專利名稱：瘧原蟲疫苗、抗原、組合物和方法
瘧原蟲疫苗、抗原、組合物和方法交叉申請案本申請案主張2008年9月觀日申請的美國臨時申請案61/100，744的權益，所述申請案的整體揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
背景技術：
瘧疾是一種由瘧原蟲屬(genus Plasmodium)的原生動物寄生蟲引起的媒介傳播的傳染性疾病。其在熱帶和亞熱帶地區廣泛傳播，包括美洲、亞洲和非洲的部分地區。 每年約有5. 15億瘧疾病例，導致一百萬到三百萬人死亡，其中大多數是撒哈拉以南非洲 (Sub-Saharan Africa)的年幼兒童(斯諾(Snow)等人，2005，自然(Nature)，4；34 :214-7 ； 以引用的方式并入本文中)。瘧疾通常與貧窮有關，但也是貧窮的原因和經濟發展的主要障礙。瘧原蟲屬寄生蟲通過雌性瘧蚊屬(Anopheles)蚊蟲來傳播。癥狀包括頭暈目眩、 呼吸急促、心動過速、發熱、寒戰、惡心、類似流感的疾病、昏迷和死亡中的一種或一種以上。 目前沒有可用于瘧疾的疫苗?，F有預防性療法必須連續使用以降低感染風險，但這些預防性處理對于生活在地方病流行地區的大多數人來說通常太過昂貴。瘧疾感染通常通過使用諸如奎寧(quinine)或青蒿素(artemisinin)衍生物等抗瘧疾藥來治療，但耐藥性越來越常見。

發明內容
本發明提供誘導或增強針對瘧原蟲有性繁殖階段(sexual-stage)抗原(例如 Pfs25、Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCSl同源物)和配子體表面抗原的免疫反應的組合物和制備組合物的方法。所述組合物適用于減少瘧原蟲感染的傳播。所述組合物可包括包含熱穩定性蛋白質和瘧原蟲多肽的分離的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽可為Pfs25、 Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予個體時誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應。在一些實施例中，所述熱穩定性蛋白質可為地衣多糖酶(lichenase)多肽。所述地衣多糖酶多肽可為經修飾的地衣多糖酶B多肽。所述經修飾的地衣多糖酶B多肽可為具有SEQ ID NO :40的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID NO :40具有至少90%、至少95%、至少98%序列一致性的經修飾的地衣多糖酶B多肽。在一些實施例中，瘧原蟲多肽可為Pfs25多肽。所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO 42的氨基酸序列或可與SEQ ID NO 42具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些實施例中，瘧原蟲多肽可為Pfs^多肽。所述Pf8 多肽可具有SEQ ID N0:55 的氨基酸序列或可與SEQ ID NO :55具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些實施例中，瘧原蟲多肽可為Pfs48/45多肽。所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO 62 的氨基酸序列或可與SEQ ID NO :62具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些實施例中，瘧原蟲多肽可為Pfs230多肽。所述Pfs230多肽可具有SEQ ID NO :95的氨基酸序列或可與SEQ ID NO :95具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。
在一些實施例中，融合蛋白可具有選自由以下組成的群組的氨基酸序列SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254，或可為與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少99%序列一致性的多肽SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。還揭示包含編碼所述融合蛋白的序列的核酸。所述核酸可編碼選自由以下組成的群組的多肽的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、168、170、172、 174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、 212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、 252和254，或與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少99% 序列一致性的多肽的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、 170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、 208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、252和254。