專利名稱：流行性感冒原代地鼠腎細(xì)胞多價(jià)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流行性感冒原代地鼠腎細(xì)胞疫苗及其制備方法，其屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是一種嚴(yán)重的呼吸道傳染病。在1918-1919年的流感大流行中，由于感染了流感病毒而死亡的人數(shù)比持續(xù)4年的第二次世界大戰(zhàn)中死亡人數(shù)還要多。流感的特征往往是反復(fù)流行，突然發(fā)生，迅速傳播，小則局部流行，大則遍及全球。嬰兒和老人病死率高，每年數(shù)以萬計(jì)。目前流感仍是影響世界公眾健康的重要問題，而最近高致病的禽流感又大有侵襲人類的危險(xiǎn)，所以接種疫苗仍是當(dāng)前預(yù)防流感和禽流感傳播感染的重要手段之一。
作為流感的病原體，流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，能引起世界性流感大流行，它在動物中廣泛分布，也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常常引起流感局部暴發(fā)，不會引起世界性流感大流行，至今尚未找到它存在于人之外的其它動物中的確鑿證據(jù)。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。過去一直認(rèn)為人是丙型流感病毒唯一的天然宿主，但近年來這種看法已得到了徹底糾正，郭元吉等人于1981～1982年從我國豬群中分離出多株丙型流感病毒，并已得到了世界公認(rèn)。所有流感病毒均為正粘病毒，分三個(gè)型別，即甲、乙和丙型流感病毒。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的差異又可分為不同亞型，迄今甲型流感病毒HA有15個(gè)亞型(H1-H15)，NA有9個(gè)亞型(N1-N9)，H和N均為糖蛋白，H、N的變異是獨(dú)立的。
根據(jù)1980年世界衛(wèi)生組織公布的流感病毒的命名如下甲型流感病毒命名法可用下列公式表示之型別/宿主/分離地點(diǎn)/毒株序號(指采樣時(shí)標(biāo)本號)/分離年代(血凝素亞型、神經(jīng)氨酸酶亞型)，其中宿主為人的可以忽略不寫。乙型和丙型流感病毒的命名法和甲型相同，但無亞型劃分。
流感是一種古老性疾病，至今在防治方面尚未找到真正的突破口。由于流感病毒的抗原性，尤其HA蛋白的抗原性，能經(jīng)常不斷地發(fā)生變異，這不僅給疫苗制備增加了難度，更主要的是能很快使疫苗免疫接種效果下降，甚至無效，所以人類一直不斷地在開發(fā)新的疫苗，以應(yīng)對新一輪次流感的襲擊。
本世紀(jì)30年代初，流感病毒滅活疫苗就開始進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。當(dāng)時(shí)用受染的小鼠肺所制成勻液中的流感病毒，經(jīng)甲醛滅活接種動物，然后用流感野毒株皮下和腹腔內(nèi)攻擊，以了解是否有免疫保護(hù)。顯然這種疫苗不能用于人體。
1937年，雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功，使大量生產(chǎn)疫苗成為可能。流感病毒滅活疫苗于1941年在美國首次被批準(zhǔn)使用。1943年美國開始在軍隊(duì)中使用，并證實(shí)有效；1945年在美國開始廣泛應(yīng)用。這種早期粗制的疫苗，是用含流感病毒粒的雞胚尿囊液，經(jīng)紅細(xì)胞吸附和釋放有限的純化，然后甲醛滅活。接種疫苗后，局部和全身反應(yīng)都很強(qiáng)。
本世紀(jì)60年代，超速離心機(jī)和層析色譜技術(shù)的應(yīng)用，使毒粒純化操作能力大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，兒童使用時(shí)仍可出現(xiàn)不良反應(yīng)。后來經(jīng)過進(jìn)一步用裂解劑裂解病毒并進(jìn)行純化制備出流感裂解疫苗，使用時(shí)不良反應(yīng)就大為減少。前后研制出多種裂解劑，如乙醚，3-N-丁基磷酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate 80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)，三硝基甲苯X-100(Triton X-100)等。流感裂解疫苗1968年在美國首次被批準(zhǔn)使用。
本世紀(jì)70和80年代，在裂解疫苗的基礎(chǔ)上，又研制出了毒粒亞單位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英國在臨床疫苗試用中，證實(shí)了免疫效果與裂解疫苗相同，并可用于兒童。1980年英國首次批準(zhǔn)使用，而后擴(kuò)展到其它國家。在我國，以朱既明教授為首的一批科研工作者的辛勤工作下，建立了我國流感研究中心，并組織開發(fā)了超速離心提純的甲型流感單價(jià)滅活疫苗。隨著流感流行病學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)在流感流行中，常常有甲、乙型流感同時(shí)流行，特別是1976年以來，又形成了甲1(H1N1)及甲3(H3N2)同時(shí)流行的局面。因此，為了有效的預(yù)防流感，對流感滅活疫苗抗原的組成，不僅要求含有當(dāng)前流行株的同類抗原，而且必須含有同時(shí)流行的各種型或亞型的抗原成份。所以，我國先是研究生產(chǎn)了雙價(jià)及三價(jià)(甲1、甲3、乙型)流感滅活疫苗，并在長春生物制品研究所投入生產(chǎn)。在預(yù)防和控制流感的流行中取得了比較滿意的防病效果。
最初的流感滅活全病毒疫苗是從感染的雞胚尿囊液中分離流感病毒顆粒制成的。其工藝中單純的超速離心雖然收集了大部分的流感病毒，但有大量的宿主蛋白，這是流感滅活疫苗引起副反應(yīng)的主要原因之一。為了提高流感滅活疫苗的免疫原性，降低其副反應(yīng)，許多工作者致力于疫苗生產(chǎn)工藝的研究。目前，國內(nèi)外許多制造流感全病毒滅活疫苗的廠家，通常使用離心法和柱層析法從感染的雞胚尿液中分離流感病毒，用此種技術(shù)生產(chǎn)的病毒制品，純度是比較高的，疫苗接種后的副反應(yīng)性也有減弱。
隨著人們對流感疫苗免疫研究的深入，發(fā)現(xiàn)流感病毒的表面抗原，即血凝素和神經(jīng)氨酸酶所產(chǎn)生的抗體，對同型的流感病毒攻擊具有保護(hù)作用，而兩種表面抗原中產(chǎn)生抵抗力的主要是血凝素抗原。
血凝素抗原和神經(jīng)氨酸酶的抗原所賦予的免疫性在機(jī)制上是不同的。血凝素抗體中和病毒的感染性，并抑制最初的感染，而神經(jīng)氨酸酶抗體則限制病毒在感染個(gè)體中的散播，因而，限制了病毒自呼吸道擴(kuò)散并減少了疾病的嚴(yán)重性。目前，沒有證據(jù)表明流感病毒顆粒的主要內(nèi)部抗原，即核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)具有免疫性。由于以上的基礎(chǔ)研究工作的進(jìn)展，使人們在考慮疫苗的安全性和有效性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對工藝進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)出了流感裂解疫苗和流感亞單位疫苗。在開發(fā)過程中，很多科學(xué)工作者對裂解工藝進(jìn)行了改進(jìn)，如裂解劑的種類、濃度、裂解時(shí)間、裂解的時(shí)段等等，并且純化方法也有所提高。而不同的工藝使得最終病毒原液的性能也有所區(qū)別。這些研究成果，不僅為流感裂解疫苗明確了質(zhì)控指標(biāo)，而且為流感病毒滅活疫苗的新劑型和新技術(shù)打下了一定基礎(chǔ)。
