果可信。②814低代毒組和814疫苗組在整個攻毒過程中，均沒有死亡，62d的活雞中個別 雞睪丸和腎臟有淋巴瘤病變。③CVI988-A組在攻毒后60d時，有1只雞因極度消瘦死亡，解剖發現卵巢、腎腫 大。活雞中有3只有淋巴瘤病變。④CVI988-B組在攻毒48d時有1只雞死亡，解剖發現肝臟上布滿星狀腫瘤，單側 睪丸極度腫大，心臟呈陽性病變。表1免疫組和對照組接種強毒后的保護指數和死亡情況表
組別攻毒死亡雞腫瘤陽存活雞腫瘤總陽性數保護指數只數性數(只)陽性數(只)(只)(%)0083]814低代毒2203384.3814疫苗2202289.4CVI988-A2213478.9CVI988-B2213478.9陽性對照組221631986.4陰性對照組0----注保護指數=(攻毒對照組陽性率-免疫組陽性率)/攻毒對照組陽性 率 X 100%表2免疫組和對照組接種強毒后病變分布情況
權利要求
1.一種雞馬立克氏病疫苗，其特征在于，包括如下組分每支2mL成品含以下組分及含量199綜合營養液1.4 1. 7mL犢牛血清 0. 2 0. 4mL冷凍保護液0. 1 0. 2mL病毒含量所含病毒蝕斑數不低于6X IO6PFU的馬立克氏病814株病毒。
2.根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為液氮苗。
3.一種制備權利要求1或2所述疫苗的方法，包括如下步驟1)制備雞胚成纖維細胞懸浮液將無特定病原體雞胚用胰酶消化后制成雞胚成纖維細胞懸浮液；2)接種及更換維持液往步驟1)制備的雞胚成纖維細胞懸浮液中加入工作毒種，分裝在細胞工廠中，每層 150 250mL，于38°C靜置培養24 36h后棄去細胞生長液，加入含有2 5%犢牛血清的 199營養液，每層150 250mL，于38°C靜置培養；或者將步驟1)制備的雞胚成纖維細胞懸 浮液分裝在細胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進液口蓋，于38°C靜置培養24 36h后棄 去細胞生長液，加入含有工作毒種的199營養液，于38°C靜置培養；3)收獲培養至80%以上的細胞出現致細胞病變效應時，即可收獲，棄去營養液，加入EDTA-胰 酶混合消化液250 350mL/層，使消化液與細胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入199營養液 300 400mL/層，停止消化，收集，無菌檢驗后，分至離心瓶中；4)離心、提取細胞于2 8°C、1500r/min離心10 20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細胞；5)配苗與分裝收集沉淀細胞，調節pH值7. 0 7. 4，加入配苗體積70 85%的199綜合營養液、配 苗體積10 20%的犢牛血清，和配苗體積的5 10%的冷凍保護劑，搖勻，取樣做收獲前 無菌檢驗，進行活細胞計數后，定量分裝到無菌安瓶中封口 ；6)程序降溫利用程序降溫儀進行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入液氮 中保存；7)清洗細胞工廠用消毒純化水反復清洗用過的細胞工廠3 4次，包裝好，進行鈷源照射消毒后重復使用。
4.根據權利要求3所述的生產方法，其特征在于，所述工作毒種為血清I型的禽馬立克 氏病病毒814株。
5.根據權利要求3所述的生產方法，其特征在于，所述冷凍保護劑為二甲基亞砜。
6.根據權利要求3所述的生產方法，其特征在于，所述步驟2)中工作毒種的接種量為 每平方厘米接種1000 2000PFU含量的種毒。
7.根據權利要求6所述的生產方法，其特征在于，所述步驟2)中的工作毒種接種量為 每平方厘米接種1500PFU含量的種毒。
8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中胰酶的用量為每個雞胚加 入4 6mL的0. 25%的胰酶。
9.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中的雞胚成纖維細胞懸浮液 的活細胞數為每一毫升200 300萬。
全文摘要
本發明屬于生物制藥技術領域，公開了一種利用細胞工廠制備雞馬立克氏病液氮疫苗814株的方法及其利用這種方法制備的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)。本發明通過細胞工廠生產的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的質量優良，免疫效力高，免疫效果穩定；除此之外，其還有代次低、蝕斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在較短的時間內產生免疫保護等優點。
文檔編號A61K39/255GK102000328SQ20101056226
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者周海琴, 常如軍, 張發明, 張洪, 張紅, 張連祥, 曹寧, 朱秀芝, 李然, 李靜, 王文泉, 袁芳, 賈桂珍, 車競, 邢雪蓮, 郎立群, 鄭杰, 金劍, 陳玲, 馬力 申請人:北京市獸醫生物藥品廠