專利名稱：在鑲片鐮孢的酶缺陷突變體中產(chǎn)生多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在酶缺陷鑲片鐮孢突變體菌株中產(chǎn)生多肽的方法，酶缺陷鑲片鐮孢突變體菌株和獲得酶缺陷鑲片鐮孢突變體菌株的方法。
背景技術(shù)：
已顯示鑲片鐮孢可用作宿主細(xì)胞以供重組產(chǎn)生具有生物活性的多肽(W0 96/00787，WO 97Λ6330)。具有所需性狀即增加的蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌的鑲片鐮孢宿主并不一定具有成功發(fā)酵最需要的特性。發(fā)酵可能并非最優(yōu)的，因為生物物質(zhì)例如酶的產(chǎn)生有害于特定的目標(biāo)多肽的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用。WO 99/60137公開了鑲片鐮孢的單端孢霉烯缺陷突變體。WO 00/42203公開了鑲片鐮孢的環(huán)己縮肽缺陷突變體。本發(fā)明涉及改進(jìn)的鑲片鐮孢宿主，其組合了用于表達(dá)商業(yè)量的目標(biāo)多肽的能力， 同時在使所述多肽的回收和下游加工復(fù)雜化的酶的產(chǎn)生中有缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本鑲片鐮孢(Fusarium venenatum) 菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸以及選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個 (幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶；和(b)從培養(yǎng)基回收所述多肽。在產(chǎn)生多肽的方法的一個方面，所述突變體菌株還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素(trichodiene)合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。本發(fā)明還涉及親本鑲片鐮孢菌株的突變體，包含編碼多肽的多核苷酸以及選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶。在一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株的突變體還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。本發(fā)明還涉及獲得親本鑲片鐮孢菌株突變體的方法，包括(a)修飾選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA ；和(b)鑒定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶。在一個方面，所述獲得親本鑲片鐮孢菌株的突變體的方法還包括修飾基因tri5 和dpsl之一或兩者使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。附圖簡述

圖1顯示pDM156. 2的限制圖譜。圖2顯示pEmY21的限制圖譜。圖3顯示pEmY23的限制圖譜。圖4顯示pWTY1470-19-07的限制圖譜。圖5顯示pWTY1515-2-01的限制圖譜。圖6顯示pJaL504_[BamHI]的限制圖譜。圖7顯示pJaL504-[BglII]的限制圖譜。圖8顯示pJaL574的限制圖譜。圖9顯示pWTY1449-02-01的限制圖譜。圖10顯示pJfySlM0-75-5的限制圖譜。圖11顯示pJfyS1579-l_13的限制圖譜。圖12顯示pJfyS1579-8_6的限制圖譜。圖13顯示pJfyS1579-21_16的限制圖譜。圖14顯示pAlLo 1492- 的限制圖譜。圖15顯示pJfyS1579-;35-2的限制圖譜。圖16顯示pJfyS1579-41_ll的限制圖譜。圖17顯示pJfyS1604-55_13的限制圖譜。圖18顯示pJfyS1579-93_l的限制圖譜。圖19顯示pJfyS1604-17_2的限制圖譜。圖20顯示pEJG61的限制圖譜。圖21顯示pEJG69的限制圖譜。圖22顯示pEJG65的限制圖譜。圖23顯示pMMrl9的限制圖譜。圖24顯示pEJG49的限制圖譜。圖25顯示pEmY15的限制圖譜。圖26顯示pEmYM的限制圖譜。圖27顯示pDM257的限制圖譜。
圖觀顯示pDM258的限制圖譜。圖四顯示鑲片鐮孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的轉(zhuǎn)化體的相對乳糖
氧化酶產(chǎn)率。圖30顯示鑲片鐮孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的轉(zhuǎn)化體的相對 α-淀粉酶活性。圖31顯示pJfyS1698-65_15的限制圖譜。圖32顯示pJfyS1698-72_10的限制圖譜。圖 33 顯示鑲片鐮孢 JfyS1763_l 1-01 (Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA)的轉(zhuǎn)化體的相對堿性蛋白酶活性。圖34顯示pJfyS1879-32_2的限制圖譜。圖35顯示pJfySlll的限制圖譜。定義乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶術(shù)語“乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶”在本文中定義為一種UTP 氨連接酶(形成ADP) (EC 6. 3. 4. 2)，其催化ATP+UTP+NH3至ADP+磷酸+CTP的轉(zhuǎn)化。就本發(fā)明而言，乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶活性是依照Liberman，1956，Journal of Biological Chemistry 222:765-775)所述的方法確定的。α -淀粉酶術(shù)語“ α -淀粉酶”在本文中定義為一種1，4_α _D_葡聚糖葡聚糖水解酶(EC 3. 2. 1. 1)，其催化含有三個或更多1，4- α -連接D-葡萄糖單元的多糖中1， 4-α-D-糖苷連接的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，α-淀粉酶活性是使用4，6-乙叉(G7)-對硝基苯基(Gl) - α -D-麥芽庚糖苷(4，6-ethylidene (G7) -p-nitrophenyl (Gl) -alpha-D-malt oheptaside)作為底物使用 Sigma Chemical Co. Kit 577 (St. Louis,M0, USA)在 pH 7. 0 確定的。堿性蛋白酶術(shù)語“堿性蛋白酶”在本文中定義為一種絲氨酸蛋白酶，其催化蛋白質(zhì)中肽鍵的水解。就本發(fā)明而言，堿性蛋白酶活性是依照實施例觀所述的方法確定的。單端孢霉烯類術(shù)語“單端孢霉烯類”在本文中定義為倍半萜環(huán)氧化物的家族，其從trichodiene由一系列氧化、異構(gòu)化、環(huán)化和酯化得到更加復(fù)雜的單端抱霉烯類(Desjardins, Hohn 禾口 McCormick,1993, Microbiological Reviews 57 595-604)。單端孢霉烯類包括但不限于2-羥基trichodiene、12，13-環(huán)氧_9， 10-trichoene-2-酉享、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、isotrichodermol、 isotrichodermin、15_decalonectrin、3,15-didecalonectrin、脫氧雪腐鍵刀菌烯醇(deoxynivalenol)、3_乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、calonectrin、3，15- 二乙酰氧薦鐮刀菌烯醇(3，15-diacet0XyScirpen0l)、3，4，15-三乙酰氧薦鐮刀菌烯醇(3，4， 15-triacetoxyscirpenol)、4,15- 二乙酉先氧薦鐮刀菌烯酉享(4,15-diacetoxyscirpenol)、 3-乙酰新茄病鐮刀菌烯醇(3-acetylneosolaniol)、乙酰T_2毒素和Τ_2毒素；及其衍生物。單族毒素合酶術(shù)語“單族毒素合酶”在本文中定義為一種糊精-6-α-D-葡聚糖水解酶，其催化法尼基焦磷酸的異構(gòu)化-環(huán)化以生成二環(huán)鏈烯烴trichodiene。就本發(fā)明而言，單族毒素合酶活性是依照Hohn和Beremand，1989，Applied and Environmental Microbiology 55 :1500-1503 所述的方法確定的。
由本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株產(chǎn)生的單端孢霉烯類水平可使用本領(lǐng)域公知的方法確定(參見，例如 Rood 等，1988，Journal of Agricultural and Food Chemistry 36: 74-79 ；Romer,1986, Journal of the Association of Official Analytical Chemists 69 :699-703 ；McCormick 等，1990, Applied and Environmental Microbiology 56 702-706)。環(huán)己縮肽術(shù)語“環(huán)己縮肽”在本文中定義為由羥基和氨基酸通過酰胺和酯鍵連接組成的肽相關(guān)化合物的家族。術(shù)語環(huán)己縮肽包括但不限于恩鐮孢菌素(ermiatins)。恩鐮孢菌素術(shù)語“恩鐮孢菌素”在本文中定義為一類環(huán)己縮肽，其由三個D-2羥基異戊酸殘基交替地與L-氨基酸或N-甲基-L-氨基酸連接組成以產(chǎn)生18員環(huán)結(jié)構(gòu)。恩鐮孢菌素是具有離子載體特性的環(huán)己縮肽植物毒素(phytoxin)，由多種放線菌和絲狀真菌菌種，特別是鐮孢屬的菌株產(chǎn)生。恩鐮孢菌素包括但不限于恩鐮孢菌素AjpBjphjyBpC、 D、E禾PF ；及其哲 生物(Visconte 等，1992，Journal of Agricultural and Food Chemistry 40 :1076-1082 ；Tomodo 等，1992，Journal of Antibiotics 45 :1207-1215)，以及含有多于一種氨基酸的混合類型恩鐮孢菌素(hcher等1982，Biochemistry 21 :43-48)。恩鐮孢菌素的生物合成是由恩鐮孢菌素合成酶催化的，其為大的多功能性酶，具有從其初級前體，即D-2羥基異戊酸，一種支鏈L-氨基酸(例如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)，S-腺苷甲硫氨酸和ATP裝配恩鐮孢菌素的所有必需功能(R印er等，1995，European Journal of Biochemistry 230:119-126)。前體(D_2_羥基異戊酸和支鏈L-氨基酸)作為硫酯激活。共價結(jié)合的底物氨基酸殘基在S-腺苷甲硫氨酸的消耗下甲基化。然后發(fā)生肽鍵形成和環(huán)化反應(yīng)。環(huán)己縮肽合成酶術(shù)語“環(huán)己縮肽合成酶”在本文中定義為一種合成酶，其催化環(huán)己縮肽從D-2-羥基異戊酸，一種支鏈L-氨基酸(例如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)，S-腺苷甲硫氨酸和ATP的產(chǎn)生。就本發(fā)明而言，環(huán)己縮肽合成酶活性是通過依照hcher等，1982， Biochemistry 21 :43-48的方法測量環(huán)己縮肽的產(chǎn)生來確定的。具體而言，將環(huán)己縮肽合成酶與ImM纈氨酸，0. 2mM S-腺苷甲硫氨酸，0. 2mM D_2_羥基異戊酸，4mM ATP和4mM乙酸鎂以總體積100 μ 1在37°C在50mM MOPS pH 7. 0中溫育10分鐘。環(huán)己縮肽的量如WO 2000/92203 中所述基于 Visconti 等，1992，Journal of Agriculture and Food Chemistry 40 :1076-1082的方法來確定。一單位的環(huán)己縮肽合成酶活性定義為在37°C，pH 7. 0每分鐘產(chǎn)生LOymol環(huán)己縮肽。環(huán)己縮肽的水平可依照Visconti 等，1992，Journal of Agriculture and Food Chemistry 40 :1076-1082的方法來確定。具體而言，將一ml鑲片鐮孢不含細(xì)胞的培養(yǎng)液用 2. Oml乙酸乙酯萃取兩次。將合并的有機萃取物在氮氣流下蒸干，并重新溶解于0.5ml己烷。將一微升樣品使用以電子沖擊(EI)模式操作的Hewlett-Packard 6890GC/Series MSD 系統(tǒng)進(jìn)行分析。將樣品在柱上進(jìn)樣，并利用DB-5毛細(xì)管柱(30mX0.25mm，0.25ym薄膜)采用下述溫度程序來分離以15°C /分鐘的速率從120°C加熱至300°C。例如，恩鐮孢菌素A、 A1、B、B1、B2和B3通過m/z比例分別鑒定為682、668、640、654、6洸和612的(M++H)離子。缺陷術(shù)語“缺陷”在本文中定義為一種鑲片鐮孢突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比，不產(chǎn)生可檢測的一個或多個(幾個)選自下組的酶的活性 乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶，或者還包括酶單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶的之一或兩者的活性，或者，與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比， 優(yōu)選產(chǎn)生至少25%更少，更優(yōu)選至少50%更少，甚至更優(yōu)選至少75%更少，且最優(yōu)選至少 95%更少的一個或多個(幾個)選自下組的酶乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶，或者還包括酶單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶的之一或兩者。由本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株產(chǎn)生的酶水平可使用本文中所述或本領(lǐng)域中已知的方法確定。鑲片鐮孢突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的相應(yīng)親本絲狀真菌細(xì)胞相比，優(yōu)選產(chǎn)生至少25 %更少，更優(yōu)選至少50 %更少，甚至更優(yōu)選至少75 %更少，最優(yōu)選至少95 %更少， 且甚至最優(yōu)選無單端孢霉烯。所述親本和突變體細(xì)胞可在有助于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的條件下或在有助于產(chǎn)生單端孢霉烯的條件下比較單端孢霉烯的產(chǎn)生。鑲片鐮孢突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的相應(yīng)的親本絲狀真菌細(xì)胞相比，優(yōu)選產(chǎn)生至少25%更少，更優(yōu)選至少50%更少，甚至更優(yōu)選至少75%更少，最優(yōu)選至少95%更少，且甚至最優(yōu)選無環(huán)己縮肽。所述親本和突變體細(xì)胞可在有助于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的條件下或在有助于產(chǎn)生環(huán)己縮肽的條件下比較環(huán)己縮肽的產(chǎn)生。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，如通過SDS-PAGE測定，所述多肽為至少1 %純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10% 純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純， 且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10 %，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多 4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少 95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99% 純，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為基本上純的形式，即，多肽制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這可以通過如下實現(xiàn)例如，通過公知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基
化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用在EMBOSS包(EMBOSS =The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,Trends in Genetics 16 :276-277)的Needle程序中實施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol.Biol.48 :443-453)來確定，優(yōu)選3. 0. 0版本或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10，缺口延伸罰分(gap extension penalty) 0· 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longest identity) ”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下
(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度通過在EMBOSS包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，見上文)的 Needle 程序中實施的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，見上文) 來確定，優(yōu)選3. 0.0版本或更高版本。使用的可選為參數(shù)缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有酶活性，例如乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶，堿性蛋白酶，單族毒素合酶或環(huán)己縮肽合成酶活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence) ”在本文中定義為從成熟多肽編碼序列的5’ 和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有酶活性例如乳清苷-5’-單磷酸脫羧酶，α -淀粉酶，堿性蛋白酶，單族毒素合酶或環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽片段。等位變體(allelic variant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸本文中術(shù)語“分離的多核苷酸”指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10 %純，更優(yōu)選至少20 %純，更優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸本文中術(shù)語“基本上純的多核苷酸”指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%， 更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%純，并且甚至最優(yōu)選至少99. 5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文中，術(shù)語“編碼序列，，意指直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。 起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自 mRNA的cDNA缺乏任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明編碼序列表達(dá)所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(control sequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括表達(dá)本發(fā)明編碼多肽的多核苷酸必需的所有組分。每個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。此類調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和目的為引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞術(shù)語“宿主細(xì)胞”如用于本文中，包括任何易受包含本發(fā)明多肽的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞類型。修飾術(shù)語“修飾”在本文中定義為對311^4、31 4、(1 81、？7冗和/或丨1^5在基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控序列中引入、取代或去除一個或多個核苷酸，或基因破壞、基因轉(zhuǎn)化、基因缺失或隨機或特異性誘變，或其組合。amyA、alpA、dpsUpyrG和tri5基因的一個或多個(幾個)的缺失可為部分的或完全的。修飾導(dǎo)致pyrG、amyA、alpA、tri5、dpSl或其組合的表達(dá)的減少或消除(失活)。在一個優(yōu)選的方面，一個或多個(幾個)失活。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本鑲片鐮孢菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸以及一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶；和(b)從培養(yǎng)基回收所述多肽。在一個方面，所述突變體菌株還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是一個或多個(幾個)可能有害于特定目標(biāo)多肽的產(chǎn)生、下游加工例如回收、和/或應(yīng)用的酶活性的消除或減少。在本發(fā)明的方法中，親本鑲片鐮孢菌株可為野生型鑲片鐮孢菌株或其突變體。 應(yīng)理解的是，術(shù)語“鑲片鐮孢”還包括鑲片鐮孢的變體(參見，例如Robert A. Samsom和 John I. Pitt 編，Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification, Harwood Academic Publishers, The Netherlands)。在一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株是鑲片鐮孢A3/5。在另一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株是鑲片鐮孢NRRL 30747。在另一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株是鑲片鐮孢ATCC 20334。在另一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株是形態(tài)突變體(W0 97/26330)。酶缺陷鑲片鐮孢突變體菌株可通過使用本領(lǐng)域公知的方法如插入、破壞、替代或缺失來減少或消除一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA或者還包括基因tri5和dpsl之一或兩者來構(gòu)建。可修飾基因的一部分如編碼區(qū)或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)控序列。此種基因調(diào)控序列可為啟動子序列或其功能性部分，即足以影響基因表達(dá)的部分。例如，可失活啟動子序列導(dǎo)致無表達(dá)，或可用較弱啟動子替換天然啟動子序列以減少編碼序列的表達(dá)。其它用于可能的修飾的調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、前肽序列、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。所述鑲片鐮孢突變體菌株可通過基因缺失技術(shù)消除或減少基因表達(dá)來構(gòu)建。基因缺失技術(shù)使得基因能夠部分或完全去除，由此消除其表達(dá)。在此類方法中，基因缺失是通過使用構(gòu)建以連續(xù)含有基因5’和3’側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒進(jìn)行的同源重組來達(dá)成的。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過在基因或其轉(zhuǎn)錄或表達(dá)所需的調(diào)控序列中引入、取代和/或去除一個或多個(幾個)核苷酸來構(gòu)建。例如，可插入或去除核苷酸以導(dǎo)致終止密碼子的引入、起始密碼子的去除或開讀框的移碼。此種修飾可通過定點誘變或PCR 生成的誘變依照本領(lǐng)域已知方法來達(dá)成。參見，例如Botstein和Siortle，1985，Science 229 :4719 ；Lo 等，1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 2285 ；Higuchi φ,1988, Nucleic Acids Research 16 :7351 ；Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57 157 ；Ho 等，1989，Gene 77 :61 ；Horton 等，1989，Gene 77 :61 ；以及 Sarkar 和 Sommer,1990, BioTechniques 8 :404。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過基因破壞技術(shù)來構(gòu)建，即將破壞性核酸構(gòu)建體插入基因，所述破壞性核酸構(gòu)建體包含與所述基因同源的核酸片段，該片段會產(chǎn)生同源區(qū)域的復(fù)制并將構(gòu)建體DNA并入復(fù)制區(qū)域之間。如果插入的構(gòu)建體將基因的啟動子與編碼區(qū)分開或中斷編碼序列從而導(dǎo)致非功能性基因產(chǎn)物，則此種基因破壞可消除基因表達(dá)。破壞性構(gòu)建體可簡單地為伴以與所述基因5’和3’區(qū)同源的區(qū)域的選擇性標(biāo)記基因。所述選擇性標(biāo)記使得能夠鑒定含有受破壞基因的轉(zhuǎn)化體。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過基因轉(zhuǎn)化的方法來構(gòu)建(參見，例如Iglesias 禾口 Trautner，1983，Molecular General Genetics 189:73-76)。例如,在基因轉(zhuǎn)化方法中， 將對應(yīng)于所述基因的核苷酸序列在體外誘變以產(chǎn)生缺陷型核苷酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本鑲片鐮孢菌株以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷型核苷酸序列替代內(nèi)源基因。可能需要所述缺陷型核苷酸序列也包含用于選擇含有所述缺陷型基因的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過已確立的使用互補于基因核苷酸序列的核苷酸序列的反義技術(shù)來構(gòu)建(Parish 和 Stoker，1997，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 154 151-157)。更具體而言，鑲片鐮孢菌株的基因表達(dá)可通過引入互補于基因核苷酸序列的核苷酸序列來減少或失活，所述核苷酸序列可在株中轉(zhuǎn)錄，并能夠雜交于株中產(chǎn)生的mRNA。