由于在雞胚上流感病毒具有即強(qiáng)又快的適應(yīng)性，使得目前人們一直沿用雞胚來作為流感疫苗生產(chǎn)過程中病毒培養(yǎng)和增殖的基質(zhì)，這也使得在流感疫苗生產(chǎn)過程中，一直要嚴(yán)格控制生產(chǎn)用雞胚的質(zhì)量，使之不能受到各種病毒(尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒)污染。而與此同時(shí)，由于雞胚的擴(kuò)大生產(chǎn)受到多方面的影響，諸如禽流感、禽白血病等等，使得近年來國內(nèi)外加速研究用細(xì)胞作為流感病毒傳代增殖的基質(zhì)。目前美國使用一種傳代細(xì)胞，即MDCK細(xì)胞(一種狗腎細(xì)胞)進(jìn)行流感病毒的傳代取得突破，該細(xì)胞制備的疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)；而加拿大和我國的一些公司也在進(jìn)行傳代細(xì)胞為基質(zhì)的流感疫苗的研究。他們是在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)流感病毒，并且取得了一些進(jìn)展，其中進(jìn)展快一些的加拿大公司已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。然而，用這兩種傳代細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，都存在的共同問題是適應(yīng)期長，收獲的病毒滴度偏低等不足，而且傳代細(xì)胞DNA很難通過純化的方法去除，因此利用傳代細(xì)胞制備的疫苗具有致瘤性的潛在危險(xiǎn)。而原代細(xì)胞作為流感病毒增殖傳代的基質(zhì)細(xì)胞來制備流感疫苗，不僅解決了雞胚來源不足和疫苗易受逆轉(zhuǎn)錄病毒污染的問題，還解決了流感病毒在傳代細(xì)胞適應(yīng)慢和病毒滴度弱的不足的問題，同時(shí)由于原代地鼠腎細(xì)胞不具有傳代性，即細(xì)胞DNA不具有復(fù)制性，所以制備出來的疫苗不具有致瘤性的危險(xiǎn)。自80年代，我國的一些單位已經(jīng)將原代地鼠腎細(xì)胞應(yīng)用于狂犬疫苗制備，也有利用原代地鼠腎細(xì)胞來制備出血熱疫苗，如中國專利申請第99107985.X號公開的技術(shù)。這說明原代地鼠腎細(xì)胞可以應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)。然而，不同的病毒在原代細(xì)胞上的適應(yīng)性也不同，對原代細(xì)胞的不同培養(yǎng)方式以及病毒適應(yīng)時(shí)期都需要做大量的試驗(yàn)摸索，以促進(jìn)病毒的適應(yīng)性和病毒在原代細(xì)胞上的穩(wěn)定增殖性。國內(nèi)外還沒人有報(bào)道過利用原代地鼠腎細(xì)胞制備流感疫苗的先例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的流行性感冒疫苗(簡稱流感疫苗)，該疫苗是采用原代地鼠腎細(xì)胞作為流感病毒的增殖基質(zhì)制備的。
該流感疫苗不同于國內(nèi)外現(xiàn)有的采用雞胚作為病毒增殖的基質(zhì)的流感疫苗。其優(yōu)點(diǎn)在于，流感疫苗避免了爆發(fā)大規(guī)模雞瘟的情況下，雞胚的來源受限制的問題，同時(shí)也控制了由于雞胚的其他病毒(尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒)對疫苗的污染，消除了逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入機(jī)體導(dǎo)致腫瘤的危險(xiǎn)。
現(xiàn)在國內(nèi)外正在開發(fā)的傳代細(xì)胞制備的流感疫苗，如采用傳代Vero細(xì)胞或MDCK細(xì)胞制備的流感疫苗也具有很多缺點(diǎn)。首先，流感病毒在傳代的Vero細(xì)胞或MDCK細(xì)胞上適應(yīng)期長，收獲的病毒原液滴度偏低，其次純化過程中，傳代細(xì)胞的DNA很難去除，制備的疫苗中有一定的傳代細(xì)胞DNA殘留，致使疫苗具有致瘤性的潛在危險(xiǎn)。與之相比，采用采用原代地鼠腎細(xì)胞制備的流感疫苗，克服了上述流感疫苗的缺點(diǎn)。即流感病毒在原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)期短，收獲的病毒原液滴度高，制備過程中不考慮DNA的去除，因?yàn)樵摷?xì)胞基質(zhì)制備的疫苗原液中不含有對人體或其它動物具有致瘤性的可復(fù)制的DNA。這不僅簡化了純化步驟，同時(shí)也消除了疫苗使用者的恐懼心理。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種流行性感冒疫苗制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案按照本發(fā)明流行性感冒疫苗，是一種利用原代地鼠腎細(xì)胞作為流感病毒傳代增殖的基質(zhì)而制備的疫苗。由于流感病毒在原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)性好，制備的病毒原液血凝滴度高，所以純化過程中，原液的濃縮倍數(shù)比雞胚或傳代細(xì)胞制備的原液濃縮倍數(shù)低，同時(shí)減少了去除DNA的純化步驟，從而降低流感疫苗的工作成本。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗與采用傳代細(xì)胞制備的流行性感冒疫苗相比，該疫苗中沒有對人體或其它動物具有致瘤性的傳代細(xì)胞可復(fù)制的DNA。因?yàn)樵厥竽I細(xì)胞是直接有地鼠的腎臟組織制備而來的，這種細(xì)胞傳代能力很弱，即細(xì)胞中DNA復(fù)制很差，細(xì)胞個(gè)體分生2～3次后，其DNA就不具有復(fù)制能力了，所以本方法制備疫苗成品中沒可復(fù)制的DNA。而傳代細(xì)胞之所以稱之為傳代，是因?yàn)槠浼?xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能夠傳5代以上，在1次傳代過程中，細(xì)胞個(gè)體一般分生2～4次。對于現(xiàn)行開發(fā)的Vero細(xì)胞或MDCK細(xì)胞制備的流感疫苗，Vero細(xì)胞可以傳代150次以上，MDCK細(xì)胞可以傳代80次以上，可見兩種細(xì)胞的DNA在體外培養(yǎng)過程中復(fù)制能力是非常強(qiáng)的，所以利用該兩種傳代細(xì)胞制備的流感疫苗具有一定的致腫瘤的危險(xiǎn)。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的一個(gè)優(yōu)選方案，制備的疫苗可以是人、禽或其它動物的流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流感亞單位疫苗，其優(yōu)選為流感裂解疫苗。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法，包括如下步驟(a).將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原(SPF)雞胚適應(yīng)性傳代，作為主代種子；(b).原代地鼠腎細(xì)胞的制備及利用培養(yǎng)瓶或細(xì)胞生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)；(c).用主代種子感染原代地鼠腎細(xì)胞，并進(jìn)行適應(yīng)性傳代，直至得到病毒血凝效價(jià)不低于1∶640的毒種作為疫苗的工作種子；(d).用工作種子感染原代地鼠腎細(xì)胞，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，直至病毒血凝效價(jià)不低于1∶320為疫苗單價(jià)原液；(e).疫苗單價(jià)原液經(jīng)濃縮、滅活、純化后，將不同型別的單價(jià)病毒液進(jìn)行混合，分裝成成品。
上述步驟中的原代地鼠腎細(xì)胞可以是新制備的原代地鼠腎細(xì)胞，也可以是經(jīng)過培養(yǎng)了的原代地鼠腎細(xì)胞，優(yōu)選為經(jīng)過培養(yǎng)了的原代地鼠腎細(xì)胞，以增加細(xì)胞的量，有利于病毒感染后，提高病毒收獲液的血凝滴度；另外，與傳代細(xì)胞制備流感疫苗工藝比，在制備過程中沒有去除DNA的純化工序。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，將世界衛(wèi)生組織(WHO)每年推薦的或國家相關(guān)部門批準(zhǔn)的人流行性感冒病毒毒種或禽流行性感冒病毒毒種，通過1～3代的SPF雞胚適應(yīng)性傳代，作為主代種子，更優(yōu)選取血凝效價(jià)(HA)達(dá)到1∶320以上的雞胚尿囊液作為主代種子；主代種子到工作種子在原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)性傳代的次數(shù)為8代以內(nèi)，更優(yōu)選為3～6代。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，將地鼠進(jìn)行消毒處理后，無菌取腎、剪碎、用胰蛋白酶和EDTA組成的消化液將組織小塊消化分散成為單個(gè)細(xì)胞懸液，其細(xì)胞濃度優(yōu)選為約1.0×107～5.0×108個(gè)/ml。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)方式或感染了流感病毒后的原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)方式選自玻璃瓶貼壁培養(yǎng)、生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)或生物反應(yīng)器聚酯纖維片狀載體籃式培養(yǎng)。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，原代地鼠腎細(xì)胞用于所述的工作種子適應(yīng)性傳代和疫苗原液的制備，該原代地鼠腎細(xì)胞感染前，先進(jìn)行自身的擴(kuò)大培養(yǎng)。