還揭示包含所述核酸的表達載體。所述表達載體可進一步包含前導序列。表達載體可為農桿菌(Agrobacterial)質粒、植物病毒載體或克隆到農桿菌質粒中的植物病毒載體。還揭示包含所述表達載體的宿主細胞。所述宿主細胞可為植物細胞且可包含植物。還揭示產生融合蛋白和瘧原蟲Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的方法， 所述方法包含提供包含編碼所述融合蛋白的核酸的核酸構筑體；將所述核酸構筑體引入植物細胞中；和在允許融合蛋白表達的條件下維持所述細胞。還揭示在植物中制備誘導或增強針對瘧原蟲有性繁殖階段抗原(例如Pfs25、 Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCSl同源物)和配子體表面抗原的免疫反應的組合物的方法。這些方法包括制備誘導或增強針對瘧原蟲Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的免疫反應的組合物的方法。在一實施例中，所述方法包含在植物中產生如上文所述的融合蛋白；分離融合蛋白；和將分離的融合蛋白與醫藥學上可接受的載劑組合。在一實施例中，所述方法包含在植物中產生瘧原蟲多肽Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230 ；分離多肽；和將多肽與醫藥學上可接受的載劑組合。瘧原蟲多肽可為Pfs25多肽；所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO :42的氨基酸序列或可為與SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。瘧原蟲多肽可為Pfs^多肽；所述Pfs28多肽可具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列或可為與SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。瘧原蟲多肽可為Pfs48/45 多肽；所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列或可為與SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。瘧原蟲多肽可為Pfs230多肽；所述Pfs230多肽可具有 SEQ ID NO :95的氨基酸序列或可為與SEQ ID NO :95具有至少90%序列一致性的多肽。 植物可短暫表達多肽或融合蛋白；所述短暫表達可來自農桿菌質粒、植物病毒載體或克隆到農桿菌質粒中的植物病毒載體。在一些實施例中，植物可為多肽或融合蛋白轉基因植物。植物可來自選自由以下組成的群組的屬蕓苔屬(Brassica)、煙草屬(Nicotiana)、 矮牽牛屬(Petunia)、西紅棉屬(Lycopersicon)、爺屬(Solanum)、番椒屬(Capsium)、胡蘿卜屬(Daucus)、旱芹屬(Apium)、萵苣屬(Lactuca)、芥子屬(Sinapis)或擬南芥屬 (Arabidopsis)，例如本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)、埃塞俄比亞芥(Brassica carinata)、^f 胃(Brassica juncea)、yjfl _ 3 (Brassica napus)、！I # (Brassica nigra) > 1ξ[" M (Brassica oleraceae) > ^f (Brassica tournifortii) > [=| ^f
(Sinapis alba)和蘿卜(Raphanus sativus)。可使用的植物包括紫花苜蓿(alfalfa)、蘿卜 (radish)、芥菜(mustard)、綠豆(mung bean)、西蘭花(broccoli)、7jC 田序(watercress)、 大豆(soybean)、小麥(wheat)、向曰葵(sunflower)、卷心菜(cabbage)、三葉草(clover)、 (petunia)(tomato)(potato)(tobacco) ^ (spinach)禾口