在使得所述互補反義核苷酸序列能夠雜交于所述mRNA的條件下，翻譯的蛋白質(zhì)的量由此減少或消除。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過已確立的RNA干擾(RNAi)技術(shù)來構(gòu)建(參見， 例如 WO 2005/056772)。所述鑲片鐮孢突變體菌株還可通過隨機或特異性誘變使用本領(lǐng)域公知方法來構(gòu)建，所述方法包括但不限于化學(xué)誘變(參見，例如Hopwood，The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J. R. Norris 禾口 D. W. Ribbons 編)pp 363-433, Academic Press, New York, 1970)。基因修飾可通過對親本菌株進(jìn)行誘變并篩選其中基因表達(dá)減少或失活的突變體菌株來實施。誘變可為特異性的或隨機的，可通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，使用合適的寡核苷酸，或?qū)NA序列進(jìn)行PCR生成的誘變來實施。此外，誘變可通過使用這些誘變方法的任何組合來實施。適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實例包括紫外(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’ -亞硝基胍(NTG) 0-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMQ、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用此類試劑時，誘變通常是通過將待誘變的親本菌株在所選誘變劑的存在下在合適的條件下溫育，并選擇呈現(xiàn)基因表達(dá)減少或無基因表達(dá)的突變體來實施的。在一個方面，所述修飾導(dǎo)致一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和 alpA，或者還包括基因tri5和dpsl之一或兩者的失活。在另一個方面，所述修飾導(dǎo)致一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA，或者還包括基因tri5和dpsl之一或兩者的表達(dá)的減少。在另一個方面，修飾導(dǎo)致一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、 amyA和alpA，或者還包括基因tri5和dpsl之一或兩者的表達(dá)的減少、失活或其組合。在另一個方面，所述突變體包含pyrG和amyA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含PyrG和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含amyA和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5和pyrG的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5和amyA 的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含amyA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG和dpsl 的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG、amyA和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG和amyA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG和alpA 的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、amyA和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、amyA和dpsl 的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含amyA、alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG、alpA和dpsl 的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG、amyA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG、amyA和alpA的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG、amyA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、 amyA、alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG、amyA、alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含tri5、pyrG、alpA和dpsl的修飾。在另一個方面，所述突變體包含pyrG、amyA、alpA、tri5和dpsl的修飾。在一個方面，所述pyrG基因包含編碼具有乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶活性包含與 SEQ ID NO 44的氨基酸序列優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述PyrG基因包含編碼具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性包含SEQ ID NO 44的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述pyrG基因包含編碼具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性由SEQ ID NO 44的氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述pyrG基因優(yōu)選包含與SEQ ID NO :43的核苷酸序列優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一個方面，所述pyrG基因包含SEQ ID NO 43 的核苷酸序列。在另一個方面，所述PyrG基因由SEQ ID NO :43的核苷酸序列組成。在另一個方面，所述pyrG基因包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :43的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列。在另一個方面，所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶包含與SEQ ID N0:44的氨基酸序列優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %， 更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少 97%，至少98%，或至少99%相同的氨基酸序列。在另一個方面，所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶包含SEQ ID NO :44的氨基酸序列。在另一個方面，所述乳清苷_5‘-單磷酸脫羧酶由SEQ ID NO 44的氨基酸序列組成。在另一個方面，所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶由包含與SEQ ID N0:43的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少 80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %， 至少97%，至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面， 所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶由包含SEQ ID NO :43的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。 在另一個方面，所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶由由SEQ ID NO :43的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶由包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :43的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述amyA基因包含編碼具有α -淀粉酶活性包含與SEQ ID NO 52 的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述amyA基因包含編碼具有α -淀粉酶活性包含SEQ ID NO :52的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述amyA基因包含編碼具有α _淀粉酶活性由SEQ ID NO 52的氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述amyA基因包含與SEQ ID NO :51的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一個方面，所述amyA基因包含SEQ ID NO 51 的核苷酸序列。在另一個方面，所述amyA基因由SEQ ID NO :51的核苷酸序列組成。在另一個方面，所述amyA基因包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :51的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列。在另一個方面，所述α-淀粉酶包含與SEQ ID NO :52的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一個方面，所述α-淀粉酶包含SEQ ID NO 52的氨基酸序列。在另一個方面，所述α-淀粉酶由SEQ ID NO :52的氨基酸序列組成。在另一個方面，所述α -淀粉酶由包含與SEQ ID NO 51的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%,或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述α -淀粉酶由包含SEQ ID NO :51的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述α-淀粉酶由由SEQ ID NO 51的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述α-淀粉酶由包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下， 且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 51的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述alpA基因包含編碼具有堿性蛋白酶活性包含與SEQ ID NO 84的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %， 更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一個方面， 所述alpA基因包含編碼具有堿性蛋白酶活性包含SEQ ID NO :84的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述alpA基因包含編碼具有堿性蛋白酶活性由SEQ ID NO 84 的氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述alpA基因包含與SEQ ID NO :83的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一個方面，所述alpA基因包含SEQ ID NO 83 的核苷酸序列。在另一個方面，所述alpA基因由SEQ ID NO :83的核苷酸序列組成。
在另一個方面，所述alpA基因包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :83的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列。在另一個方面，所述堿性蛋白酶包含與SEQ ID NO :84的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一個方面，所述堿性蛋白酶包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列。在另一個方面，所述堿性蛋白酶由SEQ ID NO :84的氨基酸序列組成。在另一個方面，所述堿性蛋白酶由包含與SEQ ID NO :83的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述堿性蛋白酶由包含SEQ ID NO :83的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述堿性蛋白酶由由SEQ ID NO 83的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述堿性蛋白酶由包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下， 且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 83的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述tri5基因包含編碼具有單族毒素合酶活性包含與SEQ ID NO 20的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %， 更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一個方面， 所述tri5基因包含編碼具有單族毒素合酶活性包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述tri5基因包含編碼具有單族毒素合酶活性由SEQ ID NO 20的氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述tri5基因包含與SEQ ID NO :19的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一個方面，所述tri5基因包含SEQ ID NO 19 的核苷酸序列。在另一個方面，所述tri5基因由SEQ ID NO 19的核苷酸序列組成。在另一個方面，所述tri5基因包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列。在另一個方面，所述單族毒素合酶包含與SEQ ID NO :20的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一個方面，所述單族毒素合酶包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一個方面，所述單族毒素合酶由SEQ ID NO 20的氨基酸序列組成。
在另一個方面，所述單族毒素合酶由包含與SEQ ID NO :19的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述單族毒素合酶由包含SEQ ID NO :19的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述單族毒素合酶由由SEQ ID NO 19的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述單族毒素合酶由包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述dpsl基因包含編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性包含與SEQ ID NO 94的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少 75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述dpsl基因包含編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性包含SEQ ID N0:94的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述dpsl基因包含編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性由SEQ ID NO 94的氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列。在另一個方面，所述dpsl基因包含與SEQ ID NO :93的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一個方面，所述dpsl基因包含SEQ ID NO 93 的核苷酸序列。在另一個方面，所述dpsl基因由SEQ ID NO :93的核苷酸序列組成。在另一個方面，所述dpsl基因包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :93的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶包含與SEQ ID NO :94的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的氨基酸序列。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶包含SEQ ID NO :94的氨基酸序列。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶由SEQ ID NO :94的氨基酸序列組成。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶由包含與SEQ ID NO :93的核苷酸序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %， 至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶由包含SEQ ID NO :93的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶由由SEQ ID NO 93的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼。在另一個方面，所述環(huán)己縮肽合成酶由包含在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :93的核苷酸序列或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。本文中公開的核苷酸序列或其亞序列，以及其氨基酸序列或其片段，可依照本領(lǐng)域公知的方法用于設(shè)計核酸探針以從不同屬或種的株鑒定并克隆上述的基因的同源DNA。 具體而言，此類探針可用于遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern以及方法與目標(biāo)屬或種的基因組或cDNA雜交以鑒定并分離其中相應(yīng)的基因。此類探針可明顯地短于全序列，但應(yīng)為至少15，優(yōu)選至少 25，且更優(yōu)選至少35個核苷酸長度。也可使用更長的探針。可使用DNA和RNA探針兩者。 探針通常經(jīng)標(biāo)記以供檢測相應(yīng)基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或親和素標(biāo)記)。因此，可就與上述探針雜交的DNA篩選從此類其它生物制備的基因組DNA或cDNA 文庫。來自此類其它生物的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移至并固化于硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與本文中公開的核苷酸序列同源的克隆或DNA，將載體物質(zhì)用于 Southern印跡。就本發(fā)明而言，雜交表明核酸序列在非常低至非常高嚴(yán)格條件下雜交于對應(yīng)于本文中公開的核苷酸序列的標(biāo)記的核酸探針，其互補鏈，或其亞序列。在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子使用χ-射線片來檢測。對于長度至少為100個核苷酸的探針，非常低至非常高嚴(yán)格條件定義為在42°C在 5X SSPE，0. 3% SDS，200 μ g/ml經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA中進(jìn)行雜交和預(yù)雜交，且對于非常低和低嚴(yán)格度，使用25%甲酰胺，對于中等和中等-高嚴(yán)格度，使用35%甲酰胺，或者對于高或非常高嚴(yán)格度，使用50%甲酰胺，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方法任選地進(jìn)行12至M小時。對于長度至少為100個核苷酸的探針，最終使用2X SSC，0.2% SDS，優(yōu)選在 450C (非常低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在50°C (低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在55°C (中等嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在60°C (中等-高嚴(yán)格度)，甚至更優(yōu)選在65°C (高嚴(yán)格度)，且最優(yōu)選在70°C (非常高嚴(yán)格度)洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用*艮據(jù) Bolton 禾P McCarthy 計算法(1962, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48 :1390)計算的 Tm 低大約 5°C至大約 10°C，在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5% NP-40, IXDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸鈉，ImM 磷酸二氫鈉(sodium monobasic phosphate)，0. ImMATP 和 0. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的 Southern 印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至M小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6X SSC加0. 1% SDS中洗滌一次15分鐘，并用6X SSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。可使用來自其它微生物來源的，與本文中所述的基因同源或互補的核苷酸序列以修飾所選鑲片鐮孢菌株中的相應(yīng)基因。在另一個方面，在鑲片鐮孢突變體菌株中基因的修飾是去除選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的去除可通過將突變體在反選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)突變體來達(dá)成。當(dāng)所述選擇性標(biāo)記基因含有其5’和3’端側(cè)翼的重復(fù)時，在對突變體菌株進(jìn)行反選擇時該重復(fù)將通過同源重組促使所述選擇性標(biāo)記基因的環(huán)出(loop out)。所述選擇性標(biāo)記基因還可通過同源重組來去除，即將包含缺陷型基因5’和3’區(qū)，但缺乏選擇性標(biāo)記的核酸片段引入突變體菌株，然后在反選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。通過同源重組，含有所述選擇性標(biāo)記基因的缺陷型基因由缺乏所述選擇性標(biāo)記的核酸片段替代。也可使用其它本領(lǐng)域中已知的方法。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的方法并不限于特定順序以供獲得鑲片鐮孢突變體菌株。基因的修飾可在用于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的株構(gòu)建中的任意步驟引入親本菌株。優(yōu)選在此種構(gòu)建之前所述鑲片鐮孢突變體菌株已經(jīng)變?yōu)槊溉毕莸摹Ｔ诒景l(fā)明的另一個方面，鑲片鐮孢的突變體菌株可含有其它修飾，例如其它基因的缺失或破壞，所述基因可編碼對目標(biāo)多肽產(chǎn)生、回收或應(yīng)用有害的物質(zhì)。在一個方面，所述鑲片鐮孢菌株還包含一個或多個(幾個)編碼蛋白水解活性的基因的修飾例如破壞或缺失。在另一個方面，所述蛋白水解活性選自下組氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉蛋白酶(aspergillop印sin)、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和液泡蛋白酶(vacuolar protease)。在另一個方面，所述鑲片鐮孢菌株還包含一個或多個(幾個)編碼選自下組的酶的其它基因的修飾例如破壞或缺失糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶 (chitinase)、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商過氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、α-1，6_轉(zhuǎn)糖基酶、α-1，6-轉(zhuǎn)糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。在本發(fā)明的方法中，所述鑲片鐮孢突變體菌株與在相同產(chǎn)生條件下培養(yǎng)的相應(yīng)親本鑲片鐮孢菌株相比優(yōu)選產(chǎn)生至少相同量的目標(biāo)多肽。在另一個方面，所述突變體菌株與在相同產(chǎn)生條件下培養(yǎng)的相應(yīng)親本鑲片鐮孢菌株相比多產(chǎn)生至少25%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少75%，且最優(yōu)選至少100%多肽。將所述鑲片鐮孢突變體菌株在用于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知方法培養(yǎng)。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)所述株。使用本領(lǐng)域已知的方法在包含碳源和氮源和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備 (例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。分泌的多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其可從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、高效液相色譜、毛細(xì)管色譜、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，酶測定(enzyme assay)可用于確定如本文所述的多肽的活性。對于許多酶，用于確定酶活性的方法在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如D. khomburg和 M. Salzmann(編),Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York,1990)。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后分離的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)或提取(參見，例如，Protein Purification，J. -C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers，New York，1989)。所述目標(biāo)多肽可為任何對于鑲片鐮孢菌株為天然或外源(異源)的多肽。所述多肽可由單一基因或兩種或更多種基因編碼。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”應(yīng)理解為涵蓋一個或多個(幾個)涉及所述多肽產(chǎn)生的基因。術(shù)語“異源多肽”在本文中定義為對于宿主株并非天然的多肽；其中進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾以改變天然多肽(例如，天然多肽的蛋白質(zhì)序列) 的天然多肽；或其表達(dá)作為通過重組DNA技術(shù)操縱多核苷酸或宿主株(更強的啟動子)的結(jié)果發(fā)生定量改變的天然多肽。因此，本發(fā)明術(shù)語“異源多肽”的范圍還涵蓋了天然多肽的重組產(chǎn)生，其程度使得此種表達(dá)涉及使用對于鑲片鐮孢株并非天然的遺傳元件，或使用經(jīng)操縱以并非天然存在于宿主株中的方式起作用的天然元件。在一個方面，所述多肽對于所述鑲片鐮孢菌株為天然多肽。在另一個方面，所述多肽對于所述鑲片鐮孢菌株為異源多肽。所述多肽可為任何具有目標(biāo)生物活性的多肽。術(shù)語“多肽”在本文中并不意指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此，其涵蓋肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“多肽”還涵蓋兩種或更多種多肽組合以形成編碼產(chǎn)物。多肽還包括融合多肽，其包含從至少兩種不同的多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中一個或多個(幾個)多肽對于所述鑲片鐮孢菌株可為異源的。多肽還包括上述多肽和雜合體多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。優(yōu)選地，所述多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑 (immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報道蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。在一個方面，所述多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。 在另一個方面，所述多肽是氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個方面，所述多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在本發(fā)明的方法中，所述鑲片鐮孢突變體菌株是重組株，包含編碼異源多肽的多核苷酸，其可有利地用于重組產(chǎn)生多肽。所述株優(yōu)選用包含編碼異源多肽的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化，然后將該載體整合入染色體。“轉(zhuǎn)化”意指將包含多核苷酸的載體引入宿主株，從而使得所述載體作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體維持。通常認(rèn)為整合是有利的，因為多肽更有可能在所述株中穩(wěn)定地保持。將載體整合入染色體可通過同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)座來進(jìn)行。編碼異源多肽的多核苷酸可從任何原核、真核或其它來源例如古細(xì)菌獲得。就本發(fā)明而言，術(shù)語“從...獲得”在本文中與給定來源相連應(yīng)意指所述多肽由所述來源產(chǎn)生或由其中插入了來自所述來源的基因的株產(chǎn)生。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株還可用于重組產(chǎn)生對于鑲片鐮孢菌株為天然的多肽。該天然多肽可由重組手段來產(chǎn)生，即通過例如將編碼多肽的基因置于不同的啟動子調(diào)控下以增強該物質(zhì)的表達(dá)，通過使用例如信號肽加速其輸出至該株之外，或增加通常由所述鑲片鐮孢菌株產(chǎn)生的編碼所述多肽的基因的拷貝數(shù)。