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入一定濃度的促生長劑作為生長液；流感病毒感染地鼠腎細(xì)胞后培養(yǎng)時(shí)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入一定濃度促生長劑作為細(xì)胞維持液(包括I和II)；所述促生長劑能促細(xì)胞生長和促病毒增殖，其成分為小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰島素、半胱氨酸和多聚賴氨酸中的一種或多種的組合；當(dāng)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體時(shí)，所述促生長劑的加量與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1∶1000到1∶10，當(dāng)培養(yǎng)基為干粉時(shí)，取相當(dāng)量，余量為水。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培養(yǎng)基中的一種或多種的組合，其配方根據(jù)培養(yǎng)的不同階段采取不同濃度配比。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，不論是在毒種制備還是在疫苗生產(chǎn)時(shí)，原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)階段，所用生長液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1∶50到1∶10；原代地鼠腎細(xì)胞感染流感病毒后采用的維持液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1∶1000到1∶50；當(dāng)培養(yǎng)基為干粉時(shí)，取相當(dāng)量，余量為水。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入的促生長劑優(yōu)選為小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸，每100ml生長液中含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為90～95ml(或相當(dāng)量的干粉培養(yǎng)基，余量為水)、小牛或胎牛血清為5～10克(相當(dāng)于5～10ml)、胰島素為0.005～0.05克、多聚賴氨酸為0.001～0.05克，更優(yōu)選小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸的重量份之比為80∶0.2∶0.1；原代地鼠腎細(xì)胞感染流感病毒后所用維持液I中加入的促生長劑優(yōu)選為人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素，每100ml的維持液I含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為75～97.5ml(或相當(dāng)量的干粉培養(yǎng)基，余量為水)、人血白蛋白0.5～5克(相當(dāng)于20％(質(zhì)量/體積)的人血白蛋白為2.5～25ml)、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰島素為0.005～0.05克，更優(yōu)選人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素的重量份之比為20∶1∶0.1；所用維持液II中加入的促生長劑優(yōu)選為人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶，100ml的維持液II含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基為90～99ml(或相當(dāng)量的干粉培養(yǎng)基，余量為水)、人血白蛋白0.2～2克(相當(dāng)于20％(質(zhì)量/體積)的人血白蛋白為1～10ml)、半胱氨酸為0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克，更優(yōu)選人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶的重量份之比為10∶1∶0.5。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，將腎組織消化下來的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或細(xì)胞生物反應(yīng)器中，接種后培養(yǎng)容器中的細(xì)胞初始濃度為約1.0×105～1.0×106個(gè)/ml，采用生長液培養(yǎng)60～80小時(shí)，換成維持液進(jìn)行病毒感染。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到細(xì)胞濃度為約1.0×107～1.0×108個(gè)/ml時(shí)，或者原代地鼠腎細(xì)胞在培養(yǎng)瓶(包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶等可用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿)中培養(yǎng)達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的約60％～80％或生物反應(yīng)器培養(yǎng)中細(xì)胞在載體上的貼壁率達(dá)到約70％～90％時(shí)，進(jìn)行流感病毒的感染。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，在用工作種子感染原代地鼠腎細(xì)胞時(shí)，原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子用維持液I稀釋102～104倍，然后感染原代地鼠腎細(xì)胞，并在37℃適應(yīng)吸附于細(xì)胞1～6小時(shí)，改變成32～35℃維持培養(yǎng)，感染后的1～2天，更換成維持液II，繼續(xù)維持培養(yǎng)1～3天，收獲細(xì)胞感染液及細(xì)胞。
按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個(gè)優(yōu)選方案，單價(jià)病毒液經(jīng)檢定合格后進(jìn)行離心、超濾濃縮、滅活、超速離心、凝膠層析以及不同型別的單價(jià)病毒液的混合后，分裝成成品。
本發(fā)明的流感疫苗的制備工藝方法通過了大量的試驗(yàn)研究，總結(jié)了原代地鼠腎細(xì)胞生長和生活特點(diǎn)。根據(jù)這些特點(diǎn)，充分驗(yàn)證了原代地鼠腎細(xì)胞能夠很好地應(yīng)用于流感疫苗毒種的適應(yīng)傳代，并能使該適應(yīng)株很好地保持原病毒株的毒力，且利用該病毒株可以在培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的原代地鼠腎細(xì)胞上增殖，生產(chǎn)出了優(yōu)質(zhì)的流行性感冒純化疫苗。由于地鼠繁殖能力強(qiáng)，生長快，其腎來源充足。與雞胚相比，體內(nèi)的腎臟不易受到其它病毒的污染，生產(chǎn)的流感疫苗不含其它病毒，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒；與傳代細(xì)胞制備的流感疫苗相比，疫苗原液中沒有致腫瘤性的傳代細(xì)胞可復(fù)制的DNA成分，簡便了疫苗的純化步驟，等等。這些優(yōu)點(diǎn)都有利于流感疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)；同時(shí)還解決了流感病毒在傳代細(xì)胞適應(yīng)慢和病毒滴度弱的不足的問題；尤其是在禽流感爆發(fā)時(shí)，由于雞的禽流感病毒感染的可能性使雞胚的來源中斷時(shí)，生產(chǎn)流感疫苗必須要通過其他有效的培養(yǎng)基質(zhì)和可以產(chǎn)業(yè)化的工藝進(jìn)行疫苗的生產(chǎn)，本方法解決了該項(xiàng)問題。該工藝制備的流感疫苗降低了使用者感染其它病毒的危險(xiǎn)以及降低了使用者潛在的致瘤性危險(xiǎn)。
具體實(shí)施例方式
一、流行性感冒病毒原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的毒種制備1.流行性感冒病毒毒種的獲取原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。上述三種毒種均購自英國國家生物制品及標(biāo)準(zhǔn)化控制研究所(NIBSC)，為WHO推薦的流感疫苗株。
2.主代病毒種子庫的建立將上述三種毒種分別在專用的無菌室內(nèi)啟封，在SPF雞胚上進(jìn)行1～3次適應(yīng)性傳代。將收獲的病毒尿囊液分別進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)的測定。無菌試驗(yàn)合格，選擇血凝效價(jià)(HA效價(jià))達(dá)到1∶320以上的作為生產(chǎn)用主代種子。并對其進(jìn)行EID50、HI及中和試驗(yàn)等指標(biāo)進(jìn)行檢定，建立主代病毒種子庫。