小扁豆(lentil)。在一些實施例中，植物可為發芽的籽苗。還提供通過上述方法產生的植物細胞和含有這種植物細胞的植物。在一些實施例中，植物產瘧原蟲多肽是從植物材料純化而來。在一些實施例中，植物產瘧原蟲多肽不是從植物材料純化而來。還揭示包含技術方案1至32中任一技術方案的融合蛋白和醫藥學上可接受的載劑或賦形劑的醫藥組合物。所述組合物可進一步包括佐劑。所述佐劑可選自由以下組成的群組明礬、Quil A、QS21、氫氧化鋁、磷酸鋁、礦物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐劑 (incomplete Freund' s adjuvant)、完全弗氏佐劑(complete Freund' s adjuvant)、招膠(alhydrogel)、3去_0_酰化單磷?；|A(3D-MPL)、脂質A、百日咳桿菌(Bortadella pertussis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐劑 65 (Merck Adjuvant65)、角鯊烯、病毒顆粒(virosome)、SBAS2、SBAS1、AS03 和未甲基化 CpG 序列。還提供一種在個體中誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的方法，所述方法包含投予治療有效量的根據上述方法制備的瘧原蟲多肽或其組合物?？山浛?、鼻內、皮下、靜脈內、腹膜內或肌肉內投予所述肽或其組合物。還提供一種在個體中誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的方法，所述方法是通過向個體供給通過上文所述產生的植物或其可食用部分或植物細胞來進行。在這些方法中，所述個體可為動物，諸如人類、非人類靈長類動物、鳥類或嚙齒動物。還揭示減少瘧原蟲感染的傳播的方法。在一實施例中，所述方法包含減少瘧原蟲向處于瘧原蟲感染風險中的群體中的個體傳播，包含向所述群體中的一個或一個以上個體投予有效量的根據上述方法制備的瘧原蟲多肽或其組合物。在一實施例中，方法包含減少瘧原蟲從個體傳播的方法，所述方法包含向個體投予有效量的根據上述方法制備的瘧原蟲多肽或其組合物。在這些方法中，所述個體可為動物，諸如人類、非人類靈長類動物、鳥類或嚙齒動物。定義氨基酸如本文中所使用，術語“氨基酸”在其最廣泛意義上是指任何可并入多肽鏈中的化合物和/或物質。在一些實施例中，氨基酸具有通用結構&N-C(H) (R)-C00H。在一些實施例中，氨基酸為天然存在的氨基酸。在一些實施例中，氨基酸為合成氨基酸；在一些實施例中，氨基酸為D-氨基酸；在一些實施例中，氨基酸為L-氨基酸。“標準氨基酸”是指天然存在的肽中常見的二十種標準L-氨基酸中的任一種。“非標準氨基酸”是指除標準氨基酸以外的任何氨基酸，這與其是合成制備還是從天然來源獲得無關。如本文中所使用， “合成氨基酸”涵蓋經化學修飾的氨基酸，包括(但不限于)鹽、氨基酸衍生物(諸如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端氨基酸)可通過甲基化、酰胺化、乙?；?或用其它可改變所述肽的循環半衰期而不會不利地影響其活性的化學基團取代來修飾。氨基酸可能會參與二硫鍵。術語“氨基酸”可與“氨基酸殘基”互換使用并且可以指游離氨基酸和/或肽的氨基酸殘基。可從使用術語的上下文明了其是指游離氨基酸還是肽的殘基。動物如本文中所使用，術語“動物”是指動物界的任何成員。在一些實施例中，“動物”是指處于任何發育階段的人類。在一些實施例中，“動物”是指處于任何發育階段的非人類動物。在某些實施例中，所述非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、 猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物和/或豬)。在一些實施例中，動物包括(但不限于)哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲和/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為轉基因動物、遺傳工程改造動物和/或克隆?？贵w如本文中所使用，術語“抗體”是指天然或完全或部分合成產生的任何免疫球蛋白。其維持特定結合能力的所有衍生物也都包括在所述術語中。所述術語還涵蓋具有與免疫球蛋白結合結構域同源或基本上同源的結合結構域的任何蛋白質。所述蛋白質可以來源于天然來源，或部分或完全合成產生。抗體可為單克隆或多克隆抗體?？贵w可為任何免疫球蛋白類別的成員，包括任何人類類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用， 術語“抗體片段”或“抗體的特征性部分”可互換使用并且是指小于全長的任何抗體衍生物。 一般來說，抗體片段至少保留全長抗體的特定結合能力的相當大部分?？贵w片段的實例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、Fv、dsFv雙功能抗體和Fd片段。抗體片段可以通過任何方式來產生。舉例來說，抗體片段可以通過裂解完整抗體以酶促方式或以化學方式產生和/或其可以由編碼部分抗體序列的基因重組產生?；蛘呋蛄硗?，抗體片段可以完全或部分合成產生。