用于分離或克隆編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆所述核酸序列。參見，例如，Innis等，1990，PCR Protocols =A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York。所述克隆方法可涉及切出禾口分離包含編碼所述多肽的多核苷酸的所需核酸片段，將所述片段插入載體分子，和將重組載體并入本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株，其中所述多核苷酸的多個拷貝或克隆會被復(fù)制。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或其任何組合。在本發(fā)明的方法中，所述多肽還可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中一個多肽融合于另一個多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通過將編碼一個多肽的核苷酸序列(或其一部分)與編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合來產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列從而使得其在框內(nèi)(in frame)，且融合多肽的表達(dá)是在相同的啟動子和終止子調(diào)控之下。編碼異源多肽的分離的多核苷酸可以以多種方式操縱以提供所述多肽在本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株中的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載體之前對多肽序列的操縱可為理想的或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體可在與調(diào)控序列相容的條件下與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列能夠在本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。所述調(diào)控序列可為適當(dāng)?shù)膯幼有蛄校錇橛杀景l(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株識別用于表達(dá)編碼多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所述鑲片鐮孢突變體菌株中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼對于該鑲片鐮孢突變體菌株為同源或異源(外源)的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在本發(fā)明方法中指導(dǎo)核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Daria (W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Quinn (W0 00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。所述調(diào)控序列也可為合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其為由本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼異源多肽的核苷酸序列的3’端可操作地連接。在鑲片鐮孢菌株中有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。優(yōu)選的終止子從下述基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
所述調(diào)控序列還可為合適的前導(dǎo)序列，其為對于本發(fā)明的鑲片鐮孢突變體菌株的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼異源多肽的核苷酸序列的5’末端。可以將在鑲片鐮孢突變體菌株中有功能的任何前導(dǎo)序列用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。所述調(diào)控序列還可為聚腺苷酸化序列，其為與核苷酸序列的3’末端可操作地連接的序列，并且當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時，鑲片鐮孢突變體菌株將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA。在鑲片鐮孢突變體菌株中有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者， 編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地替代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入鑲片鐮孢突變體菌株的分泌途徑(即分泌入培養(yǎng)基)的任何信號肽編碼序列可用于本發(fā)明。對于鑲片鐮孢突變體菌株有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。所述調(diào)控序列還可為前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原 (zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽。前肽編碼區(qū)可從如下酶的基因獲得釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(W0 95/33836)。當(dāng)信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著 (next to)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。所述核酸構(gòu)建體還可包含一個或多個(幾個)多核苷酸，其編碼一個或多個(幾個)有利于指導(dǎo)異源多肽表達(dá)的因子，例如轉(zhuǎn)錄因子(例如，反式作用因子)、分子伴侶和加工蛋白酶。任何在鑲片鐮孢突變體菌株中有功能的因子可用于本發(fā)明。所述編碼一個或多個(幾個)這些因子的核酸不一定與編碼所述異源多肽的核苷酸序列串聯(lián)(in tandem)。可能還需要是添加調(diào)節(jié)或調(diào)控序列，其使得能夠相對于鑲片鐮孢突變體菌株的生長來調(diào)節(jié)多肽表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。可以使用絲狀真菌中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)如TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤 (methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(with heavy metal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
在本發(fā)明的方法中，可將包含核苷酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯停止信號的重組表達(dá)載體用于目標(biāo)多肽的重組產(chǎn)生。本文中所述的多種核酸和調(diào)控序列可連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其包含一個或多個(幾個)方便的限制位點以使得編碼多肽的核苷酸序列能夠在此類位點插入或取代。或者，所述核苷酸序列可通過將所述核苷酸序列或包含所述序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體來表達(dá)。當(dāng)構(gòu)建表達(dá)載體時，編碼序列位于載體上，從而使得編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接。所述重組表達(dá)載體可為任何可對其方便地進(jìn)行重組DNA方法并實現(xiàn)核苷酸序列表達(dá)的載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。對載體的選擇通常取決于其與其待引入的鑲片鐮孢突變體菌株的相容性。載體可為直鏈或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。所述載體可為自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。所述載體可含有任何用于確保自主復(fù)制的手段。或者，所述載體可為當(dāng)引入鑲片鐮孢突變體菌株時，整合入基因組并與其整合入的染色體一同復(fù)制的載體。此外，可使用單一載體或質(zhì)粒，或一同含有待引入鑲片鐮孢突變體菌株基因組的總DNA的兩種或更多種載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選含有一個或多個(幾個)選擇性標(biāo)記，其使得能夠方便地選擇轉(zhuǎn)化的鑲片鐮孢突變體菌株。選擇性標(biāo)記為其產(chǎn)物提供對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬抗性、使?fàn)I養(yǎng)缺陷型變?yōu)樵B(yǎng)型等的基因。用于鑲片鐮孢突變體菌株的選擇性標(biāo)記的實例包括但不限于，amdS(乙酰胺酶、 argB (鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar (phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hpt (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG (乳清苷-5 ’ -單磷酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)和 trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。優(yōu)選用于鑲片鐮孢突變體菌株的是構(gòu)巢曲霉的 amdS 基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因。所述載體優(yōu)選含有使得所述載體能夠整合入宿主細(xì)胞的基因組或使得所述載體能夠獨立于基因組在細(xì)胞中自主復(fù)制的元件。對于整合入鑲片鐮孢突變體菌株的基因組，所述載體可依賴于編碼多肽的多核苷酸序列，或其它任何用于通過同源重組或非同源重組整合入基因組的載體元件。或者，所述載體可含有其它的核苷酸序列以供指導(dǎo)通過同源重組在染色體中精確位置整合入鑲片鐮孢突變體菌株的基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其對于相應(yīng)的靶序列具有高度的同一性以增強同源重組的可能性。整合元件可為任何與鑲片鐮孢突變體菌株基因組中靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可為非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，所述載體可通過非同源重組整合入所述親本鑲片鐮孢菌株。
對于自主復(fù)制，所述載體還可包含使得載體能夠在鑲片鐮孢突變體菌株中自主復(fù)制的復(fù)制起點。所述復(fù)制起點可為任何介導(dǎo)在細(xì)胞中有功能的自主復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文中定義為使得質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。 可用于鑲片鐮孢突變體菌株的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI (Gems等， 1991，Gene 98 :61-67 ；Cullen 等，1987，Nucleic Acids Research 15 :9163-9175；WO 00/24883)。AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建可依照WO 00/24883中公開的方法達(dá)成。用于連接本文中所述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的(參見，例如 J. Sambrook, E. F. Fritsch 禾口 T. Maniatus，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。包含核苷酸序列的載體可通過例如轉(zhuǎn)化引入鑲片鐮孢突變體菌株從而使得載體作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體維持。整合通常被視為有利的，因為核苷酸序列更有可能在株中穩(wěn)定維持。載體整合入染色體通過同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)座發(fā)生。將表達(dá)載體引入鑲片鐮孢突變體菌株可涉及由以本身已知的方式的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和株細(xì)胞壁的再生組成的方法。合適的用于轉(zhuǎn)化鑲片鐮孢菌株的方法描述于 Malardier 等，1989，Gene 78 :147-156 和 W096/00787。本發(fā)明還涉及獲得親本鑲片鐮孢菌株的突變體的方法，包括a)修飾選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA;和(b)鑒定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷-5’-單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶。在一個方面，所述獲得親本鑲片鐮孢菌株的突變體的方法還包括修飾基因tri5 和dpsl之一或兩者使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者酶的產(chǎn)生中有缺陷。本發(fā)明還涉及親本鑲片鐮孢菌株的突變體，包含編碼多肽的多核苷酸以及選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶。在一個方面，所述親本鑲片鐮孢菌株的突變體還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。本發(fā)明進(jìn)一步通過下述實施例描述，其不應(yīng)視為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例材料用作緩沖劑和底物的化學(xué)物為至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。所有的引物和寡核苷酸由 MWG Biotech, Inc.，High Point, NC, USA 提供。真菌菌株鐮孢屬株A3/5，現(xiàn)在重新分類為鑲片鐮孢(Yoder和Christianson，1998，F(xiàn)ungal Genetics and Biology 23:62-80 ；0' Donnell 等，1998, Fungal Genetics and Biology 23 :57-67)從 Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England 獲得。該株的保藏可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)以鐮孢屬株ATCC 20334或農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研
23究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL),Northern Regional Research Center), 1815 University Street, Peoria, IL, USA 作為鍵抱屬株 NRRL 30747 獲得。培養(yǎng)基和溶液LB板由每升IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl和15g的細(xì)菌瓊脂組成。NZY頂層瓊脂由每升5g的NaCl、5g的酵母提取物、IOg的NZ胺、2g的MgSO4和7g 的瓊脂糖組成。M400培養(yǎng)基由每升50g的麥芽糊精、2g的MgSO4-7H20,2g的KH2P04、4g的檸檬酸、 8g的酵母提取物、2g的尿素、0. 5g的CaCl2和0. 5ml的AMG痕量金屬溶液，pH 6. 0組成。AMG 痕量金屬溶液由每升 14. 3g 的 ZnSO4 ·7Η20、2· 5g 的 CuSO4 ·5Η20、0· 5g 的 NiCl2, 13. 8g的FeS04、8. 5g的MnSO4和3. Og的檸檬酸組成。2XYT培養(yǎng)基由每升16g的胰蛋白胨、IOg的酵母提取物、5g的NaCl和5g的細(xì)菌瓊脂組成。YP培養(yǎng)基由每升IOg的酵母提取物和20g的細(xì)菌蛋白胨組成。YP(i5%培養(yǎng)基由每升IOg的酵母提取物、20g的細(xì)菌蛋白胨和50g的葡萄糖組成。RA培養(yǎng)基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的50X Vogels 鹽溶液(不含C、不含NaNO3)組成。RA+尿苷培養(yǎng)基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml of 50X Vogels鹽溶液(不含C、不含NaNO3)組成。在RA培養(yǎng)基的過濾滅菌之后，將過濾滅菌的尿苷添加至終濃度10mM。RA+BASTA 培養(yǎng)基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的 50X Vogels鹽溶液(不含C、不含NaNO3)組成。在RA培養(yǎng)基的過濾滅菌之后，使用250mg/ ml 的工作儲液將過濾滅菌的 BASTA (草銨膦(glufosinate)，Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Germany)添力口至終濃度為 6mg/ml。50X Vogels 鹽溶液(No C、No NaNO3)由每升 250g 的 KH2PO4UOg 的 MgSO4 · 7H20、 5g的CaCl2 · 2H20、2. 5ml的生物素溶液和5ml的Vogels痕量元素溶液組成。生物素儲液由IOOml 50%乙醇中的5mg生物素組成。Vogels痕量元素溶液由每IOOml 5g的檸檬酸、5g的ZnSO4 · 7H20、lg的 Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 6Η20、0· 25g 的 CuSO4 · 5Η20、0· 05g 的 MnSO4 · H20,0. 05g 的 H3BO3 和 0. 05g 的 Na2MoO4 · 2H20 組成。VNO3RLMT 板由每升 20ml 的 50X Vogels 鹽溶液(25mM NaNO3) >273. 33g 的蔗糖和 15g 的 LMT 瓊脂糖(Sigma，St. Louis, MO, USA)組成。50X Vogels 鹽溶液 Q5mM NaNO3)由每升 125g 的檸檬酸鈉、250g 的ΚΗ2Ρ04、106. 25g 的 NaNO3UOg 的 MgSO4 · 7H20、5g 的 CaCl2 · 2Η20、2· 5ml 的生物素儲液和 5ml 的 Vogels 痕量元素溶液組成。VN03RLMT-BASTA 板由每升 20ml 的 50X Vogels 鹽溶液(25mMNaN03) ,273. 33g 的蔗糖和15g的LMT瓊脂糖組成。在高壓滅菌和冷卻之后，添加BASTA 至終濃度為6mg/ml。STC 由 0. 8M 山梨醇、25 或 50mMTrispH8 和 50mMCaCl2 組成。
SPTC 由 40% PEG 4000,0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mMCaCl2 組成。SY50 培養(yǎng)基(pH 6. 0)由每升 50g 的蔗糖、2. Og 的 MgSO4 WH2OUOg 的 KH2PO4,2. Og 的K2S04、2. Og的檸檬酸、IOg的酵母提取物、2. Og的尿素、0. 5g的CaCl2 ·2Η20和5ml的200X