3.原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)選10～14日齡健康的金黃地鼠(Mesocricetus auratus，簡稱地鼠)，用飲用水殺死并清洗1～2次，用1‰新潔爾滅消毒1～3次，每次3～8分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA組成的消化液，置于2-8℃冷消化15～20小時(shí)，棄掉消化液，加入生長液分散細(xì)胞，并制備成1.0×107～1.0×108個(gè)/ml的懸液。取1～2ml細(xì)胞懸液接種于玻璃方瓶中，用生長液加至10ml，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí)棄掉生長液，用生理鹽水輕輕地漂洗1～3次細(xì)胞面，然后換成病毒感染液。生長液由基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM加入小牛(胎牛)血清、胰島素、多聚賴氨酸制成，其中每100ml生長液中含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為90～95ml、小牛(胎牛)血清為5～10ml、胰島素為0.005～0.05克、多聚賴氨酸為0.001～0.05克。
4.用主代流感病毒種子感染原代地鼠腎細(xì)胞用維持液I將主代流感病毒種子液稀釋102～104倍作為病毒感染液感染制備好了的細(xì)胞。維持液I是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素組成。其中每100ml的維持液I含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為75～97.5ml、20％(質(zhì)量/體積)的人血白蛋白為2.5～25ml、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰島素為0.005～0.05克。
5.原代地鼠腎細(xì)胞感染后培養(yǎng)(工作種子庫的建立)將感染后的培養(yǎng)瓶放于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，使病毒吸附1～5小時(shí)，然后改變溫度為32～35℃維持培養(yǎng)1～2天，更換一次維持液I。繼續(xù)維持培養(yǎng)1～2天，收獲病毒液。然后分別進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)的測定。如無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)在1∶640以下，則用病毒液繼續(xù)感染培養(yǎng)好了的地鼠腎細(xì)胞，同樣在32～35℃維持培養(yǎng)2～4天，收獲病毒液，再進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)(HA效價(jià))的測定。當(dāng)無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)(HA效價(jià))達(dá)到1∶640或以上時(shí)，將病毒液作為流行性感冒原代地鼠腎細(xì)胞純化疫苗生產(chǎn)用的工作種子。對其進(jìn)行EID50、HI及中和試驗(yàn)等指標(biāo)的檢定。
如收獲的病毒液無菌試驗(yàn)不合格，則重新利用主代病毒種子在原代地鼠腎細(xì)胞上適應(yīng)傳代。主代種子到工作種子，在地鼠腎細(xì)胞上適應(yīng)性傳代為8代以內(nèi)，一般為3～8代，更優(yōu)選3～6代，其毒株的抗原性、毒力、毒性與原始毒株應(yīng)當(dāng)保持一致。
二、疫苗原液的生產(chǎn)1.地鼠腎細(xì)胞的制備選10～14日齡健康的金黃地鼠，飲用水殺死并清洗1～2次，用1‰新潔爾滅消毒1～3次，每次3～8分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入由0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA組成的消化液，置于2～8℃冷消化15～20小時(shí)，棄掉消化液，加入生長液分散細(xì)胞，制備成1.0×107～1.0×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。取該原代細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞懸液∶生長液為1∶20～1∶100的比例接種于3L、10L轉(zhuǎn)瓶中或者接種于細(xì)胞生物反應(yīng)器中，再加入生長液，使細(xì)胞的初始濃度為1.0×105～5.0×106個(gè)/ml。轉(zhuǎn)瓶在37℃有CO2的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而細(xì)胞生物反應(yīng)器則設(shè)定好培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速為50～80rpm，溫度為36℃～38℃，pH為6.5～7.5，溶氧為15％～85％。
2.種子病毒的接種和疫苗原液的收獲當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)濃度達(dá)到1.0×107～1.0×108個(gè)/ml時(shí)；或者原代地鼠腎細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％或生物反應(yīng)器培養(yǎng)中細(xì)胞在載體上的貼壁率達(dá)到70％～90％時(shí)，用生理鹽水漂洗1～3次，換成維持液I。將原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子用維持液I稀釋103～105倍，然后進(jìn)行感染，并在37℃適應(yīng)吸附于細(xì)胞1～6小時(shí)，改變成32～35℃維持培養(yǎng)，感染后的1～2天，更換成維持液II。繼續(xù)維持培養(yǎng)1～3天，收獲細(xì)胞感染液及細(xì)胞，置于-60℃凍溶融2～3次后，取樣做無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)(HA效價(jià))測定。其中，維持液II是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基M199或者M(jìn)EM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶組成。100ml的維持液II含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基為90～99ml、20％(質(zhì)量/體積)的人血白蛋白為1～10ml、半胱氨酸為0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克。
三.疫苗原液的處理純化及疫苗的配制當(dāng)無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)達(dá)到1∶320以上時(shí)，則將單價(jià)病毒液，離心后進(jìn)行超濾濃縮，然后按滅活劑和單價(jià)病毒液的體積比1∶4000加入滅活劑進(jìn)行滅活，滅活劑為甲醛溶液或者β-丙內(nèi)酯溶液。然后進(jìn)行1000～2000rpm低速離心，取上清，經(jīng)過超濾，可使樣品濃縮20倍以上，同時(shí)去除相當(dāng)?shù)碾s質(zhì)。經(jīng)超速離心和Sepharose 4FF凝膠過濾層析純化，經(jīng)平衡、上樣、清洗和洗脫后，總回收可達(dá)80-90％，純化后的單價(jià)病毒液過濾除菌，并抽樣進(jìn)行單價(jià)病毒液檢定。然后根據(jù)不同單價(jià)原液血凝素抗原含量的相應(yīng)比例進(jìn)行混合(合并)，即為疫苗半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實(shí)施例一流行性感冒病毒原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的毒種制備原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。
將上述三種毒種在專用的無菌室內(nèi)啟封，分別在SPF雞胚上進(jìn)行2次適應(yīng)性傳代。最終收獲的病毒尿囊液，分別進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)(HA效價(jià))的測定。無菌試驗(yàn)合格，甲1和甲3的血凝效價(jià)均為1∶640，乙型的血凝效價(jià)為1∶320，從而建立生產(chǎn)用主種子庫。并對其進(jìn)行EID50、HI及中和試驗(yàn)等指標(biāo)的檢定。其結(jié)果見表1。
表1.流感主代毒種的檢定結(jié)果

取11日齡健康的金黃地鼠，用飲用水殺死并清洗2次，用1‰新潔爾滅消毒2次，每次5分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冰箱中冷消化18小時(shí)，棄掉消化液，用生理鹽水洗滌2次，加入生長液分散細(xì)胞，制備成4.0×107個(gè)/ml的懸液。生長液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM加入8％(以生長液為100的重量百分比)小牛血清、0.02％胰島素、0.01％多聚賴氨酸等細(xì)胞生長促進(jìn)劑。取2ml細(xì)胞懸液接種于玻璃方瓶中，再加入生長液8ml，放于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
培養(yǎng)40小時(shí)后，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí)，棄掉生長液，用生理鹽水輕輕地漂洗2次細(xì)胞面，換成維持液I。其組成為每100ml維持液I中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM 1克(培養(yǎng)基為干粉時(shí))、人血白蛋白2克、半胱氨酸0.1克、胰島素0.01克，其余的為水。同時(shí)，將主代單價(jià)的流感病毒種子用維持液I按103倍稀釋，分別進(jìn)行感染。感染后的培養(yǎng)瓶放于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，使病毒吸附4小時(shí)，然后改變溫度為34℃維持培養(yǎng)2天，將維持液I吸出換成新鮮的維持液I，繼續(xù)培養(yǎng)2天，收獲病毒液，分別進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)(HA效價(jià))。其無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)分別均為1∶320，收獲病毒液，并將其病毒液繼續(xù)感染培養(yǎng)好了的地鼠腎細(xì)胞，同樣34℃維持培養(yǎng)，4天時(shí)收獲病毒液，然后進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)的測定。無菌試驗(yàn)合格，甲1和乙型的血凝效價(jià)分別為1∶320，甲3的血凝效價(jià)為1∶640。保存病毒收液，同時(shí)也將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養(yǎng)瓶中(細(xì)胞達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí))，接種比例為4∶6(病毒收液∶維持液)34℃維持培養(yǎng)2天，收獲病毒液，進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)的測定。其檢定結(jié)果為無菌試驗(yàn)合格，可復(fù)制的DNA為陰性，血凝效價(jià)均為1∶640。將各單價(jià)收液分別分成兩部分，一部分冷凍干燥成凍干粉劑，一部分不凍干，并分別儲存于-70℃的超低溫冰箱中備用。
實(shí)施例二流行性感冒病毒原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的毒種制備原始毒種甲1(H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種甲3(H3N2)型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003(2004年WHO推薦)，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。
主代種子為實(shí)施例一制備的三個(gè)型別的流感主代種子。
地鼠腎解剖、制備細(xì)胞懸液以及接種玻璃瓶培養(yǎng)均同實(shí)施例一。
當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí)，漂洗后換成維持液I，并分別用維持液I按103倍稀釋各型別的主代流感病毒種子進(jìn)行感染。將感染后的培養(yǎng)瓶放于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，使病毒吸附6小時(shí)，然后改變溫度為34℃維持培養(yǎng)2天，收獲病毒液，分別進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)。其無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)均為1∶320，收獲病毒液，并將其病毒液繼續(xù)感染培養(yǎng)好了的地鼠腎細(xì)胞，同樣34℃維持培養(yǎng)3天，收獲病毒液，然后進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)(HA效價(jià))的測定。無菌試驗(yàn)合格，甲1和甲3的血凝效價(jià)(HA效價(jià))為1∶640，乙型的血凝效價(jià)(HA效價(jià))為1∶320。保存病毒收液，同時(shí)也將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養(yǎng)瓶中(細(xì)胞達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí))，接種比例為2∶3(病毒收液∶維持液)34℃維持培養(yǎng)3天，收獲病毒液，進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)(HA效價(jià))的測定。其檢定結(jié)果為無菌試驗(yàn)合格，血凝效價(jià)(HA效價(jià))為1∶640，保存病毒收液，同時(shí)再將收獲的病毒液接種于已換成維持液的培養(yǎng)瓶中(細(xì)胞達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％時(shí))，接種比例為1∶5(病毒收液∶維持液)34℃維持培養(yǎng)2天，收獲病毒液，進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血凝效價(jià)的測定。其檢定結(jié)果為無菌試驗(yàn)合格，甲1和乙型的血凝效價(jià)分別為1∶640，甲3的血凝效價(jià)(HA效價(jià))為1∶1280。將此收液分成兩部分，一部分冷凍干燥成凍干粉劑，一部分不凍干，并分別儲存于-70℃的超低溫冰箱中作為工作種子備用。
實(shí)施例三流感全病毒滅活疫苗的制備毒種為實(shí)施例二的原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子。
取11日齡健康的金黃地鼠，飲用水殺死并清洗2次，用1‰新潔爾滅消毒2次，每次5分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冷消化16小時(shí)，棄掉消化液，加入生長液分散細(xì)胞，并制備成5.0×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。取該原代細(xì)胞懸液15ml接種于3L轉(zhuǎn)瓶中，補(bǔ)加285ml的生長液，使細(xì)胞的初始濃度為2.5×106個(gè)/ml。轉(zhuǎn)瓶在37℃有CO2的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。2天后，原代地鼠腎細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)已達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的80％時(shí)，棄去細(xì)胞生長夜，用生理鹽水漂洗細(xì)胞培養(yǎng)面2次，換成維持液I，其換液量為270ml，同時(shí)分別感染30ml已制備好(用維持液I進(jìn)行103倍稀釋)的三個(gè)型別的單價(jià)流感地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的病毒工作種子。在37℃適應(yīng)吸附3小時(shí)，改變成34℃維持培養(yǎng)，感染后2天，換成維持液II。維持液II是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基M199加入1％(以維持液II為總量100計(jì))的人血白蛋白、0.1％的半胱氨酸、0.05％的胰蛋白酶組成。繼續(xù)維持培養(yǎng)3天，收獲細(xì)胞獲感染液，再將細(xì)胞撞下，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，并取樣做無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)測定。檢定結(jié)果為甲1、乙型為1∶640，甲3為1∶1280。