AMG痕量金屬溶液(不含鎳)組成。200X AMG痕量金屬溶液(不含鎳)由每升3. Og的檸檬酸、14. 3g的SiSO4 · 7H20、 2. 5g 的 CuSO4 · 5H20、13. 8g 的 FeSO4 · 7H20 和 8. 5g 的 MnSO4 · H2O 組成。20X SSC由0. 3M檸檬酸鈉pH 7 and 3M氯化鈉組成。DNA 測序DNA 測序是用 ABI PRIZM 3700DNA Analyzer (Applied Biosystems, Inc.， Foster City, CA, USA)進(jìn)行的。實施例1 鑲片鐮孢轉(zhuǎn)化方法。將一百微克每種下述實施例中所述的缺失盒用Bst Z171/Bam HI (實施例11)或 Not I (實施例14、16,28和30)消化。將每個消化反應(yīng)物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取DNA條帶。將所得的純化DNA 在1. 5ml微離心管中通過乙醇沉淀來濃縮，即添加10%反應(yīng)物體積的3M乙酸鈉，pH 5，然后添加2. 5體積的冰冷的乙醇(94% )并在冰上溫育20分鐘。然后將試管在EPPENDORF 5424桌上離心機(Eppendorf,Hamburg,Germany)中以15，OOOxg離心10分鐘。棄去上清， 并用Iml冰冷的70%乙醇洗滌沉淀，并將其以15，OOOxg離心5分鐘。棄去上清并使沉淀風(fēng)干。然后將沉淀重懸于70 μ 1 IOmM Tris pH 8緩沖液。所得的含DNA溶液的濃度使用 NANODROP 1000 分光光度計(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)確定。適當(dāng)受體株的原生質(zhì)體是通過下述方法生成。首先通過用含有VNO3RLMT培養(yǎng)基的7日培養(yǎng)物的Ihlcm2瓊脂栓接種2. 8L Fernbach燒瓶中的500ml的RA培養(yǎng)基(實施例 11)或補充了 IOmM尿苷的RA培養(yǎng)基(實施例14、16、觀和30)并將燒瓶在以150rpm 振蕩溫育36小時來獲得孢子。將孢子培養(yǎng)物經(jīng)過無菌MIRACL0TH 過濾，并將孢子捕獲于 MILLIPORE STERICUP ο. 2 μ m 過濾單元(Millipore，Bellerica，MA，USA)之上。用 200ml滅菌玻璃蒸餾水洗滌孢子，并將其重懸于IOml滅菌玻璃蒸餾水。將一 ml的孢子溶液用于接種IOOml補充了 5%葡萄糖的YP培養(yǎng)基(實施例11) 或補充了 5%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培養(yǎng)基(實施例14、16、觀和30)。將接種的培養(yǎng)基在17°C以150rpm振蕩溫育16小時。將培養(yǎng)物經(jīng)過MIRACL0TH 過濾以收集菌絲體，然后使用滅菌的刮鏟將其轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯管。將菌絲體重懸于20ml在每ml IM的MgSO4中含有每ml 5mg 的 N0V0ZYME 234 禾口 5mg GLUCANEX (兩者均來自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的原生質(zhì)體化溶液，并轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯管。將管在29. 5°C以90rpm振蕩溫育一小時，之后添加30ml IM山梨醇。然后將管以800xg在Sorvall RT 6000B浮筒式離心機(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)中離心10分鐘。棄去上清并將原生質(zhì)體沉淀用30ml IM山梨醇洗滌兩次。將管在SOOxg離心5分鐘并棄去上清。將原生質(zhì)體以切107每ml的濃度重懸于過濾滅菌的9 1 0. 1 (v/v) STC SPTC DMSO溶液中，并以受控冷凍速率使用 NALGENE Cryo 1°C Freezing Container(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)在 _80°C冷凍過夜。轉(zhuǎn)化通過將原生質(zhì)體在冰上融化并將200 μ 1原生質(zhì)體添加至四個Hml管中的每一個來達(dá)成。將五yg DNA(少于ΙΟμΙ)添加至前三個管中，而不將DNA添加至第四個管。 然后將750 μ 1 SPTC添加至每個管，并輕柔地將管顛倒6次。將管在室溫溫育30分鐘，并將6ml STC添加至每個管。將每個轉(zhuǎn)化物分為三份，并添加至150mm直徑板上，其含有補充了每ml 125 yg潮霉素的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm直徑板上(實施例11)或補充了每ml 125 μ g潮霉素和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基(實施例14、16,28和30)，并在室溫溫育7 曰。實施例2 Southern 分析真菌生物質(zhì)是通過將25ml的M400培養(yǎng)基(實施例11)或補充了 IOmM尿苷的M400 培養(yǎng)基(實施例14、16、觀和30)用來自如實施例1和11中所述生成的7日齡轉(zhuǎn)化體的四個Icm瓊脂栓接種而產(chǎn)生的。將培養(yǎng)物在以150rpm振蕩溫育3日。去除瓊脂栓，并將培養(yǎng)物經(jīng)過MIRACL0TH 過濾。將收獲的生物質(zhì)用液氮冷凍，并使用研缽和杵磨碎菌絲體。基因組DNA是使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生產(chǎn)商的指示分離的，只是將65°C的裂解溫育期間從10分鐘延長至1. 5小時。將二 μ g基因組DNA用所示的限制性核酸內(nèi)切酶50 μ 1反應(yīng)體積中在37°C消化 22小時。對消化物進(jìn)行TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳。將DNA在凝膠中通過用 0. 25M HCl 處理片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5M NaOH變性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 轉(zhuǎn)移至NYTRAN Supercharge 尼龍膜(均來自 Whatman，Kent，UK)。將 DNA 使用 UV STRATALINKER (Stratagene, La Jolla, CA, USA) UV 交聯(lián)至膜上，并在 20ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在42°C預(yù)雜交1小時。探針使用 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產(chǎn)商的實驗方案生成。探針通過TAE緩沖液中的1. 2%瓊脂糖凝膠電泳純化，并將對應(yīng)于探針的條帶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc. , Valencia, CA,USA)進(jìn)行瓊脂糖提取。將探針煮沸5分鐘，并將每一個添加至10ml DIG Easy Hyb以產(chǎn)生雜交溶液。雜交在42°C實施15-17小時。然后將膜在高嚴(yán)格條件下在2X SSC加0. 1 % SDS中在室溫洗滌5分鐘，然后在0. IX SSC加0. 1 % SDS中在 65°C洗滌兩次，各15分鐘。將探針-靶雜交體通過化學(xué)發(fā)光測定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行檢測。實施例3 構(gòu)建質(zhì)粒pDM156. 2，其攜帶并入鑲片鐮孢乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶 (pyrG)基因的基因組DNA片段粗糙脈孢菌乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶(pyr-4)基因的探針(DNA序列為SEQ ID NO :1而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 2)通過并入異羥基洋地黃毒甙元標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)和下述引物的PCR來制備。引物(有義)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO 3)引物(反義)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO 4)將質(zhì)粒 pFB6 (Buxton 等，1983，Molecular and General Genetics 190:403-405) 用Hind III消化，并將消化物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳純化。將1. 11Λpyr-4片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產(chǎn)商建議的實驗方案進(jìn)行瓊脂糖提取。擴(kuò)增反應(yīng)物由 IX Taq DNA Polymerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA),5 μ 1 PCR DIG Labeling Mix(Boehringer Mannheim, Manheim, Germany)，IOng 的 1. Ikb Hind III pyr_4 片段，IOpmol 的有義引物，IOpmol 反義引物，以及 1 單位 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)組成。將反應(yīng)物在 ROBOCYCLER (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中溫育，其程序為在 95°C進(jìn)行 1 個循環(huán)3分鐘，然后35個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行1分鐘，和72°C進(jìn)行1分鐘。 在72°C實施5分鐘的最終延伸。將擴(kuò)增翻譯產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳純化。將大約 0. 78kb的異羥基洋地黃毒甙元(DIG)標(biāo)記的探針從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。如TO 99/60137所述，生成鑲片鐮孢菌株A3/5的基因組DNA文庫，并克隆入λ載體EMBL4。使用DIG標(biāo)記的探針篩選克隆入λ載體EMBL4的鑲片鐮孢A3/5DNA的基因組文庫。將λ噬菌體與大腸桿菌Κ802細(xì)胞(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 一同鋪板于具有 NYZ 頂層瓊脂糖的 LB 板。使用 Sambrook 等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition ；J.Sambrook, E. F. Fritsch,禾口 Τ·Maniatis ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)的技術(shù)進(jìn)行噬菌斑上移(plaque lift)至HYB0ND 尼龍膜 (Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)。DNA 通過 UV 交聯(lián)使用 UV STRATALINKER 結(jié)合于膜。然后將濾紙與0.781Λ DIG標(biāo)記的粗糙脈孢菌pyr-4探針雜交。pyrG克隆的雜交和檢測依照 GENIUS System User' s Guide (Boehringer Hammheim, Manheim, Germany) 在 42°C用由 5X SSC，;35% 甲酰胺，0. L-月桂酰肌氨酸(Iauroylsarcosine), 0. 02% SDS 和封閉試劑(Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)組成的雜交溶液來實施。使用的DIG標(biāo)記的探針的濃度是2. 5ng每ml雜交溶液。雜交DNA用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗異羥基洋地黃毒試元抗體(Boehringer Hammheim,Manheim, Germany)免疫檢測，并用Lumiphos 530，一種化學(xué)發(fā)光底物(Boehringer Hammheim,Manheim, Germany)來顯現(xiàn)。DNA 制備物是從推定的陽性λ克隆使用AMidi Ki靡AGEN Inc. , Valencia, CA, USA)來制備的。將來自上述鑒定的克隆的λ DNA用Eco RI消化，并將其在TAE緩沖液中進(jìn)行 1 %瓊脂糖凝膠電泳。將3. 9kb片段切出，并使用QIAEX Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA)進(jìn)行瓊脂糖提取。然后將該片段克隆入pUC18 (Viera和Messing， 1987，Methods in Enzymology 153 :3-11)的 Eco RI 位點。并用 2μ1 克隆反應(yīng)物轉(zhuǎn)化 ONE SHOT TOPlO 感受態(tài)細(xì)胞 anvitrogen，Carlsl3ad，CA，USA)。通過 DNA 測序分析來自八個所得的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。選擇一個具有所需序列的克隆并命名為pDM156. 2(圖1)。 PyrG片段攜帶整個編碼區(qū)加1. 3kb的啟動子和1. 5kb的終止子。實施例4 :pEmY21的生成從質(zhì)粒pPHTI (Cummings 等，1999，Current Genetics 36 :371-382)使用下述引物擴(kuò)增大腸桿菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因G)NA序列為SEQ ID NO :5而推導(dǎo)的氨基酸序列為 SEQ ID NO :6)。
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正向引物5，-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3，(SEQ ID NO 7)反向引物5，-GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3’ (SEQ ID NO 8)將由下劃線序列表示的限制位點Bst BI (正向引物)和Eco 47111(反向引物) 工程引入所述引物以供克隆。(用于擴(kuò)增hpt基因)的PCR反應(yīng)物由IX ThermoPol反應(yīng)緩沖液，200 μ MdNTPs, 50pmol 正向和反向引物，IOOpg pPHTl，1 單位Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA USA)并用滅菌蒸餾水調(diào)至總體積100 μ 1組成。該擴(kuò)增反應(yīng)使用 ROBOCYCLER 實施，其程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘，25個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行1分鐘，51°C進(jìn)行1分鐘和72°C進(jìn)行2分鐘，并在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。將PCR產(chǎn)物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠分離。將1. Skb片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。然后將凝膠純化的片段使用TOPO Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)克隆入pCR -BluntII-TOPO (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。所得的質(zhì)粒命名為 pEmYlO。使用QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示使用如下所示的引物將Eco RI位點從pEmYlO中hpt基因的編碼序列去除，所述引物中小寫字母代表靶Eco RI位點的未突變的核苷酸而下劃線字母代表突變的核苷酸。所得的質(zhì)粒命名為PBK3。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 9)反向引物5' -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3 ‘ (SEQ ID NO :10)將所得不含所述Eco RI位點的hpt基因從pBK3使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物5，-GGRRtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO 11)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 12)下劃線部分代表引入用于克隆的Kpn I位點。將米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重復(fù)，并使用下述引物從pS02 (W0 98/12300)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增重復(fù)1 正向引物5，-TCCcccrrrTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 13)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 14)重復(fù)2 正向引物
5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 15)反向引物5 ’ -TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO 16)下劃線部分代表引入用于克隆的限制位點Sma I (cccggg)或Kpn I (ggtacc)。將三個片段(hpt，重復(fù)#1和重復(fù)把)在不同的反應(yīng)物(每個50 μ 1)中擴(kuò)增，所述反應(yīng)物由IX ThermoPol反應(yīng)緩沖液，200 μ M dNTPs，0. 25 μ M每種引物，50ng模板DNA和1 單位Vent DNA聚合酶組成。所述擴(kuò)增反應(yīng)使用ROBOCYCLER 進(jìn)行，其程序為在95°C 進(jìn)行一個循環(huán)2分鐘，30個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行1分鐘，61°C的進(jìn)行1分鐘和72°C進(jìn)行2 分鐘，并在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。將PCR產(chǎn)物在TAE緩沖液中通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約21Λ的擴(kuò)增的hpt片段和大約0. 2kb的重復(fù)片段從凝膠切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將兩個pyrG重復(fù)片段用Kpn I消化，用小牛小腸磷酸酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)脫磷酸，并用MINELUTE Reaction Cleanup Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生產(chǎn)商的指示處理。然后將攜帶重復(fù)#1和hpt 的片段使用 QUICK LIGATION Kit (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)依照生產(chǎn)商的指示連接在一起，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit處理，并將所得的連接物使用TOPO Blunt Cloning Kit克隆入pCR II Blunt。序列分析確證了其中重復(fù)#1 和hpt片段在pCR II Blunt中連接在一起的一個克隆。該質(zhì)粒命名為pEmY18。為了將第二個重復(fù)克隆入pEmY18，用Eco RV消化pEmy 18，并將消化物在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化。將5. 6kb片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將0. 2kb重復(fù)2片段(如上所述)和消化的pEmY18 使用QUICK LIGATION Kit連接在一起。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化SOLOPACK Gold Supercompetent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。序列分析鑒定了其中三個組分 (重復(fù)#1、hpt和重復(fù)#2)為所需的順序和取向且無PCR錯誤的質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒命名為 pEmY20o為了確保后續(xù)用Eco RI對pEmY20的消化會釋放單一片段，使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生產(chǎn)商的指示和如下所示的正向和反向引物去除Eco RI位點。在序列驗證之后，所得的質(zhì)粒命名為pEmY21(圖2)。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 17)反向引物5' -CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEQ ID NO 18)
實施例5 構(gòu)建鑲片鐮孢pyrG缺失載體pEmY23將鑲片鐮孢pyrG編碼序列Q678bp)通過用Eco RV和MuI限制性核酸內(nèi)切酶的消化從PDM156. 2切出(實施例3)，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行凝膠純化。分離pEmY21的Sma I片段并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit凝膠純化，并將兩個凝膠純化的片段連接在一起。對其篩選插入物的取向，就錯誤不存在進(jìn)行測序，并選擇一個具有正確插入序列的克隆，并命名為pEmY23(圖3)。實施例6 構(gòu)建質(zhì)粒 pWTY1470-19-07
將攜帶鑲片鐮孢單族毒素合酶(tri5)基因的5’和3’側(cè)翼序列(DNA序列為SEQ ID NO 19，推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 20)的質(zhì)粒pJRoy40 (美國專利7，332，341號) 用作模板以供擴(kuò)增5’ tri5基因側(cè)翼序列的一部分。PCR反應(yīng)物在終體積50 μ 1中含有 200 μ M dNTPs, IX Taq DNA 聚合酶緩沖液，125pg pJRoy40DNA，50pmol 每種下示引物和 1 單位Taq DNA聚合酶。正向引物5，-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3’ (SEQ ID NO 21)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3‘ (SEQ ID NO 22)(下劃線的核苷酸顯示引入的BglII位點)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在ROBOCYCLER 中溫育，程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)3分鐘； 10個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，在52°C進(jìn)行45秒和在72°C進(jìn)行2分鐘；20個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，在52°C進(jìn)行45秒和在72°C進(jìn)行5分鐘；以及在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7 分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用TBE緩沖液的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約600bp的片段從凝膠切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將片段使用 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入pCR 2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，并將 ONE SHOT T0P10 感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 用2 μ 1 TOPO TA克隆反應(yīng)物轉(zhuǎn)化。將來自八個所得的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA用Eco RI和 BglII在不同的反應(yīng)中消化，且三個具有正確的限制性酶切樣式的轉(zhuǎn)化體的插入物通過 DNA測序得到確證。選擇一個具有所需序列的克隆并命名為PWTY1470-09-05。通過用BglII消化從pWTY1470-09-05釋放出攜帶tri5基因5，重復(fù)的 608bpBglII片段，通過使用TBE緩沖液的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 進(jìn)行瓊脂糖提取。質(zhì)粒ρJRoy40通過BglII消化線性化，之后將其使用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產(chǎn)商的指示脫磷酸，并使用 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)純化。將線性化的pJRoy40和凝膠純化的BglII片段使用T4DNA連接酶(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA)依照生產(chǎn)商的指示連接在一起。大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 (Stratagene，La Jolla,CA,USA)的轉(zhuǎn)化依照生產(chǎn)商的指示加以實施。一個轉(zhuǎn)化體通過DNA 測序確證含有所需的載體，即攜帶tri55’和3’側(cè)翼序列并含有5’側(cè)翼序列一部分的重復(fù)。 所得的質(zhì)粒命名為pWTY1470-19-07(圖4)。實施例7 構(gòu)建質(zhì)粒 pWTY1515-02-01對質(zhì)粒pWTY1470-19-07 使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生產(chǎn)商的指示以及如下所示的正向和反向引物進(jìn)行體外誘變。正向引物5，-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3，(SEQ ID NO 23)反向引物5，-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3，(SEQ ID NO 24)
該誘變?nèi)コ?1779bp處的BglII位點，并使得2386bp處的BglII位點變得唯一，并可用于后續(xù)的操作中以插入攜帶胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因盒的片段。將該誘變反應(yīng)用于依照生產(chǎn)商推薦的實驗方案轉(zhuǎn)化試劑盒提供的大腸桿菌 XLlO-GOLD Ultra-感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。如通過序列分析驗證的，一個攜帶如上所示的突變的轉(zhuǎn)化體，命名為 pffTY1515-02-01(圖5)，并用作實施例10中的骨架。實施例8 構(gòu)建質(zhì)粒pJaL574質(zhì)粒pDV8 (美國專利6，806，062號)攜帶單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK ； tk)基因(DNA序列為SEQ ID NO 29而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ IDNO :30)，其為插入構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)啟動子的1.01Λ Xhol/Bgl II片段和攜帶三功能性構(gòu)巢曲霉吲哚甘油磷酸酯合酶、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶和谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(trpC) 轉(zhuǎn)錄終止子的1.8kb Bam Hi/Hind III片段之間的1. 2kb Bgl II/Bam HI片段。將質(zhì)粒 PDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(Stratagene， La Jolla, CA, USA)填充(fill in)。將消化的質(zhì)粒使用QUICK LIGATION Kit依照生產(chǎn)商的實驗方案重新連接，用MINELUTE Gel Extraction Kit處理，并將所得的連接產(chǎn)物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生產(chǎn)商的指示克隆入pCR 4Blunt_ TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。將克隆反應(yīng)物根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONE SHOT 化學(xué)感受態(tài) T0P10 細(xì)胞(Invitrogen，Carlskid，CA，USA)。使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)從八個所得的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，并通過使用)(ho I/Bam HI和 Xho Ι/HindIII限制性酶切來篩選。來自兩個具有正確限制性消化樣式的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA 的DNA測序確證了兩者均攜帶所需序列。一個命名為pJaL504-[BamHI](圖6)。將質(zhì)粒pJaL504-[BamHI]用BglII消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用 Klenow聚合酶填充。將消化的質(zhì)粒依照生產(chǎn)商的實驗方案使用QUICK LIGATION Kit重新連接，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit處理，然后將所得的連接物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生產(chǎn)商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。將克隆反應(yīng)物依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONE SHOT 化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌T0P10細(xì)胞。使用BIOROBOT 9600從八個所得的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，并通過使用)(ho Ι/BglII和Bio Ι/HindIII的限制性酶切篩選。來自兩個具有正確地限制性消化樣式的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的DNA測序確證兩者均攜帶所需序列。一個命名為pJaL504-[BglII](圖7)。Punt等(1990，Gene 3 101-109)之前顯示可缺失構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子的364bp而不影響該啟動子的強度。基于這些作者的觀察，設(shè)計如下所示的引物#172450以截短構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子并減少載體的大小。引物 17M50 5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’ (SE Q ID NO 25)下劃線序列對應(yīng)于gpdA啟動子序列。剩余序列是攜帶下述限制位點的手柄 (handle) :Eco RI、XbaI、BglII、Xho I和 HindIII。為了截短構(gòu)巢曲霉trpC終止子(同樣為了減少載體大小)，設(shè)計了攜帶Eco RI手柄的如下所示的引物#172499。
引物 17M99 5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3’ (SEQ ID NO 26)下劃線序列對應(yīng)于trpC終止子序列。使用引物17M99和17M50的擴(kuò)增將啟動子截短了 364bp而將trpC終止子序列截短了 239bp。PCR用上述兩個引物使用pJaL504-[BglII]作為模板實施以生成由構(gòu)巢曲霉gpdA 啟動子的截短形式、HSVl-TK基因的編碼序列和構(gòu)巢曲霉trpC終止子的截短形式組成的 2. 522kb 片段。擴(kuò) ±曾反應(yīng)物由 5 μ 1 IOX 緩 7中液(Promega Corporation, Madison, WI, USA)、 0. 4μ 1 25mM dNTP、l. 25 μ 1 引物 172450 (lOOng/μ 1)、1· 25μ 1 引物 172499 (lOOng/μ 1)、
0.5μ 1 pJaL504-[BglII] (lOOng/μ 1)、2μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Promega Corporation, Madison, WI, USA) (2. 5U/ μ 1)和39. 6 μ 1滅菌蒸餾水組成。將擴(kuò)增反應(yīng)物在 ROBOCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)45秒，然后進(jìn)行28個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行45秒，57°C進(jìn)行45秒和72°C進(jìn)行5分鐘。在72°C進(jìn)行10分鐘的最終延伸。對擴(kuò)增反應(yīng)物使用低熔點瓊脂糖凝膠在50mM Tri s-50mM硼酸-ImMEDTA 二鈉 (TBE)緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠切出2522bp片段，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 提取。然后將凝膠純化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit 依照生產(chǎn)商的指示插入pCR 4Blunt- TOPO 。將克隆反應(yīng)物根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入 ONE SHOT 化學(xué)感受態(tài)T0P10細(xì)胞。使用BIOROBOT 9600從八個所得的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，并通過使用Eco RI和Bgl II的限制性酶切篩選。來自兩個具有正確限制性酶切樣式的質(zhì)粒DNA的DNA測序確證兩者均攜帶所需序列。一個命名為pJaL574(圖8)。實施例9 構(gòu)建質(zhì)粒 pWTY1449-02-01將質(zhì)粒PJaL574依照生產(chǎn)商推薦的試驗方案轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌SCS 110細(xì)胞 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。使用BIOROBOT 9600 從二十四個所得的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，然后使用Eco RI和BglII對其進(jìn)行分析性消化。之后的DNA序列分析導(dǎo)致了具有正確序列的克隆的鑒定，其命名為PWTY1449-02-01 (圖9)。實施例10 :tri5缺失載體pJfyS1579-21_16的生成將大腸桿菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因盒從質(zhì)粒pEmY23使用 ADVANTAGE GC Genomic PCR Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)和如下所示的基因特異性正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反向引物中的下劃線區(qū)域是用于克隆的BglII位
點ο正向引物5，-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3，(SEQ ID NO 27)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3> (SEQ ID NO :28)PCR反應(yīng)物在50 μ 1的終體積中含有362ng pEmY23作為DNA模板，200 μ m dNTPs,
1.ImM 乙酸鎂，0·4μΜ 引物，IX GC Reaction Buffer (Clonetech, Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt(Clonetech, Palo Alto,CA, USA)禾口 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER (Eppendorf, Munich,
32Germany)中溫育，其程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；25個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒和66°C進(jìn)行3分鐘；和在66°C進(jìn)行1個循環(huán)3分鐘；以及在4°C保持。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. 9kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將所述片段使用TOPO TA Cloning Kit依照生產(chǎn)商的指示克隆入pCR 2. 1。將ONE SHOT TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞anvitrogen，Carlsl3ad，CA，USA)用2 μ 1 TOPO TA反應(yīng)物轉(zhuǎn)化。來自8個轉(zhuǎn)化體的DNA的序列分析確證了與預(yù)計序列并無偏差，且該質(zhì)粒命名為pJfySlM0-75-5(圖 10)。將hpt插入物通過用Bam HI和BglII的消化從pJfySlM0-75_05釋放，并在TAE 緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳分離。將1. 9kb的片段切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。使用Rapid DNALigation Kit將該片段連接至經(jīng)BglII 線性化的空tri5缺失載體pWTY1515-02-01 (實施例7)，其已經(jīng)使用小牛小腸磷酸酶脫磷酸。將大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞用所述連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化，并將來自M個所得的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA通過用Eco RI的限制性消化分析確證插入物的取向。選擇了一個攜帶所需取向的插入物的轉(zhuǎn)化體并命名為pJfyS1579-l-13(圖11)。將單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因(DNA序列為SEQ ID NO :29，而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 30)使用pWTY1449-2_l作為模板和如下所示的基因特異性正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。粗體序列代表引入的BglII位點。正向引物5，-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3，(SEQ ID NO 31)反向引物5，-CAGATAACGA AGATCT GAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO 32)PCR反應(yīng)物在50 μ 1的終體積中含有IX HERCULASE 反應(yīng)緩沖液 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)，200 μ M dNTPs，55ng pWTY1449-2_l，0. 2 μ M 引物，2 % DMSO 和 2· 5 單位HERCULASE DNA 聚合酶(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行ι個循環(huán)ι分鐘；25個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30分鐘，在60°C進(jìn)行30秒，和在68°C進(jìn)行2分45秒；和在68°C進(jìn)行1個循環(huán)2分45秒；并在4°C保持。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約2. Skb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將所述片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入pCR 2. 1。將 ONE SHOT T0P10 感受態(tài)細(xì)胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用2 μ 1 TOPO TA反應(yīng)物轉(zhuǎn)化。來自一個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒 DNA的序列分析在tk編碼序列鑒定了一個突變(C1621G)，其導(dǎo)致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸變化。使用QUIKCHANGE II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示和如下所示的正向和反向引物校正了該突變。小寫字母表示所需突變。16個克隆的序列分析導(dǎo)致選擇其中一個，命名為pJfyS1579-8-6(圖12)。正向引物5，-CCCTGTTTCGGGgCCCCGAGTTGCTGG-3，(SEQ ID NO :33)反向引物
5，-CCAGCAACTCGGGGcCCCGAAACAGGG-3，(SEQ ID NO :34)將質(zhì)粒pJfyS1579-08_06用Bam HI和BglII消化以釋放所述2. 8kbtk片段，并如上所述純化片段。將該片段使用QUICK LIGATION Kit連接于經(jīng)BglII線性化并經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的pJfyS1579-l-13，并用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉(zhuǎn)化SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。將所得的質(zhì)粒命名為pJfyS1579-21-16(圖13)并用作tri5缺失盒。實施例11 構(gòu)建Δ tri5鑲片鐮孢菌株JfyS1604-47_02將鑲片鐮孢A3/5原生質(zhì)體用經(jīng)Bst Z171/BamHI線性化的pJfyS1579-21_16使用實施例1所述方法轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體在含有每ml 125 μ g潮霉素B (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)的 VNO3RLMT 板上選擇。在第 7 日之后，將 123 個轉(zhuǎn)化體中的48個亞培養(yǎng)至含有相同培養(yǎng)基的新板上。然后通過Southern分析如下所述分析八個轉(zhuǎn)化體。這些株的真菌生物質(zhì)是通過用來自如上所述獲得的7日齡轉(zhuǎn)化體的四個Icm 瓊脂栓接種25ml的M400培養(yǎng)基生成的。將培養(yǎng)物在以150rpm振蕩溫育3日。去除瓊脂栓，并將培養(yǎng)物經(jīng)過MIRACL0TH 過濾。將收獲的生物質(zhì)用液氮冷凍，并使用研缽和杵磨碎菌絲體。基因組DNA是使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生產(chǎn)商的指示分離的，只是 65°C的裂解溫育期間從10分鐘延長至1. 5小時。將二 μ g基因組DNA用16單位的SphI和22單位的Dra I在50 μ 1反應(yīng)體積中在37°C消化22小時。對消化物進(jìn)行TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳。將DNA在凝膠中通過用 0. 25M HCl 處理片段化，用 1. 5MNaCl-0. 5M NaOH 變性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURB0BL0TTER Kit 轉(zhuǎn)移至NYTRAN Supercharge 尼龍膜。將DNA使用UV STRATALINKER UV交聯(lián)至膜上，并在20ml DIG Easy Hyb中在42°C預(yù)雜交1小時。針對tri5基因的3’側(cè)翼序列的PCR探針是使用下述正向和反向引物生成的。正向引物5' -GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3'，(SEQ ID NO :35)反向引物5' -CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3' (SEQ ID NO 36)探針是使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生產(chǎn)商的指示生成的。將探針在TAE緩沖液中通過1. 2%瓊脂糖凝膠電泳純化，并將對應(yīng)于探針的條帶切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將探針煮沸5分鐘，并添加至IOml DIG Easy Hyb以產(chǎn)生雜交溶液。雜交在42°C實施15_17小時。然后將膜在高嚴(yán)格條件下在室溫在2X SSC加0. 1 % SDS中洗滌，然后在65 °C進(jìn)行兩次洗滌，每次在0. IX SSC加 0.1% SDS中進(jìn)行15分鐘。探針-靶雜交體通過化學(xué)發(fā)光測定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生產(chǎn)商的指示檢測。將一個根據(jù)Southern分析在tri5位點攜帶單一拷貝的缺失盒的轉(zhuǎn)化體鑲片鐮孢JfyS1579-43-23通過從含有VNO3RLMT培養(yǎng)基的7日板使用滅菌牙簽切下四個Icm2栓并將其轉(zhuǎn)移至含有25ml RA培養(yǎng)基的125ml帶擋板的搖瓶來進(jìn)行孢子形成。將燒瓶在
以150rpm振蕩溫育48小時。將孢子培養(yǎng)物經(jīng)過滅菌的MIRACL0TH 過濾，并收集于50ml 聚丙烯管。使用血細(xì)胞計數(shù)器確定孢子濃度，并將IO5個孢子(Iml中)轉(zhuǎn)移至含有補充了50 μ M5-氟代-5，脫氧尿苷(FdU) (Sigma Chemical Co. ,St. Louis,MO,USA)的 VNO3RLMT 培養(yǎng)基的150mm板，并在溫育4日。使用滅菌牙簽挑取孢子分離物，并將其轉(zhuǎn)移至含有補充了 10 μ M FdU的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板，并使其在M_28°C生長7日。將基因組DNA從7個孢子分離物提取，并如上所述實施Southern分析以確保盒正確地從基因組切出。如預(yù)計，所有通過Southern印跡分析的孢子分離物切出了盒，留下一個重復(fù)序列。將一個孢子分離物通過如前述段落中所述通過在株中誘導(dǎo)孢子形成來純化孢子一次，并使用血細(xì)胞計數(shù)器確定孢子濃度，并稀釋至每ml 40個孢子。將一 ml的稀釋孢子溶液鋪板于含有VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm板，并將板在溫育4日。將孢子分離物亞培養(yǎng)至含有VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板，并將一個命名為鑲片鐮孢JfyS1604-17-02 ( Δ tri5) 的孢子分離物用作PyrG基因缺失的起始株。實施例12 構(gòu)建攜帶胸苷激酶(tk)陰性選擇性標(biāo)記和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt) 陽性選擇性標(biāo)記的通用缺失載體。構(gòu)建了攜帶胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)標(biāo)記兩者的通用缺失載體以便于裝配后續(xù)的缺失質(zhì)粒。靶向缺失的基因的5’和3’區(qū)域的側(cè)翼序列在用Riie I或 Asc I用于5’側(cè)翼序列)以及SbfI或Swa I (用于3’側(cè)翼序列)消化載體之后可容易地連接于后者。為了 PCR擴(kuò)增來源于鑲片鐮孢pyrG基因5，側(cè)翼區(qū)域的直接重復(fù)，在兩個PCR反應(yīng)物中使用50皮摩爾如下所示的引物，所述反應(yīng)物在50 μ 1的總體積中含有50ng pDM156. 2， IX Pfx Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 μ 1 IOmM dNIPs 混合物， 2. 5 單位PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)和 1μ 1 50mM MgSO4。引物重復(fù) #1有義引物5，-GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3，(SEQ ID NO 37)反義引物5，-TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 38)重復(fù)#2有義引物5，-AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3，(SEQ ID NO 39)反義引物5，-ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3‘ (SEQ ID NO 40)將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序如下。對
于重復(fù)#1 在98°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘，然后5個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行 30秒和68°C進(jìn)行1分鐘。接著進(jìn)行35個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在59°C進(jìn)行30秒和68°C進(jìn)行1分鐘。對于重復(fù)#2，循環(huán)參數(shù)為在98°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；然后5個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在55°C進(jìn)行30秒，和68°C進(jìn)行1分鐘。接著進(jìn)行35個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在56°C進(jìn)行30秒和68°C進(jìn)行1分鐘。在35個循環(huán)之后，將兩個反應(yīng)物(即重復(fù)#1和#2)在68°C溫育10分鐘，然后在10°C冷卻直至進(jìn)一步加工。
將來自兩個反應(yīng)的PCR產(chǎn)物使用TAE緩沖液通過0. 8 % GTG-瓊脂糖(Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA)分離。對于重復(fù)#1和重復(fù)#2，從凝膠切出大約 0. ^kb 的片段，并使用Ultrafree -DA旋轉(zhuǎn)杯(spin cup) (Millipore，Billerica，MA，USA) 依照生產(chǎn)商的指示純化。然后將十微升每種純化的重復(fù)用于單一的重疊PCR(overlapping PCR)反應(yīng)，其反應(yīng)物在50 μ 1的總體積中含有IX Pfx Amplification Buffer,6 μ 1 IOmM dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 混合物，2. 5 單位PLATINUM Pfx DNA 聚合物和 1 μ 1 50mM MgSO4。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在
98°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘，然后5個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在50°C進(jìn)行30秒和68°C 進(jìn)行1分鐘。然后將反應(yīng)物與在50 μ 1的終體積中含有50皮摩爾用于重復(fù)#1的有義引物和 50 皮摩爾用于重復(fù) #2 的反義引物，IX Pfx Amplification Buffer, 6 μ 1 IOmM dNTPs, 2. 5單位PLATINUM Pfx DNA聚合酶和1 μ 1 50mM MgSO4的預(yù)溫?zé)岬娜芤夯旌稀⑿碌?00 μ 1的擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育， 程序為35個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在58°C進(jìn)行30秒和68°C進(jìn)行1分鐘。在35個循環(huán)之后，將反應(yīng)物在68°C溫育10分鐘，然后在10°C冷卻直至進(jìn)一步加工。將0. 5kb PCR 產(chǎn)物(攜帶所述重復(fù)裝配體)如上所述通過0. 8% GTG-瓊脂糖凝膠電泳分離。將質(zhì)粒pCR4(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)用作用于構(gòu)建通用缺失載體的載體骨架的來源。為了去除PCR4DNA的非必需部分，將2. 5μ g質(zhì)粒pTter61C(W0 2005/074647) 順序用 Bsp LUllI 和Bst XI 消化。然后用 Antarctic 磷酸酶(New England Biolabs Inc., Ipswich,MA, USA)處理消化的載體。將3. Ikb經(jīng)消化的骨架如上所述通過0. 8% GTG-瓊脂糖凝膠電泳來分離。然后將純化的重復(fù)裝配體用Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)連接于純化的載體骨架。連接反應(yīng)物由如下組成 75ng純化的載體骨架好3μ 1純化的重復(fù)裝配體。將一微升該連接反應(yīng)物用于使用生產(chǎn)商推薦的實驗方案來轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)SOLOPACK Supercompetent細(xì)胞(Stratagene， Car 1 skid，CA，USA)。將二十四個轉(zhuǎn)化體通過Nco I/Pme I限制性消化分析。二十四個轉(zhuǎn)化體中的二十三個具有預(yù)計的限制性酶切樣式。隨機選擇克隆pFvRs#10用于測序以確證無 PCR誘導(dǎo)的錯誤。序列分析顯示克隆pFvRs#10中的重復(fù)裝配體具有預(yù)計的序列，并因此將其選作鑲片鐮孢通用載體的骨架，并命名為PAlLol492-M(圖14)。將攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(htp)基因的盒從pEmY23使用如下所示的基因特異性正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。下劃線序列代表Xma I位點，而粗體字母代表BglII位點。 在每個5’端的四個“a”使得PCR產(chǎn)物的末端能夠進(jìn)行后續(xù)的消化。正向引物5，-aaaacccKggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEQ ID NO :41)反向引物5’ -aaaacccRR AGATCT ACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3’ (SEQ ID NO 42)擴(kuò)增反應(yīng)物在50 μ 1的終體積中含有60ng pEmY23, 200 μ m dNTPs, ImM乙酸鎂， 0.4 μ M引物，IX Pfx擴(kuò)增緩沖液，0. 5Μ GC Melt和2. 5單位PLATINUM Pfx聚合酶。將反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán) 2分鐘；10個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，在60°C進(jìn)行30秒和68°C進(jìn)行1分50秒；和在68°C進(jìn)行一個循環(huán)1分鐘，接著在4°C保持。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. Skb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。隨后將經(jīng)凝膠純化的PCR產(chǎn)物用Xma I消化，并在1 %瓊脂糖凝膠上運行并如上所述再次凝膠純化。將 QUICK LIGATION Kit用于將hpt PCR產(chǎn)物連接于經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理、經(jīng)Xma I-線性化的pAlLol492-24。將所得的質(zhì)粒命名為pJfyS1579-35_2 (圖15)并用作受體以供插入胸苷激酶基因。單純皰疹病毒tk盒的來源是質(zhì)粒pJfyS1579-8_6 (實施例10)，通過用BamHI和 BglII的消化將該插入物釋放。將消化產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離，并將對應(yīng)于2.8kbtk基因插入物的片段切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將QUICK LIGATION Kit用于將tk基因盒連接于經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理的、經(jīng)BglII-線性化的pJfyS1579-35-02。所得的質(zhì)粒命名為pJfyS1579-41_ll (圖 16)并將其用作起始點以供構(gòu)建pyrG、amyA、alpA和dpsl缺失載體。實施例13 :pyrG缺失載體pJfyS1604-55_13的生成將鑲片鐮孢A3/5pyrG基因(DNA序列為SEQ ID NO :43而推導(dǎo)的氨基酸序列堿 SEQ ID NO 44)的 3，側(cè)翼序列使用EXPAND High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和如下所示基因特異性正向和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。下劃線部分是引入用于克隆的Sbf I位點，而斜體部分是引入用于之后的消化以在轉(zhuǎn)化之前去除質(zhì)粒的pCR 2. 1部分的Not I位點。正向引物5，-aaaaaacctgcaggatcctgcgcggactcttgattattt-3' (SEQ ID NO :45)反向引物5' -aaaaaacctgcagggcggccgcaattccattcctgtagctgagtata-3' (SEQ ID NO 46)擴(kuò)增反應(yīng)物以50 μ 1的終體積含有125ng鑲片鐮孢A3/5基因組DNA，200 μ m dNTPs,0. 4μΜ 引物，含 5mM MgCl2 的 IX EXPAND Buffer(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和 2. 5 單位 EXPAND DNA 聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis,IN, USA)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行ι個循環(huán)2分鐘，10個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分鐘；和20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分10秒。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離，并將0. 71Λ片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將0. 7kb PCR產(chǎn)物用SbfI消化，并通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳消化。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并進(jìn)一步使用Ultrafree -DA旋轉(zhuǎn)杯(spin cup)純化。將 0. 7kb 片段使用 QUICK LIGATION Kit 連接于 pJfyS1579-41_ll (其經(jīng) SbfI 消化并使用小牛小腸磷酸酶脫磷酸)，并將連接混合物用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉(zhuǎn)化大腸桿菌 SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。所得的質(zhì)粒命名為pJfyS1604-35-13。將來自pEmY23 (實施例 5)的 5，pyrG 側(cè)翼序列使用EXPAND High Fidelity PCR System和如下所示的基因特異性正向和反向引物來擴(kuò)增。下劃線部分是引入用于克隆