將上述檢定合格的單價(jià)病毒液合并，1000～2000rpm低速離心后，上清進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液再經(jīng)超速離心取沉淀，并用PBS溶解后按1∶4000加入滅活劑進(jìn)行甲醛溶液滅活。滅活的病毒液經(jīng)離子交換和凝膠過濾純化。其病毒回收率可達(dá)到90％以上，同時(shí)可使樣品濃縮20倍以上。純化后的單價(jià)病毒液過濾除菌，并抽樣進(jìn)行單價(jià)病毒液的檢定。其檢定結(jié)果為甲1、乙型為1∶10240，甲3為1∶20480。根據(jù)不同單價(jià)原液血凝素抗原含量，按2∶2∶1的比例進(jìn)行混合，加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為疫苗半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實(shí)施例四流感裂解疫苗的制備毒種為實(shí)施例二的原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子。
取腎制備的細(xì)胞懸液的過程同實(shí)施例三。取該原代細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為5.0×107個(gè)/ml)70ml接種于5L生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器中事先經(jīng)過滅菌以及裝有Cytodex 1(或Cytodex 3)的微載體，接種細(xì)胞后補(bǔ)加生長液至3.5L，使細(xì)胞的初始濃度為1.0×106個(gè)/ml。設(shè)定培養(yǎng)條件為，溫度37℃，pH6.7，溶氧35％。2天后取樣觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞的滿球率達(dá)到85％，細(xì)胞濃度為2.4×107個(gè)/ml。將帶有細(xì)胞的微載體自然沉降，排出生長液，用生理鹽水漂洗1次，然后更換成維持液I。將甲1型原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子用維持液I 1000倍稀釋，然后加入100ml于生物反應(yīng)器中進(jìn)行感染。并在不改變培養(yǎng)條件下，適應(yīng)吸附5小時(shí)，然后改設(shè)溫度為34℃，pH7.2，溶氧45％維持培養(yǎng)。感染后2天，換成維持液II，繼續(xù)維持培養(yǎng)2天，收獲細(xì)胞獲感染液，并將細(xì)胞從微載體上撞下，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，2000rpm離心去沉淀，并取樣做無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)測定。
同樣的方法，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞，而分別再感染甲3型和乙型的工作毒種，分別取樣測定無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)測定。
測定的結(jié)果無菌試驗(yàn)均合格，甲1、甲3的血凝效價(jià)均為1∶1280，乙型為1∶640。
將上述檢定合格的單價(jià)病毒液分別以1000～2000rpm低速離心后，上清進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液再經(jīng)超速離心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液對單價(jià)病毒液進(jìn)行滅活。滅活的單價(jià)病毒液加入Triton X100裂解液裂解1～2小時(shí)，再經(jīng)離子交換和凝膠過濾純化。收集抗原液，經(jīng)過濾除菌后成為單價(jià)病毒裂解液，并抽樣進(jìn)行的檢定。其檢定結(jié)果為甲1、甲3為1∶40960，乙型為1∶20480。根據(jù)不同單價(jià)疫苗血凝素抗原含量，按1∶1∶2的比例進(jìn)行混合，加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為裂解疫苗的半成品。檢定合格后分裝成為成品。
實(shí)施例五流感亞單位疫苗的制備毒種為實(shí)施例二的原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子。
原代地鼠腎細(xì)胞的制備同實(shí)施例二，細(xì)胞制備成5.0×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。取該原代細(xì)胞懸液35ml接種于5L籃式生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器以及其中的聚酯纖維片狀載體事先經(jīng)過滅菌處理并浸泡于生長液中，接種細(xì)胞后補(bǔ)加生長液至3.5L，使細(xì)胞的初始濃度為5.0×105個(gè)/ml。設(shè)定培養(yǎng)條件為，溫度37℃，pH6.8，溶氧40％。2天后取樣觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1.5×107個(gè)/ml。然后更換成維持液I，并感染已稀釋好的(1000倍稀釋)甲1型原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒工作種子100ml。在不改變培養(yǎng)條件下，適應(yīng)吸附4小時(shí)，然后改設(shè)溫度為34℃，pH7.2，溶氧50％維持培養(yǎng)。感染后2天，換成維持液II，設(shè)溫度為33℃，pH7.4，溶氧50％繼續(xù)維持培養(yǎng)3天，收獲感染液，同時(shí)將載體和部分維持液在無菌條件下取出，置于-60℃凍溶融后再與收獲液混合，2000rpm離心去沉淀，并取樣做無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)測定。
同樣的方法，利用籃式生物反應(yīng)器培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞，而分別再感染甲3型和乙型的工作毒種，分別取樣測定無菌試驗(yàn)和血凝效價(jià)測定。
測定的結(jié)果無菌試驗(yàn)均合格，三型血凝效價(jià)均為1∶1280。
將上述檢定合格的單價(jià)病毒液上清分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液再經(jīng)超速離心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液對單價(jià)病毒液進(jìn)行滅活。滅活的單價(jià)病毒液用Triton X100裂解液裂解和高壓勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì)后，經(jīng)離子交換和凝膠過濾，并收集HA和NA的抗原峰。再經(jīng)過濾除菌成為單價(jià)流感病毒亞單位疫苗的原液，并抽樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)，DNA檢測以及血凝效價(jià)測定。
其檢定結(jié)果無菌試驗(yàn)合格，可復(fù)制的DNA為陰性，甲1、甲3、乙型均為1∶20480，所以按1∶1∶1的比例進(jìn)行混合，并加入硫柳汞至終濃度0.008％作為防腐劑，即為裂解疫苗的半成品。檢定合格后分裝成為成品。
試驗(yàn)實(shí)施例一工作種子檢定的相關(guān)試驗(yàn)
(一)實(shí)驗(yàn)材料病毒株主代種子為實(shí)施例一所制備的三個(gè)型別的流感主代種子，工作種子為實(shí)施例二所制備的流感工作種子。
稀釋液等滲的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
陽性對照為實(shí)施例一所制備的主種子。
陰性對照PBS。
血球雞的紅血球，深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司制備。
雞胚11日齡的普通受精的雞胚，市售。
動物小白鼠，市售。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1.血凝效價(jià)測定試驗(yàn)1)在V型96孔板的12孔中，各加1滴約25μl的PBS；2)用微量稀釋棒蘸取待測病毒，依次與孔中的PBS混合稀釋。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照。
3)每孔中加2滴1％的雞紅血球，混勻，4℃、60分鐘后觀察并判定結(jié)果。
2.工作毒種的EID50測定試驗(yàn)采用固定血清稀釋病毒法，將病毒稀釋成10-6、10-7、10-8、10-9，與等量的血清混合作用適當(dāng)時(shí)間后，接種雞胚尿囊腔，每個(gè)稀釋度接種4個(gè)雞胚。孵化72hr后，收獲尿囊液，分別測定血凝效價(jià)。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照。按照Reed和Muench法計(jì)算待測病毒的EID50。