37的Pme I位點而斜體部分是引入 用于之后的消化以在真菌轉(zhuǎn)化之前去除內(nèi)酰胺酶基因的Not I位點。正向引物5' -aaaaaagtttaaacgcggccgcctgttgcctttgggccaatcaatg-3' (SEQ ID NO 47)反向引物5，-aaaaaagtttaaacctagttggagtattgtttgttctt-3，(SEQ ID NO :48)擴(kuò)增反應(yīng)物含有20ng pEmY23,200ym dNTPs，0. 4 μ M 引物，含有 15mM MgCl2W IX EXPAND Buffer 和 2. 5 單位EXPAND DNA 聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行ι個循環(huán)2分鐘；10個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，53°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行40 秒；和20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，53°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行40秒，并在每個后續(xù)循環(huán)中另外加10秒。將PCR產(chǎn)物使用MINELUTE PCRPurification Kit(QIAGEN Inc. ,Valencia, CA, USA)純化。將純化的PCR產(chǎn)物用Riie I消化并通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 51Λ的片段從凝膠切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 進(jìn)行瓊脂糖提取。將0. 51Λ片段使用QUICK LIGATION Kit連接于經(jīng)Riie I消化和小牛小腸磷酸酶處理的pJfyS1604-35-13。連接反應(yīng)物在20 μ 1反應(yīng)體積中含有50ng載體，20ng 插入物，IX QUICK LIGATION Reaction Buffer (New England Biolabs Inc. ,Ipswich,MA, USA)，和 10 單位 Quick T4DNA Ligase (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)。將反應(yīng)物在室溫溫育5分鐘并將2μ 1連接物用于依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。使用序列分析鑒定含有在所需取向的插入物的轉(zhuǎn)化體，并確證無PCR錯誤。所得的質(zhì)粒命名為pJfyS1604-55-13(圖17)并用作pyrG基因缺失盒。實施例14 Δ tri5 Δ pyrG鑲片鐮孢菌株JfyS1643-18_2的生成將依照實施例1中所述的方法用經(jīng)Not I消化和經(jīng)凝膠純化的pJfyS1604-55_13 轉(zhuǎn)化的鑲片鐮孢JfyS1604-17-2(Atri5)的五十一個推定的轉(zhuǎn)化體用滅菌牙簽從轉(zhuǎn)化板轉(zhuǎn)移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板，并在M-28°C生長7日。然后對轉(zhuǎn)化體通過將栓轉(zhuǎn)移至兩個含有或不含有尿苷(IOmM)的 VNO3RLMT中的每一個進(jìn)行表型分析。將九個在不含尿苷的板上呈現(xiàn)無或不良的生長的轉(zhuǎn)化體通過Southern分析進(jìn)行分析。將來自9個轉(zhuǎn)化體中的每一個的基因組DNA如實施例2 所述進(jìn)行提取，并將每個的2 μ g用觀單位Mfe I和14單位Dra I消化。如實施例11中所述用下述正向和反向引物生成了針對PyrG基因3’側(cè)翼序列的PCR探針正向引物5’ -GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 49)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 50)Southern分析表明9個尿苷自養(yǎng)型中的2個以單一拷貝攜帶所述缺失盒，而其余維持該盒的異位整合(ectopic integration)。將一個轉(zhuǎn)化體，鑲片鐮孢JfyS1604_85_5， 如實施例1中所述在含有IOmM尿苷的RA培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm板。將所得的孢子分離物亞培養(yǎng)至含有補充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板上，并隨后通過 Southern分析進(jìn)行分析確保從基因組的正確切出。經(jīng)分析的株均正確地切出了所述盒，并將一個株，鑲片鐮孢JfyS1643-10_3，如前述段落中所述進(jìn)行孢子形成。使用血細(xì)胞計數(shù)器確定孢子濃度，并將儲液稀釋至每ml 40 個孢子的濃度。將一 ml鋪板于含有補充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm板。將所得的孢子集落亞培養(yǎng)至含有補充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板上，并將一個孢子分離物，鑲片鐮孢JfyS1643-18-2(Atri5ApyrG)用作供缺失鑲片鐮孢α -淀粉酶A基因(amyA)的株。實施例15 :amyA缺失載體pJfyS1604-17_2的生成為了獲得上游和下游側(cè)翼序列的信息以供完全去除鑲片鐮孢amyA基因(DNA 序列為SEQ ID NO :51而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO :5 ，使用了 GENOME WALKER Universal Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) 對每個用該試劑盒生成的鑲片鐮孢A3/5 基因組DNA文庫使用如下所示的5’基因特異性引物和5’嵌套引物進(jìn)行兩輪針對5’側(cè)翼序列的PCR。3’側(cè)翼序列使用如下所示的3’基因特異性引物和3’嵌套引物獲得。5’基因特異性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 53)5，嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 54)3’基因特異性引物5，-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3，(SEQ ID NO 55)3’嵌套引物5' -GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3‘ (SEQ ID NO 56)初級PCR反應(yīng)物在50 μ 1的反應(yīng)體積中含有IX HERCULASE ReactionBuffer,2y 1每種基因組DNA文庫(如試劑盒中所述生成)，200nM試劑盒提供的APl(銜接頭引物1)，200ηΜ基因特異性引物(見上)，200μΜ dNIPs和2.5單位 HERCULASE DNA 聚合酶。初級擴(kuò)增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中實施，程序為7個循環(huán)，每
個在94°C進(jìn)行25秒，和72°C進(jìn)行3分鐘，和32個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行25秒，和67°C進(jìn)行3分鐘以及在67°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。次級PCR反應(yīng)物在50 μ 1的反應(yīng)體積中含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 1 μ 1每種初級PCR反應(yīng)物，200ηΜ試劑盒提供的ΑΡ2 (銜接頭引物2)，200ηΜ基因特異性嵌套引物(見上)，200 μ M dNTPs和2. 5單位HERCULASE DNA聚合酶。次級擴(kuò)增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中實施，程序為5個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行25秒，72°C進(jìn)行3分鐘，以及20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行25秒和67°C進(jìn)行 3分鐘，以及在67°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit依照生產(chǎn)商的指示純化。將 PCR產(chǎn)物使用如上所述相應(yīng)的嵌套引物和試劑盒提供的引物2直接進(jìn)行測序。將獲得的序列用于設(shè)計引物以擴(kuò)增amyA基因5’側(cè)翼序列的11Λ區(qū)和3’側(cè)翼序列的0. 7kb區(qū)以供插入空的缺失載體pJfyS1579-41-ll。將amyA3’側(cè)翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物5，-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3，(SEQ ID NO :57)反向引物5，-AAAAAAcctgcagggcggccgcTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3，(SEQ ID NO :58)下劃線字母代表用于之后去除β -內(nèi)酰胺酶的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的SbfI位點。PCR 反應(yīng)物含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 單位HERCULASE DNA 聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；10個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分鐘；和20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分10秒。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。用SbfI消化PCR片段以產(chǎn)生粘性末端。將該片段插入經(jīng)SbfI-線性化、小牛小腸磷酸酶處理的通用缺失載體pJfyS1579-41-ll。連接反應(yīng)物在20 μ 1的反應(yīng)體積中含有80ng載體，80ng插入物，IX Quick Ligation Reaction Buffer 和 10 單位 Quick T4 DNA Ligase0 將 1·5μ1 體積的連接反應(yīng)物用于依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化100 μ 1大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。就插入物的取向使用用Eco RI的限制性分析和序列分析篩選克隆，鑒定出不含PCR錯誤的克隆。該質(zhì)粒命名為pJfyS1579-93-l (圖18)并用作5’ amyA側(cè)翼序列插入的受體。使用如下所示的正向和反向引物PCR擴(kuò)增5’ amyA側(cè)翼序列。下劃線的堿基代表用于bla基因去除的Not I位點，而其它小寫字母代表Riie I位點以確保所述片段是平末端的以供克隆入平末端載體位點。正向引物5 ‘ -AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3‘ (SEQ ID N0: 59)反向引物5，-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3，(SEQ ID NO :60)PCR擴(kuò)增與上述相似，只是使用不同的循環(huán)參數(shù)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；10個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分15秒；和20個循環(huán)，每個在 94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分15秒，并在每個后續(xù)的循環(huán)另外進(jìn)行10 秒。PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約11Λ的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。用Rne I消化該11Λ片段以產(chǎn)生平端，并將該插入物克隆入經(jīng)Riie I-消化、經(jīng)小牛小腸磷酸酶脫磷酸的 pJfyS1579-93-l。
連接反應(yīng)物在20 μ 1反應(yīng)體積中含有75ng載體，IOOng插入物，IX Quick Ligation Reaction Buffer 和 10 單位 Quick T4DNA Ligase0 在 5 分鐘的溫育之后， 將2μ 1連接反應(yīng)物用于依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化100μ 1大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。使用序列分析確證插入為正確的取向并不含PCR錯誤。鑒定所得的載體命名為 pJfyS1604-17-2(圖 19)。實施例16 Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA 鑲片鐮孢菌株 JfyS1643_95_4 的生成將依照實施例1中所述方法用經(jīng)Not I消化和凝膠純化的pJfyS1604-17_2轉(zhuǎn)化的鑲片鐮孢JfyS1643-18_2 ( Δ tri5 Δ pyrG)的五個推定的轉(zhuǎn)化體用滅菌牙簽從轉(zhuǎn)化板轉(zhuǎn)移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板，并在M-28°C 溫育7日。對于Southern分析，將2 μ g基因組DNA用25單位kp I消化。如實施例21 中所述用如下所示的正向和反向引物生成針對amyA基因5’側(cè)翼序列的DIG探針。正向引物5，-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 61)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 62)Southern分析如實施例2中所述加以實施，其結(jié)果表明五個轉(zhuǎn)化體中的兩個用缺失盒的單獨整合替代了編碼序列。將命名為鑲片鐮孢JfyS1643-73-2的初級轉(zhuǎn)化體如實施例1中所述進(jìn)行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm直徑板。將獲得的孢子分離物亞培養(yǎng)至補充了 10 μ M FdU和 0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板。對兩個鑲片鐮孢孢子分離物(JfyS1643-83_2和JfyS1643_83_4)進(jìn)行一次孢子純化，得到株 JfyS1643-95-l 和 JfyS1643-95_2 (來自 JfyS1643-83_2)和 Jfys 1643-95-4 (來自JfyS1643-83-4)。將從FdU板挑取的起始孢子分離物，以及其相應(yīng)的一次孢子純化分離物通過Southern分析進(jìn)行分析以確保從基因組的正確切出。所有分析的株正確地切出了該盒。將鑲片鐮孢JfyS1643-95_4 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)用作用于缺失鑲片鐮孢堿性蛋白酶A基因(alpA)的株。實施例17 構(gòu)建質(zhì)粒pEJG61質(zhì)粒pEJG61 (圖20)如美國專利7，368，271中所述構(gòu)建，只是bar盒的取向逆轉(zhuǎn) (即核苷酸5901-5210編碼amdS啟動子，核苷酸5209-4661編碼bar編碼序列，而核苷酸 4660-4110編碼黑曲霉葡糖淀粉酶(AMG)終止子)。實施例18 構(gòu)建質(zhì)粒pEJG69將Microdochium nivale 乳糖氧化酶(LOx)基因(DNA 序列為 SEQ ID NO 63 而推導(dǎo)的氨基酸序列為 SEQ ID NO 64)從 pEJG33 (Xu 等，2001，European Journal of Biochemistry 268 :1136-1142)使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物5' -CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3‘ (SEQ ID NO 65)反向引物5' -GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO 66)下劃線部分代表引入用于克隆的SphI (正向)或I^acI (反向)位點。
PCR 在 50 μ 1 的終體積中含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每種引物，50ngpEJG33, IXPwo 緩沖液(Promega, Madison, WI, USA)禾口 1 μ 1 of Pwo Hot Start Polymerase (Promega, Madison, WI, USA)。將擴(kuò)增反應(yīng)物在ROBOCYCLER 中溫育，程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘； 10個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行45秒，和72°C進(jìn)行1分鐘；20個循環(huán)，每個在 95°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行45秒，和72°C進(jìn)行1分鐘，在每個后續(xù)循環(huán)中另外進(jìn)行20秒延伸；和在50°C進(jìn)行1個循環(huán)10分鐘。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. 5kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。使用相同的條件重新擴(kuò)增乳糖氧化酶基因，并如上所述進(jìn)行純化，只是將聚合酶和緩沖液分別用iTaq DNA聚合酶和Taq DNA Polymerase Buffer替代，并用經(jīng)凝膠純化的上述PCR產(chǎn)物作為模板。將PCR產(chǎn)物使用TOPO TACloning Kit克隆入pCR 2. 1 并測序以確保無PCR錯誤。將所得的無錯誤質(zhì)粒用Sph I消化，用T4DNA聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)處理，使用QIAQUICK Nucleotide Removal Ki靡AGEN Inc.，Valencia, CA, USA)純化，并用PacI消化。將該片段在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并將大約1. 5kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將質(zhì)粒pEJG61用BspLUllI消化，依照生產(chǎn)商的指示用Klenow DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)處理，然后用Pac I消化。將消化的質(zhì)粒在 TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將81Λ片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit將其進(jìn)行瓊脂糖提取。將Lox編碼序列使用T4DNA Ligase依照生產(chǎn)商的指示連接于經(jīng)Bsp LUllI-和 Pac I-消化的pEJG61。通過序列分析篩選質(zhì)粒以確保不含PCR錯誤，并鑒定了一個所得的質(zhì)粒，將其命名為PEJG69 (圖21)。實施例19 構(gòu)建質(zhì)粒pEJG65將質(zhì)粒pEJG61 (實施例17)用Bsp LUllI消化，用Klenow DNA聚合酶處理并用 Pac I消化。將消化的質(zhì)粒在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并將8. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A編碼序列(DNA序列為SEQ ID NO :67而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 68)從pMT12^ (W094/01M1)使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物5' -GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3，(SEQ ID NO 69)反向引物5，-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3，(SEQ ID NO 70)PCR 反應(yīng)物含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每種弓| 物，20ng pMT1229, IXPwo 緩沖液 (Promega, Madison, WI, USA)，禾口 1 μ 1 Pwo Hot Start 聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在ROBOCYCLER 中溫育，其程序為在94°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；10個循環(huán)，每個在94°c進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行45秒，和72°C進(jìn)行1分鐘；17個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行45秒，和72°C進(jìn)行1分鐘，在每個后續(xù)循環(huán)中另行進(jìn)行20秒的延伸；以及在72°C進(jìn)行1個循環(huán)10分鐘。將PCR產(chǎn)物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將1. 4kb片段接觸， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將PCR片段使用TOPO TA Cloning Kit克隆入pCR 2. 1并測序以驗證不含PCR錯誤。由于該基因編碼序列中內(nèi)部SphI位點的存在，通過分別消化將南極假絲酵母脂肪酶A編碼序列從pCR 2. 1作為兩個不同的片段來釋放。為了釋放第一片段(11Λ)，將質(zhì)粒用SphI消化并用T4DNA聚合酶處理。將該聚合酶在75°C熱失活10分鐘，并用Nhe I消化質(zhì)粒。將第二片段(0.41Λ)用Nhel/Pac I消化從質(zhì)粒釋放。對兩個消化物進(jìn)行TAE緩沖液中的瓊脂糖凝膠電泳并將來自Sph I/Nhe I消化的11Λ片段和來自Nhe I/Pac I消化的0.41Λ片段切出，并使用QIAQUICK (}el Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將兩個片段使用iMDNA連接酶連接于消化的pEJG61。連接反應(yīng)物含有IX Ligation Buffer (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)，IOOng 上述 Ikb 片段，50ng 0. 4kb 片段，50ng 消化的PEJG61和10單位T4DNA連接酶。將反應(yīng)物在室溫溫育16小時，并用其依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLIO-GOLD Ultra-感受態(tài)細(xì)胞。通過序列分析篩選轉(zhuǎn)化體，并鑒定了一個含有具有所需無錯誤編碼序列的質(zhì)粒的克隆，并命名為PEJG65(圖22)。實施例20 構(gòu)建質(zhì)粒pMStrl9通過將來自pA2W!lO(WO 1998Λ6057)的尖鐮孢磷脂酶基因克隆入鑲片鐮孢表達(dá)載體pDM181 (W0 2000/56900)構(gòu)建質(zhì)粒pMStrl9。使用PCR擴(kuò)增來分離方便的DNA片段上
的磷脂酶基因。尖鐮孢磷脂酶基因具體是使用標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件用Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals,Basel, Switzerland)和45°C的退火溫度用如下所示的引物從pA2PhlO擴(kuò)增的。PLMStrlO 5，-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 71)SwaIPLMStrll 5，-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3，(SEQ ID NO 72)將所得的DNA片段凝膠純化，并用Swa I消化。還用Swa I消化質(zhì)粒pDM181，并將其脫磷酸。然后將DNA片段連接在一起以產(chǎn)生質(zhì)粒pMMrlS。將在兩個使用連接混合物生成的單獨的大腸桿菌pMStrlS轉(zhuǎn)化體，#4和#17中的磷脂酶基因使用標(biāo)準(zhǔn)引物步移方法測序。突變由Nar I位點分隔，該限制性酶切割pMMrlS 兩次。因此在鐮孢表達(dá)載體pDM181中通過用NarI消化pMStrl8#4和pMStrl8#17，分離不含錯誤的片段，并將其連接在一起以產(chǎn)生pMMrl9(圖23)而裝配了不含錯誤的磷脂酶基因。使用標(biāo)準(zhǔn)方法確證了 pMMrl9中的磷脂酶序列。實施例21 構(gòu)建質(zhì)粒pEJG49鑲片鐮孢表達(dá)載體pEJG49是通過修飾pSheBl (W0 2000/56900)生成的。所述修飾包括(a)通過定點誘變?nèi)コ粋€pSheBl序列之內(nèi)的Bsp LUllI位點；(b)去除850bp的尖鐮孢胰蛋白酶啟動子；(c)通過接頭連接引入BspLUllI位點以協(xié)助插入21Λ鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子；和(d)引入尖鐮孢磷脂酶基因。pSheBl序列之內(nèi)Bsp LUllI位點的去除是使用QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生產(chǎn)商的指示用下述誘變引物對達(dá)成的。5' -GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3‘ (SEQ ID NO 73)5' -GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 74)這產(chǎn)生了 pSheBl中間物1。930bp的尖鐮孢胰蛋白酶啟動子的去除是通過用Mu I和I^c I消化pSheBl中間物1 (6，971bp)，對消化物進(jìn)行使用TBE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳，切出6，040bp的載體片段，并用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化切出的片段來達(dá)成的。為了引入新的 Bsp LUllI位點，使用下述引物產(chǎn)生接頭5' -dCCTACATGTTTAAT-3’ (SEQ ID NO :75)BspLul II5' -dTAAACATGTAGG-3' (SEQ ID NO :76)將每個引物(每個2 μ g)在70°C加熱10分鐘，然后經(jīng)過1小時冷卻至室溫。將該接頭連接入經(jīng)MuI-Pac I-消化的pSheBl中間物1載體片段，產(chǎn)生pSheBl中間物2。然后將載體PSheBI中間物2用Bsp LullI和I^c I消化。將消化的載體在TBE緩沖液中通過
瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。尖鐮孢磷脂酶基因片段還通過PCR使用pMSTR19作為模板來生成。使用下述PCR 引物在該基因的5’端引入Sph I位點而在3’端引入I^c I位點5' -GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 77)SphI5' -GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3‘ (SEQ ID NO 78)Pac I實施PCR和純化的條件如上所述。將磷脂酶基因片段依照生產(chǎn)商的指示克隆入 pCR -TOPO 。然后將pCR -TOPO 磷脂酶克隆用SphI消化并用T4DNA聚合酶處理以去除突出的3'端。使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit純化片段，并用I^ac I 消化。將消化物在TBE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將11Λ條帶從凝膠切出并使用QIAQUICK GelExtraction Kit 純化。將質(zhì)粒pShebl中間物2 (見上)用Mu I和Bsp LullI消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit純化。然后將片段連接于2kb Stu I-Bsp LullI鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子片段(W0 2000/056900)。該載體，稱作pShebl中間物3，用Bsp LullI消化，用Klenow片段處理以填充5 ‘懸突(overhang)，用I^ac I消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit純化。然后將該片段連接于SphI、平端I^c I尖鐮孢磷脂酶片段 (如上所述)。所得的質(zhì)粒，命名為PEJG49(圖，攜帶鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的磷脂酶報道基因。實施例22 構(gòu)建質(zhì)粒pEmY15使用定點誘變從表達(dá)質(zhì)粒pEJG49去除Eco RI和Not I限制位點各一個，并使得這些在雙丙氨膦(bialaphos)抗性標(biāo)記(bar基因)側(cè)翼的限制位點唯一。誘變是使用如下所示的正向和反向引物和QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit來完成的。正向引物5' -cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3‘ (SEQ ID NO 79)反向引物5' -ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3‘ (SEQ ID NO 80)大寫字母表示所需的變化，而所得的質(zhì)粒命名為pEmY15(圖25)。實施例23 構(gòu)建質(zhì)粒pEmYM為了用鑲片鐮孢pyrG基因替代表達(dá)質(zhì)粒pEmY15中的bar基因，進(jìn)行了下述實驗方案。將質(zhì)粒pEmY15用Eco RI和Not I消化，并在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化。將7. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK GelEXtracti0n Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將pyrG基因的2. 3kb片段從pDM156. 2使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。正向引物5，-ATAAGAAT gcggccgCTCCAAGGAATAGAATCACT-3，(SEQ ID NO :81)反向引物5，-CG gaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3，(SEQ ID NO :82)粗體序列對應(yīng)于引入分別用于正向和反向引物的Not I位點和Eco RI位點。擴(kuò)增反應(yīng)物由在50 μ 1的終體積中的IX ThermoPol Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，200 μ M dNTPs, 31pDM156. 2，1μΜ每種引物和 1 單位 VENT
DNA聚合酶組成。將反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)3分鐘；30個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，55 °C進(jìn)行1分鐘；和72°C進(jìn)行3分鐘；并在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。將PCR產(chǎn)物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將2. 3kb片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。然后將該片段用Eco RI和 Not I消化，并將消化反應(yīng)物使用MINELUTE Reaction Cleanup Kit純化。將片段使用 T4 DNA連接酶依照生產(chǎn)商的指示連接于經(jīng)Not I/Eco RI消化的pEmY15。將連接混合物依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL I-Blue亞克隆級感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行測序以確保不含PCR錯誤，并鑒定了含有無錯誤pyrG片段的質(zhì)粒。 所得的質(zhì)粒命名為PEmYM (圖26)。實施例24 構(gòu)建質(zhì)粒pDM257將質(zhì)粒pEmYM (實施例23)用Af 1 II和Sna BI消化。將6. 5kb片段在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將質(zhì)粒PEJG65用Afl II和Sna BI消化。將3. 3kb片段在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。將兩個片段使用T4DNA連接酶依照生產(chǎn)商的指示連接在一起。將連接混合物依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態(tài)細(xì)胞。通過序列分析篩選轉(zhuǎn)化體， 并鑒定了含有具有所需片段的質(zhì)粒的克隆。將所得的質(zhì)粒命名為pDM257(圖27)。實施例25 構(gòu)建質(zhì)粒pDM258將質(zhì)粒pDM257用ka I和Afl II消化并在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將4. 11Λ片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。還將質(zhì)粒pEJG69用 a I和Afl II消化，并在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并將5. Skb片段從凝膠切出，并如上所述進(jìn)行瓊脂糖提取。將兩個片段使用T4DNA連接酶依照生產(chǎn)商的指示連接在一起。將連接混合物依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態(tài)細(xì)胞。通過序列分析篩選轉(zhuǎn)化體， 并鑒定了所需的質(zhì)粒，并命名為pDM258(圖28)。實施例沈在鑲片鐮孢菌株JfyS1643-95_4中表達(dá)乳糖氧化酶。鑲片鐮孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的原生質(zhì)體如實施例1中所述生成。然后將該原生質(zhì)體依照實施例1中所述的方法用攜帶Microdochium nivale乳糖氧化酶表達(dá)載體的PDM258轉(zhuǎn)化，以衡量鑲片鐮孢JfyS1643-95-04株的表達(dá)潛力。將轉(zhuǎn)化體如實施例21中所述在搖瓶中生長，只是所述燒瓶在以200rpm振蕩溫育5日。對搖瓶培養(yǎng)液就乳糖氧化酶活性使用與BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA) 一同的活性測定法進(jìn)行測定。該乳糖氧化酶測定法是Glucose Oxidase Assay Procedure (K-Glox) (Megazyme,Wicklow, Ireland)的修飾版本。將培養(yǎng)上清適當(dāng)?shù)卦?. IM MOPS緩沖液pH 7.0(樣品緩沖液)中稀釋，然后對稀釋樣品進(jìn)行從0倍至 1/3倍至1/9倍的系列稀釋。將乳糖氧化酶標(biāo)樣(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)使用兩倍逐步稀釋，在樣品緩沖液中的濃度以0. 056mg/ml開始并以0. 007mg/ml終止。將包括標(biāo)樣的總共20 μ 1的每個稀釋物轉(zhuǎn)移至96孔平底板。將一百微升POD溶液(Peroxidase， 4AA，在磷酸鉀緩沖液pH 7加對羥基苯甲酸和疊氮化鈉中的穩(wěn)定劑)添加至每孔，然后添加 100 μ 1葡萄糖底物(樣品緩沖液中的0.5Μ葡萄糖)。反應(yīng)速率在環(huán)境溫度(大約
在510nm測量總共10分鐘。樣品濃度通過從使用乳糖氧化酶作為標(biāo)樣生成標(biāo)準(zhǔn)曲線外推來確定。選擇產(chǎn)量最高的乳糖氧化酶轉(zhuǎn)化體在2升發(fā)酵罐中進(jìn)行生長和分析。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH 6)由每升20g大豆粉，20g蔗糖，2. Og MgSO4 · 7H20, 2. Og無水 KH2PO4, 2. Og K2SO4, 5. Og (NH4) 2S04，1. Og 檸檬酸，0. 5ml 的 200X AMG 痕量金屬溶液(不含鎳) 和 0. 5ml 含 20 %麥芽糖補料(feed)的 pluronic acid 組成。發(fā)酵在 29. 0+/-1. 0°C，1200rpm 和l.Ovvm通氣下進(jìn)行，其中％ DO維持在30%以上。對發(fā)酵液使用 Alpha-Amylase Assay Kit (Megazyme International Ireland Ltd. ,fficklow, Ireland)連同BIOMEK 3000 和BIOMEK NX (Beckman Coulter, Inc, Fullerton CA,USA)進(jìn)行α -淀粉酶活性的測定。如上所述對發(fā)酵液測定乳糖氧化酶活性。所得的轉(zhuǎn)化體鑲片鐮孢JfyS1643-95_04，在2升發(fā)酵罐中具有與其它無缺失鑲片鐮孢轉(zhuǎn)化體等同的乳糖氧化酶產(chǎn)生水平(圖四)，表明amyA基因的缺失并不對異源蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有不利作用。然而該缺失確實消除了該株和該種系所有后續(xù)株在培養(yǎng)液中的α-淀粉酶活性(圖30)。由于該轉(zhuǎn)化體與現(xiàn)有的生產(chǎn)株具有等同的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)生能力，并在發(fā)酵過程中減少了 α -淀粉酶水平，選擇鑲片鐮孢JfyS1643-95-04宿主株用于缺失堿性蛋白酶A基因(alpA)。
實施例27 鑲片鐮孢堿性蛋白酶A(alpA)缺失載體pJfyS1698-72_10的生成用于完全去除鑲片鐮孢A3/5堿性蛋白酶A(alpA)基因(DNA序列為SEQ ID NO 83 而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 84)的上游側(cè)翼序列使用GENOME WALKER Universal Kit獲得。將每個用該試劑盒生成的文庫使用如下所示的5’基因特異性引物和5’嵌套引物進(jìn)行針對5’側(cè)翼序列的兩輪PCR。5’基因特異性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 85)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 86)序列信息是從PCR產(chǎn)物使用GENOME WALKER Universal Kit中提供的Nested Adaptor I^rimer和上述5’嵌套引物獲得的。將獲得的序列用于設(shè)計引物以擴(kuò)增5’ alpA 側(cè)翼序列的11Λ區(qū)域以供插入空的缺失載體pJfyS1579-41-ll。將alpA 5’側(cè)翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的區(qū)域特異性正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。下劃線字母代表供之后去除載體pCR 2.1部分的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的Asc I位點。正向引物5，-aaaaaaggcgcgccgcggccgcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-3，(SEQ ID NO :87)反向引物5' -aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3，(SEQ ID NO :88)擴(kuò)增反應(yīng)物含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA，400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 單位HERCULASE DNA 聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，56°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分 10秒；和在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。將擴(kuò)增反應(yīng)物的5 μ 1部分通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)以確保該反應(yīng)產(chǎn)生了所需的11Λ條帶。然后將該插入物從所述擴(kuò)增反應(yīng)物依照生產(chǎn)商的指示使用 TOPO TA Cloning Kit直接克隆入pCR 2. 1。對轉(zhuǎn)化體通過用Eco RI的限制性分析加以篩選以確保插入物的存在，并合并了 5個正確的制備物。用Asc I將該插入物從pCR 2.1釋放，并如上所述通過瓊脂糖凝膠電泳純化片段。將該插入物使用QUICK LIGATION Kit克隆入經(jīng)Asc I-線性化的pJfyS1579-41-ll，并使用連接混合物依照生產(chǎn)商的實驗方案轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體通過序列分析進(jìn)行篩選以確保不含 PCR錯誤。一個含有側(cè)翼序列不含錯誤的質(zhì)粒命名為pJfyS1698-65-15(圖31)并用于插入 3’側(cè)翼序列。將alpA基因的3’側(cè)翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的區(qū)域特異性正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。下劃線字母代表供之后去除β內(nèi)酰胺酶的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的SbfI位點。正向引物5，-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3，(SEQ ID NO :89)反向引物
5，-aaaaacctgcagggcggccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3，(SEQ ID NO :90)PCR 反應(yīng)物含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 單位HERCULASE DNA 聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；20個循環(huán)，每個在94°C進(jìn)行30秒，56°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分 10秒；和在72°C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘.將擴(kuò)增反應(yīng)物的5μ 1部分通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)以確保該反應(yīng)產(chǎn)生了所需的11Λ條帶。然后將該直接來自PCR反應(yīng)的11Λ插入物使用ΤΟΡΟ TA Cloning Kit克隆入pCR 2. 1。對所得的質(zhì)粒進(jìn)行測序以鑒定含有正確序列的菌落。 然后通過SbfI消化將該片段從該質(zhì)粒釋放，并在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化。將11Λ條帶切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。然后將該片段使用QUICK LIGATION Kit連接于經(jīng)Sbf I線性化的 pJfyS1698-65-15(經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理)，并使用該連接混合物依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體通過用Not I的限制性分析篩選以確保片段以正確的取向插入，并進(jìn)行測序以確保沒有偏離預(yù)計的序列。將所得的質(zhì)粒 pJfyS1698-72-10(圖 32)用于缺失 alpA 基因。實施例沘Δtri5 ApyrG AamyA AalpA 鑲片鐮孢菌株 JfyS1763_l 1-1 的生成將依照實施例1中所述方法用經(jīng)Not I-消化和凝膠純化的pJfyS1698-72_10轉(zhuǎn)化的鑲片鐮孢JfyS1643-95_4 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)(實施例16)的三個轉(zhuǎn)化體從轉(zhuǎn)化板用滅菌牙簽轉(zhuǎn)移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板，并在室溫溫育7日。對于Southern分析，將來自3個轉(zhuǎn)化體每一個的2 μ g鑲片鐮孢基因組DNA用34單位SphI消化。根據(jù)實施例11中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成針對aplA基因5’側(cè)翼序列的DIG探針。正向引物5' -GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3‘ (SEQ ID NO 91)反向引物5' -GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3‘ (SEQ ID NO 92)如實施例11中所述實施的Southern分析表明三個轉(zhuǎn)化體之一含有缺失盒在alpA 基因位點的單一拷貝，并將該轉(zhuǎn)化體命名為鑲片鐮孢JfyS1698-83-2。將鑲片鐮孢JfyS1698-83_2如實施例1所述進(jìn)行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm直徑板。將所得的孢子分離物亞培養(yǎng)至含有補充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板。將所得的孢子分離物如實施例2中所述通過Southern分析進(jìn)行分析，并鑒定了一個正確地切出盒的孢子分離物。該分離物命名為Fusarium venenatum JfyS1698-94_04。將鑲片鐮孢 JfyS1698-94-04如實施例11中所述進(jìn)行一次孢子純化，并挑取一個孢子分離物，并命名為鑲片鐮孢 JfyS1763-l 1-01 (Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA)。如實施例1中所述生成并用pDM258轉(zhuǎn)化了鑲片鐮孢JfyS1763-ll_01的原生質(zhì)體。將轉(zhuǎn)化體如實施例26中所述進(jìn)行分析，并對搖瓶液就堿性蛋白酶活性進(jìn)行測定。將 PROTAZYME AK 片(Megazyme，Wicklow，Ireland)通過輕柔地攪拌懸于 2. Oml 0. 01%TRITON X-100中。將五百微升該懸液和500 μ 1補充了PROTAZYME AK片的測定緩沖液在EPPENDORF 管中混合并置于冰上。添加了二十微升的蛋白酶樣品(稀釋于0. 01%TRITON X-100)。該測定通過將該EPPENDORF 管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測定溫度EPPENDORF 熱混合器而起始。將管在EPPENDORF 熱混合器上以1300rpm溫育 15分鐘。該溫育通過將管轉(zhuǎn)移回冰浴而停止。然后將管在冰冷的離心機中以16，OOOxg離心幾分鐘，并將200 μ 1上清轉(zhuǎn)移至微滴定板。讀取在650nm的吸光度作為蛋白酶活性的量度。如amyA缺失，alpA基因的缺失不對乳糖氧化酶表達(dá)具有有利影響。然而，在發(fā)酵上清中堿性蛋白酶的副活性減少了 10倍(圖33)。實施例四:dpsl缺失載體PJfySlll的生成將鑲片鐮孢縮酚酸肽合酶(dpsl)基因(DNA序列為SEQ ID NO 93而推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO 94)的3，側(cè)翼序列從鑲片鐮孢JfyS1763-ll_01基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的SbfI位點，而斜體部分對應(yīng)于引入的用于之后去除β內(nèi)酰胺酶的Not I位點。正向引物5' -GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3' (SEQ ID NO 95)反向引物5' -AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3' (SEQ ID NO 96)擴(kuò)增反應(yīng)物以50 μ 1 的終體積含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 400nM 每種引物，200 μ M dNTPs, IOOng基因組DNA和1. 5單位HERCULASE DNA聚合酶。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進(jìn)行1個循環(huán)2分鐘；25個循環(huán)，每個在95°C進(jìn)行30秒，57°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1分20秒；和在 72 °C進(jìn)行1個循環(huán)7分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)物使用MINELUTE PCR Purification Kit純化。然后用^fI消化純化的反應(yīng)物并對其進(jìn)行使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳。將11Λ條帶從凝膠切出， 并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進(jìn)行瓊脂糖提取。然后將消化的載體依照生產(chǎn)商建議的實驗方案使用QUICK LIGATI0N Kit連接于經(jīng)SbfI-消化的pJfyS1579-41_ll (實施例12)(其經(jīng)小牛小腸磷酸酶脫磷酸)。對所得的克隆通過用Eco RI的限制性分析(以檢查插入物的存在和取向)和序列分析(以確保不含PCR錯誤)進(jìn)行分析，并將所得的質(zhì)粒命名為 pJfyS1879-32-2(圖 34)。為了獲得dpsl基因5’端的側(cè)翼序列，如實施例15中所述與如下所示的基因特異性和基因特異性嵌套引物一同使用GENOME WALKER Universal Kit。基因特異性引物5' -GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3' (SEQ ID NO 97)基因特異性嵌套引物5' -GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3' (SEQ ID NO 98)將5’ dpsl側(cè)翼序列從鑲片鐮孢JfyS1763-ll_l基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的Asc I位點而斜體部分對應(yīng)于引入的用于之后β-內(nèi)酰胺酶去除的Not I位點。擴(kuò)增反應(yīng)和循環(huán)參數(shù)與上述的那些相同，只是使用的引物是下述那些，所用的退火溫度是53°C，而延伸時間為1分15秒。正向引物5' -ATGTGCTACAGGCGCGCC GCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3， (SEQID NO: 99)反向引物5，-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3，(SEQ ID NO :100)PCR 反應(yīng)物使用MINELUTE PCR Purification Kit 純化。用 Asc I 消化純化的反應(yīng)物，并對其進(jìn)行使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳。將0. 7kb條帶從凝膠切出，并如上所述進(jìn)行瓊脂糖提取。將0.71Λ條帶使用QUICKLIGATION Kit連接于 pJfyS1879-32-2(經(jīng)Asc I消化而經(jīng)小牛小腸磷酸酶脫磷酸)。對所得的克隆通過序列分析加以分析以確保不含PCR錯誤，并將所得的質(zhì)粒命名為pJfySlll (圖35)并用于缺失鑲片鐮孢dpsl基因。實施例30 Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl 鑲片鐮孢菌株 JfyS1879-57-01 的生成當(dāng)(依照實施例1中所述的方法)用經(jīng)Not I消化的和凝膠純化的pJfySlll轉(zhuǎn)化鑲片鐮孢JfyS1763-ll-01原生質(zhì)體時，獲得了 77個轉(zhuǎn)化體。將其中48個從轉(zhuǎn)化板用滅菌牙簽轉(zhuǎn)移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板， 并在室溫溫育7日。真菌生物質(zhì)是通過用四個來自實施例1中所述生成的7日齡轉(zhuǎn)化體的Icm瓊脂栓接種25ml補充了 IOmM尿苷M400培養(yǎng)基來產(chǎn)生的。將培養(yǎng)物在以150rpm振蕩溫育3 日。去除瓊脂栓，并將培養(yǎng)物經(jīng)過MIRACL0TH 過濾。將收獲的生物質(zhì)用液氮凍結(jié)，并使用研缽和杵磨碎菌絲體。使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生產(chǎn)商的指示分離基因組DNA，只是將在 65°C的裂解溫育期從10分鐘延伸至1. 5小時。將兩μ g基因組DNA用Nco I和Spe I各28單位在50 μ 1反應(yīng)體積中在37°C消化22小時。在TAE緩沖液中對消化物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠中將DNA通過用 0. 25M HCl 處理進(jìn)行片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5MNa0H 變性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 轉(zhuǎn)移至NYTRAN Supercharge 尼龍膜。 將DNA使用UV STRATALINKER UV交聯(lián)至膜，并在42°C在20ml DIG Easy Hyb中預(yù)雜交1 小時。依照實施例11中所述的方法使用如下所示的正向和反向引物生成針對dpsl基因 3’側(cè)翼序列的DIG探針。正向引物5' -CTTGACTATTATCTCACGTTGTCAG-3‘ (SEQIDN0:101)反向引物5' -TCAAGTGTTGTGTAATGTTGGAACA-3‘ (SEQ ID NO :102)如實施例11中所述實施的Southern分析表明獲得的8個轉(zhuǎn)化體中的三個在dpsl 位點單一拷貝的缺失片段。將一個命名為鑲片鐮孢JfyS1879-43-05。Southern分析表明8個轉(zhuǎn)化體中的三個在dpsl位點以單一拷貝含有缺失片段。