3.工作毒種血凝抑制(HI)試驗(yàn)1)在96孔凝板的12孔中，各加一滴約25μL PBS；2)用微量稀釋棒蘸到待測抗血清或標(biāo)準(zhǔn)血清，依次與孔中的PBS混合稀釋。再滴加等量的標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測抗原；3)每孔中加1滴1％的雞紅血球，用微量震蕩儀混勻，4℃、60分鐘后，觀察并判定結(jié)果。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照。
4.工作毒種的中和試驗(yàn)采用固定血清稀釋病毒法，同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照。接種雞胚尿囊腔，每個(gè)稀釋度0.2ml接種4個(gè)雞胚。孵化72小時(shí)后，收獲尿囊液，分別測定血凝效價(jià)。按照Reed和Muench法計(jì)算待測病毒的中和指數(shù)。
5.工作毒種的傳代限度試驗(yàn)用原代地鼠腎細(xì)胞對三個(gè)型別的流感病毒株主代種子進(jìn)行連續(xù)適應(yīng)性傳代，并同時(shí)進(jìn)行毒種的HA測定、EID50及小白鼠安全試驗(yàn)。其結(jié)果見表2，說明流感病毒在原代地鼠腎細(xì)胞上連續(xù)傳遞10代內(nèi)毒力穩(wěn)定。
(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.經(jīng)血凝效價(jià)測定，甲1、甲3和乙型三型地鼠腎細(xì)胞已適應(yīng)的流感病毒工作毒種的血凝效價(jià)均在640～1280之間。
2.測定經(jīng)按照Reed和Muench法計(jì)算，甲1、甲3和乙型三個(gè)毒株工作毒種的EID50分別為10-9.0、10-9.25和10-9.253.甲1、甲3和乙型三個(gè)毒株工作毒種的HI效價(jià)均大于640。
4.甲1、甲3和乙型三個(gè)毒株工作毒種的中和指數(shù)分別為9.0logEID50/0.2ml、9.25logEID50/0.2ml和9.25logEID50/0.2ml。
5.生產(chǎn)毒種毒力、傳代限度及穩(wěn)定性見表2。
表2.毒種毒力、傳代限度及穩(wěn)定性結(jié)果

由上表可見，上述三株原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流行性感冒病毒的工作種子，其血凝效價(jià)均在640以上，型別及亞型完全正確。其EID50分別為10-9.0/0.2ml、10-9.25/0.2ml和10-9.25/0.2ml，與原始毒種具有相似的免疫原性。
試驗(yàn)實(shí)施例二流感病毒原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)株穩(wěn)定性試驗(yàn)(一)實(shí)驗(yàn)材料病毒種子實(shí)施例二中制備的三個(gè)型別的原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感工作種子。
(二)實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄XF的方法，對以上樣品定期進(jìn)行活性測定。
(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果-70℃條件下保存的凍干種子及液體種子，在不同的保存時(shí)間，對其EID50以及HA的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4、表5。
表3.主代種子庫

表4.地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒株工作種子在-70℃保存不同時(shí)間EID50的穩(wěn)定性結(jié)果

表5.地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)的流感病毒株工作種子在-70℃保存不同時(shí)間HA的穩(wěn)定性結(jié)果

試驗(yàn)實(shí)施例三疫苗免疫原性或效力試驗(yàn)本試驗(yàn)的目的是觀察流行感冒病毒亞單位疫苗免疫小鼠后免疫原性是否良好，產(chǎn)生中和抗體能力如何。為判斷疫苗效果提出一個(gè)試驗(yàn)依據(jù)或參考標(biāo)準(zhǔn)。
(一)試驗(yàn)材料1.疫苗為實(shí)施例三所制備的三批流感疫苗疫苗產(chǎn)品，分別為20050601，20050602和20050603。疫苗的血滴度均為1∶2560。
2.小白鼠深圳光明衛(wèi)武制品公司提供。體重18～20克健康小白鼠。
3.病毒株實(shí)施例二所制備的工作種子，每個(gè)毒株分別制成含有100～1000個(gè)EID50的新鮮病毒液備用。
4.雞胚為9～11日齡健康雞胚。
5.1％雞血球，深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司自行配制。
6.稀釋疫苗的稀釋液為生理鹽水或PBS，病毒稀釋液為維持液II。
(二)實(shí)驗(yàn)方法將疫苗兩倍連續(xù)稀釋，由1∶40至1∶280各稀釋度分別免疫體重18～20克小白鼠12只，腹腔注射每支0.5ml，同時(shí)任選12只不予免疫，并與免疫組小白鼠置相同條件下飼養(yǎng)，作為對照。
免疫14天后，每個(gè)稀釋度及對照各取10只小鼠，分別采血，同一稀釋度者混于一個(gè)試管中，分離血清后，立即置56℃水浴中滅活30分鐘，然后與疫苗毒種100～1000EID50病毒量相混合，置37℃水浴中和30分鐘。
中和后立即接種9-11日齡雞胚，每個(gè)稀釋度及對照至少接種四個(gè)雞胚，每胚尿囊腔0.1ml。置35℃培育，48-72小時(shí)后冷胚，收獲尿囊液每胚0.25ml，加入1％雞血球0.25ml，做直接血凝。對照組血清中和結(jié)果均為HA陽性，免疫組按Reed和Muench氏法計(jì)算50％中和效價(jià)。
(三)試驗(yàn)結(jié)果三批價(jià)流行性感冒病毒疫苗免疫小白鼠，其血清對甲1(IVR-116)，甲3(NYMC X-15F)，乙型(B/Jiangsu/10/2003)地鼠腎適應(yīng)毒株由原代地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗中和試驗(yàn)結(jié)果見表6。
表6.流行性感冒病毒疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果

注分子為中和試驗(yàn)雞胚尿囊液直接血凝陽性數(shù)。
從上表的結(jié)果可以看出，三批疫苗的50％保護(hù)稀釋度在1∶320～1∶640之間。使用該工藝生產(chǎn)的流感滅活疫苗的50％中和效價(jià)均在1∶640以上，與進(jìn)口樣品效果相當(dāng)。
試驗(yàn)實(shí)施例四疫苗抗原性試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料抗原疫苗批號為20050601，20050602和20050603，深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
動物小白鼠，體重16～18克。深圳光明衛(wèi)武制品公司提供。
(二)實(shí)驗(yàn)方法將三批疫苗分別免疫小白鼠各10只，每只小鼠皮下接種0.2ml，另取10只小白鼠皮下接種生理鹽水，置相同條件下飼養(yǎng)。免疫后21天，分別采血分離血清，用血凝及血凝抑制試驗(yàn)方法測定抗體效價(jià)。
(三)試驗(yàn)結(jié)果抗原性試驗(yàn)結(jié)果見表7。
表7.抗原性試驗(yàn)結(jié)果

從上表可以看到，使用本工藝制備的裂解型流感滅活疫苗接種小鼠后，針對各亞型抗原產(chǎn)生的抗體水平均在1∶480以上，可以認(rèn)為我們的疫苗接種是有效的。
試驗(yàn)實(shí)施例五疫苗的過敏性試驗(yàn)
(一)試驗(yàn)材料(1)疫苗實(shí)施例三制備的流感疫苗。
(2)豚鼠體重300～400克。
(3)標(biāo)準(zhǔn)過敏原(陽性對照)牛血清白蛋白，分析純。
(4)陰性對照無菌的生理鹽水。
(二)實(shí)驗(yàn)方法按照現(xiàn)行的中華人民共和國藥典要求的方法進(jìn)行。取流感疫苗各6ml，皮下接種3只豚鼠，每只接種1ml，間隔一周，進(jìn)行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏。第二次注射后三周，再以相同樣品靜脈注射，每只0.5ml。觀察豚鼠有無過敏性反應(yīng)出現(xiàn)。同時(shí)設(shè)陰性和陽性對照。
(三)試驗(yàn)結(jié)果第三次注射后當(dāng)天及三天內(nèi)觀察結(jié)果9只豚鼠未見鼻癢、噴嚏、煩躁不安或呼吸困難或休克、痙攣等過敏反應(yīng)癥狀，全部試驗(yàn)動物健康存活。而陽性對照均有不同程度的過敏反應(yīng)癥狀噴嚏、煩躁不安、呼吸困難或休克、痙攣等。見下表。
表8.疫苗過敏原性試驗(yàn)結(jié)果

可見，本疫苗樣品接種豚鼠進(jìn)行過敏原性試驗(yàn)，最后一次注射后連續(xù)觀察三天，全部豚鼠均一切正常。說明本疫苗對豚鼠過敏原性試驗(yàn)為陰性。