50其中一個命名為鑲片鐮孢JfyS1879-43-5。將鑲片鐮孢JfyS1879-43_5如實施例1所述進(jìn)行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的150mm直徑板。將所得的孢子分離物亞培養(yǎng)至含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養(yǎng)基的新板。將所得的孢子分離物如實施例2中所述通過Southern分析進(jìn)行分析，并鑒定了一個正確地切出盒的孢子分離物。該分離物命名為鑲片鐮孢JfyS1879-52-3。將鑲片鐮孢JfyS1879_52_3如實施例11中所述進(jìn)行一次孢子純化，并挑取一個孢子分離物，并命名為鑲片鐮孢JfyS1879 -57-1 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl)。本發(fā)明進(jìn)一步由下述編號的段落描述[1] 一種產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本鑲片鐮孢菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸以及一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、 amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶；和(b)從培養(yǎng)基回收所述多肽。[2]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因的修飾。[3]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對amyA基因的修飾。[4]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對alpA基因的修飾。[5]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和amyA基因的修飾。[6]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和alpA基因的修飾。[7]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對amyA基因和alpA基因的修飾。[8]段落1的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因、amyA基因和alpA基因的修飾。[9]段落1-8任一項的方法，其中所述突變體菌株還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。[10]段落9的方法，其中所述突變體菌株包含對tri5基因的修飾。[11]段落9的方法，其中所述突變體菌株包含對dpsl基因的修飾。[12]段落9的方法，其中所述突變體菌株包含對tri5基因和dpsl基因的修飾。[13]段落9-12任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。[14]段落9-12任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。[15]段落1-14任一項的方法，其中所述多肽對于鑲片鐮孢菌株是天然的或外源的。[16]段落15的方法，其中所述多肽選自下組抗原、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報道蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。[17]段落16的方法，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。[18]段落1-17任一項的方法，其中所述突變體菌株包含至少兩個拷貝的編碼多肽的多核苷酸。[19]段落1-18任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[20]段落1-18任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[21]段落1-20任一項的方法，其中編碼具有乳清苷-5' _單磷酸脫羧酶活性的多肽的PyrG基因選自下組(a)編碼多肽的基因，所述多肽具有乳清苷-5' _單磷酸脫羧酶活性，包含與SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :43或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[22]段落21的方法，其中所述pyrG基因編碼多肽，所述多肽具有乳清苷_5'-單磷酸脫羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-單磷酸脫羧酶活性的片段組成。[23]段落1-20的方法，其中編碼具有α _淀粉酶活性的多肽的amyA基因選自下組(a)編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :51或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[24]段落23的方法，其中所述amyA基因編碼多肽，所述多肽具有α _淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :52或其具有 α-淀粉酶活性的片段組成。[25]段落1-20的方法，其中編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的alpA基因選自下組(a)編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :83或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[26]段落25的方法，其中所述alpA基因編碼多肽，所述多肽具有堿性蛋白酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有堿性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:52或其具有堿性蛋白酶活性的片段組成。[27]段落1-20的方法，其中編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的tri5基因選自下組(a)編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :19或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[28]段落27的方法，其中所述tri5基因編碼多肽，所述多肽具有單族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有單族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:20或其具有單族毒素合酶活性的片段組成。[29]段落1-20的方法，其中編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的dpsl基因選自下組(a)編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :93或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[30]段落四的方法，其中所述dpsl基因編碼多肽，所述多肽具有環(huán)己縮肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段組成。[31] 一種親本鑲片鐮孢菌株的突變體，包含編碼所述多肽的多核苷酸以及一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[32]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因的修飾。[33]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對amyA基因的修飾。[34]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對alpA基因的修飾。[35]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和amyA基因的修飾。[36]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和alpA基因的修飾。[37]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對amyA基因和alpA基因的修飾。[38]段落31的突變體菌株，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因、amyA基因和 alp基因的修飾。[39]段落31-38任一項的突變體菌株，其還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。[40]段落39的突變體菌株，其包含對tri5基因的修飾。[41]段落39的突變體菌株，其包含對dpsl基因的修飾。[42]段落39的突變體菌株，其包含對tri5基因和dpsl基因的修飾。[43]段落39-42任一項的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。
[44]段落39-42任一項的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。[45]段落31-44任一項的突變體菌株，其中所述多肽對于鑲片鐮孢菌株是天然的或外源的。[46]段落31-45任一項的突變體菌株，其中所述多肽選自下組抗原、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報道蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。[47]段落46的突變體菌株，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、 異構(gòu)酶或連接酶。[48]段落31-47任一項的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[49]段落31-47任一項的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[50]段落31-49任一項的突變體菌株，其中編碼具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的多肽的PyrG基因選自下組(a)編碼具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :43或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[51]段落50的突變體菌株，其中所述pyrG基因編碼多肽，所述多肽具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-單磷酸脫羧酶活性的片段組成。[52]段落31-49的突變體菌株，其中編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的amyA基因選自下組(a)編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :51或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[53]段落52的突變體菌株，其中所述amyA基因編碼多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID Ν0:52或其具有α-淀粉酶活性的片段組成。[54]段落31-49的突變體菌株，其中編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的alpA基因選自下組(a)編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :83或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[55]段落M的突變體菌株，其中所述alpA基因編碼多肽，所述多肽具有堿性蛋白
54酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有堿性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:52或其具有堿性蛋白酶活性的片段組成。[56]段落31-49的突變體菌株，其中編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的tri5基因選自下組(a)編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :19或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[57]段落56的突變體菌株，其中所述tri5基因編碼多肽，所述多肽具有單族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有單族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 20 或其具有單族毒素合酶活性的片段組成。[58]段落31-49的方法，其中編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的dpsl基因選自下組(a)編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :93或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[59]段落58的方法，其中所述dpsl基因編碼多肽，所述多肽具有環(huán)己縮肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段組成。[60]段落31-59任一項的突變體菌株，其包含編碼對于突變體菌株為外源的多肽的多核苷酸。[61] 一種獲得親本鑲片鐮孢菌株突變體的方法，包括(a)修飾選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA ；和(b)鑒定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[62]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因的修飾。[63]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對amyA基因的修飾。[64]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對alpA基因的修飾。[65]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和amyA基因的修飾。[66]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因和alpA基因的修飾。[67]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對amyA基因和alpA基因的修飾。[68]段落61的方法，其中所述突變體菌株包含對pyrG基因、amyA基因和alpA基因的修飾。[69]段落61-68任一項的方法，還包括修飾基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。
[70]段落69的方法，其中所述突變體菌株包含對tri5基因的修飾。[71]段落69的方法，其中所述突變體菌株包含對dpsl基因的修飾。[72]段落69的方法，其中所述突變體菌株包含對tri5基因和dpsl基因的修飾。[73]段落69-72任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。[74]段落69-72任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。[75]段落61-74任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[76]段落61-74任一項的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比完全缺陷于選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。[77]段落61-76任一項的方法，其中編碼具有乳清苷-5' _單磷酸脫羧酶活性的多肽的PyrG基因選自下組(a)編碼具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :43或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[78]段落77的方法，其中所述pyrG基因編碼多肽，所述多肽具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-單磷酸脫羧酶活性的片段組成。[79]段落61-76的方法，其中編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的amyA基因選自下組(a)編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :51或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[80]段落79的方法，其中所述amyA基因編碼多肽，所述多肽具有α _淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :52或其具有 α-淀粉酶活性的片段組成。[81]段落61-76的方法，其中編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的alpA基因選自下組(a)編碼具有堿性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :83或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[82]段落81的方法，其中所述alpA基因編碼多肽，所述多肽具有堿性蛋白酶活性，包含SEQ ID NO :84或其具有堿性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :84或其具有堿性蛋白酶活性的片段組成。[83]段落61-76的方法，其中編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的tri5基因選自下組(a)編碼具有單族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :19或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[84]段落83的方法，其中所述tri5基因編碼多肽，所述多肽具有單族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有單族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:20或其具有單族毒素合酶活性的片段組成。[85]段落61-76的方法，其中編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的dpsl基因選自下組(a)編碼具有環(huán)己縮肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含與SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO :93或其全長互補鏈雜交的基因；和(c)包含與SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[86]段落85的方法，其中所述dpsl基因編碼多肽，所述多肽具有環(huán)己縮肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有環(huán)己縮肽合成酶活性的片段組成。本文中描述和要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍并不受本文中具體公開的方面限制，因為這些方面意欲說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上， 除了本文中顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述描述而言是顯而易見的。此類修飾也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在出現(xiàn)沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。本文中引用了多種參考文獻(xiàn)，其公開通過提述以其整體并入。
5權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸以及選自下組的一個或多個 (幾個)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶；和(b)從培養(yǎng)基回收所述多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述突變體菌株還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素(trichodiene)合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者中是完全缺陷的。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述多肽對于鑲片鐮孢菌株是天然的或外源的。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
7.權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在選自下組的一個或多個(幾個)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
8.一種親本鑲片鐮孢菌株的突變體，包含編碼所述多肽的多核苷酸以及選自下組一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α -淀粉酶和堿性蛋白酶。
9.權(quán)利要求8的突變體菌株，其還包含基因tri5和dpsl之一或兩者，其中所述基因之一或兩者經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。
10.權(quán)利要求9的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。
11.權(quán)利要求9的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者中是完全缺陷的。
12.權(quán)利要求8-11任一項所述的突變體菌株，其中所述多肽對于鑲片鐮孢菌株是天然的或外源的。
13.權(quán)利要求8-12任一項所述的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
14.權(quán)利要求8-12任一項所述的突變體菌株，其與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在選自下組的一個或多個(幾個)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
15.一種獲得親本鑲片鐮孢菌株的突變體的方法，包括(a)修飾選自下組的一個或多個(幾個)基因pyrG、amyA和alpA；和(b)鑒定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述選自下組的一個或多個(幾個)基因 pyrG、amyA和alpA經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷_5’ -單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
16.權(quán)利要求15任一項所述的方法，還包括修飾基因tri5和dpsl之一或兩者，使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者的產(chǎn)生中有缺陷。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在單族毒素合酶和環(huán)己縮肽合成酶之一或兩者中是完全缺陷的。
19.權(quán)利要求15-18任一項所述的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比少產(chǎn)生至少25%的選自下組的一個或多個(幾個)酶乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
20.權(quán)利要求15-18任一項所述的方法，其中所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比在選自下組的一個或多個(幾個)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶，α-淀粉酶和堿性蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在用于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本鑲片鐮孢菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸以及一個或多個(幾個)選自下組的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一個或多個(幾個)基因經(jīng)修飾使得所述突變體菌株與在相同條件下培養(yǎng)的親本鑲片鐮孢菌株相比分別在選自下組的一個或多個(幾個)酶的產(chǎn)生中有缺陷乳清苷-5′-單磷酸脫羧酶、α-淀粉酶和堿性蛋白酶；和(b)從培養(yǎng)基回收所述多肽。本發(fā)明還涉及鑲片鐮孢菌株的酶缺陷突變體和產(chǎn)生此類突變體的方法。
文檔編號C12N15/80GK102227502SQ200980147258
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者杰弗里·沙斯基, 溫迪·約德 申請人:諾維信股份有限公司