試驗(yàn)實(shí)施例六異常毒性試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料(1)疫苗實(shí)施例三制備的流感疫苗。
(2)試驗(yàn)動物小白鼠18～20克。共10只。
豚鼠300g左右，10只。
(二)實(shí)驗(yàn)方法腹腔注射法。小白鼠，2ml/只；豚鼠，5ml/只。將小白鼠和豚鼠分別隨機(jī)均分為兩組一組為實(shí)驗(yàn)組，另一組為對照。小白鼠為皮下接種，接種劑量0.5ml/只；豚鼠為腹腔接種，接種劑量5ml/只。注射前稱量體重，注射后逐日觀察精神狀態(tài)、食欲和體溫等變化，并于結(jié)束前再稱體重。以精神狀態(tài)、食欲和體溫等正常，結(jié)束前體重由所增加為無異常毒性試驗(yàn)，即為合格。
(三)試驗(yàn)結(jié)果表9.疫苗異常毒性試驗(yàn)結(jié)果

14日后，各實(shí)驗(yàn)組受試動物均存活，同時(shí)體重均有不同程度的增加，可見疫苗沒有異常毒性反應(yīng)，疫苗是安全的。
試驗(yàn)實(shí)施例七過敏原性試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料(1)疫苗實(shí)施例三制備的流感疫苗。
(2)對照陽性對照為小牛血清；陰性對照為生理鹽水。
(3)試驗(yàn)動物健康豚鼠，體重為300～400克，9只。
(二)實(shí)驗(yàn)方法取疫苗10ml，同時(shí)以小牛血清作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。皮下接種三只豚鼠，每只接種1ml，間隔一周后進(jìn)行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同樣品靜脈注射每只0.5ml，觀察豚鼠有無過敏性反應(yīng)出現(xiàn)。
(三)試驗(yàn)結(jié)果表10.觀察的結(jié)果記錄

備注疫苗組1、2、3，陰性對照組4、5、6，陽性對照組7、8、9。
靜脈注射后當(dāng)天及三天內(nèi)觀察可見接種疫苗組三只豚鼠未出現(xiàn)鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏反應(yīng)癥狀，全部實(shí)驗(yàn)動物健康存活；陽性對照組的三只實(shí)驗(yàn)動物中有三只出現(xiàn)呼吸困難、輕度休克。試驗(yàn)說明，此工藝制備的流感疫苗動物不會發(fā)生過敏反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗是一種利用原代地鼠腎細(xì)胞作為流感病毒傳代增殖的基質(zhì)而制備的疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗沒有對人體或其它動物具有致瘤性的傳代細(xì)胞可復(fù)制的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗為人、禽或其它動物流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流感亞單位疫苗。
4.一種流行性感冒疫苗的制備方法，包括如下步驟(a).將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原雞胚適應(yīng)性傳代，作為主代種子；(b).原代地鼠腎細(xì)胞的制備及利用培養(yǎng)瓶或細(xì)胞生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)；(c).用主代種子感染原代地鼠腎細(xì)胞，并進(jìn)行適應(yīng)性傳代，直至得到病毒血凝效價(jià)不低于1∶640的毒種作為疫苗的工作種子；(d).用工作種子感染原代地鼠腎細(xì)胞，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，直至病毒血凝效價(jià)不低于1∶320為疫苗單價(jià)原液；(e).疫苗單價(jià)原液經(jīng)濃縮、滅活、純化后，將不同型別的單價(jià)病毒液進(jìn)行混合，分裝成成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，將世界衛(wèi)生組織每年推薦的或國家相關(guān)部門批準(zhǔn)的人流行性感冒病毒毒種或禽流行性感冒病毒毒種，通過1～3代的無特定病原雞胚適應(yīng)性傳代，取血凝效價(jià)達(dá)到1∶320以上的雞胚尿囊液作為主代種子；主代種子到工作種子在原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)性傳代的次數(shù)為3～6代。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)方式或感染了流感病毒后的原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)方式選自玻璃瓶貼壁培養(yǎng)、生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)或生物反應(yīng)器片狀載體籃式培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入促生長劑作為生長液；流感病毒感染地鼠腎細(xì)胞后培養(yǎng)時(shí)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入促生長劑作為細(xì)胞維持液；所述促生長劑能促細(xì)胞生長和促病毒增殖，其成分為小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰島素、半胱氨酸和多聚賴氨酸中的一種或多種的組合；當(dāng)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體時(shí)，所述促生長劑的加量的重量與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積之比為1∶1000到1∶10，當(dāng)培養(yǎng)基為干粉時(shí)，取相當(dāng)量，余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，在原代地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)階段，所用生長液中促生長劑的加量的重量與所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量的體積之比為1∶50到1∶10；原代地鼠腎細(xì)胞感染流感病毒后采用的維持液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積比為1∶1000到1∶50。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培養(yǎng)基中的一種或多種的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流行性感冒疫苗的制備方法，其特征在于，原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到細(xì)胞濃度為1.0×107～1.0×108個(gè)/ml時(shí)，或者原代地鼠腎細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)達(dá)到占據(jù)培養(yǎng)面的60％～80％或生物反應(yīng)器培養(yǎng)中細(xì)胞在載體上的貼壁率達(dá)到70％～90％時(shí)，進(jìn)行流感病毒的感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種流行性感冒原代地鼠腎細(xì)胞多價(jià)純化疫苗其制備方法，該疫苗中不含有致瘤性的傳代細(xì)胞可復(fù)制的DNA。其制備方法是采用原代地鼠腎細(xì)胞為病毒培養(yǎng)基質(zhì)，將每年世界衛(wèi)生組織推薦的、或國家相關(guān)部門批準(zhǔn)的人流感病毒或禽流感病毒毒種，通過原代地鼠腎細(xì)胞的適應(yīng)傳代，短時(shí)間內(nèi)獲得能在原代地鼠腎細(xì)胞中進(jìn)行適應(yīng)增殖的流感病毒株，該毒株具有與當(dāng)年流行的流感病毒原始毒株相似的免疫原性，并且能夠利用培養(yǎng)瓶或細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)該感染了人(或禽)流感病毒的地鼠腎細(xì)胞，從而收獲流感病毒原液，進(jìn)而通過離心、超濾、滅活等初步純化和進(jìn)一步的超速離心及柱層析等精制純化步驟，得到符合疫苗要求的流行性感冒疫苗。
文檔編號A61P31/16GK1911445SQ20061011212
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日
發(fā)明者李云英, 王玉清, 吳歧 申請人:深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司