抗體片段可以任選包含單鏈抗體片段?；蛘呋蛄硗?，抗體片段可以包含例如由二硫鍵連接在一起的多個鏈。抗體片段可以任選包含多分子復合物。功能性抗體片段通常包含至少約50個氨基酸且更通常包含至少約200個氨基酸。約如本文中所使用，術語“約(approximately/about)”在應用于一個或一個以上所關注的值時是指類似于所述參考值的值。在某些實施例中，除非另有規定或另外從上下文顯而易見(除了所述數值將超過可能值的100%的情況以外)，否則術語“約”是指處于所述參考值在任一方向(大于或小于)上的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、 13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以內的值范圍。特征性部分如本文中所使用，短語蛋白質或多肽的“特征性部分”是含有一段連續氨基酸或共同作為蛋白質或多肽的特點的許多段連續氨基酸的部分。各所述連續段一般將含有至少兩個氨基酸。此外，所屬領域的技術人員應了解，通常需要至少5個、至少10個、 至少15個、至少20個或更多氨基酸表現蛋白質的特點。一般來說，特征性部分是除以上所指定的序列特性外還與相關完整蛋白質共有至少一種功能性特征的部分。特征性序列“特征性序列”是存在于多肽或核酸家族的所有成員中的序列，且因此所屬領域的技術人員可用來定義家族的成員。組合療法如本文中所使用，術語“組合療法”是指以重疊方案投予兩種或兩種以上不同醫藥劑以使個體同時接觸兩種藥劑的那些情形。給藥方案如本文中所使用，“給藥方案”是指間隔一定時段個別地投予的一組單位劑量(通常是多個)。推薦用于特定醫藥劑的一組劑量(即，投藥量、時序、途徑等)構成其給藥方案。表達如本文中所使用，核酸序列的“表達”是指一個或一個以上如下事件⑴從 DNA序列產生RNA模板(例如通過轉錄)；( 加工RNA轉錄物(例如通過拼接、編輯和/或 3'末端形成)；(3)將RNA翻譯為多肽或蛋白質；(4)多肽或蛋白質的翻譯后修飾?；蛉绫疚闹兴褂?，術語“基因”具有如所屬領域中所了解的含義。所屬領域的技術人員應了解，術語“基因”可以包括基因調控序列(例如啟動子、增強子等)和/或內含子序列。應進一步了解，基因的定義包括提及不編碼蛋白質而是編碼功能性RNA分子 (諸如tRNA)的核酸。為了清楚起見，我們應注意，如本申請案中所使用，術語“基因”一般是指編碼蛋白質的核酸的一部分；所屬領域的技術人員從上下文可顯而易見，所述術語可任選涵蓋調控序列。這一定義并不打算排除對不編碼蛋白質的表達單元應用術語“基因”， 而是澄清在大多數情況下，如本文件中所使用的所述術語是指編碼蛋白質的核酸?；虍a物如本文中所使用，術語“基因產物”或“表達產物” 一般是指從基因轉錄的RNA(加工前和/或加工后)或由從所述基因轉錄的RNA所編碼的多肽(修飾前和/或修飾后)。同源性如本文中所使用，術語“同源性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中， 如果聚合分子的序列至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少 95%或至少99%—致，那么認為這些聚合分子彼此“同源”。在一些實施例中，如果聚合分子的序列至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%類似，那么認為這些聚合分子彼此“同源”?！滦匀绫疚闹兴褂?，術語“一致性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。舉例來說，兩個核酸序列的一致性百分比的計算可通過出于最佳比較目的對準兩個序列來進行(例如，可將間隙引入第一和第二核酸序列中的一個或兩個中以便最佳對準且出于比較目的可以忽略非一致序列)。在某些實施例中，出于比較目的所對準的序列長度為參考序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著比較相應核苷酸位置的核苷酸。當第一序列中的位置未被與第二序列中的相應位置相同的核苷酸占據時，則所述分子在那個位置上是一致的。兩個序列之間的一致性百分比與所述序列共有的一致位置的數目有關，并且考慮最佳對準兩個序列需要引入的間隙的數目和各間隙的長度。序列的比較和兩個序列之間的一致性百分比的測定可以使用數學算法來完成。 舉例來說，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可以使用邁爾(Meyers)和米勒(Miller) (生物科學中的計算機應用(CABIOS)，1989,4:11-17)的算法來測定，所述算法已并入使用 PAM120權數殘基表、間隙長度罰分12和間隙罰分4的ALIGN程序O. 0版)中?；蛘撸瑑蓚€核苷酸序列之間的一致性百分比可以使用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna. CMP 矩陣來測定。如本文中所使用，術語“總體一致性”是指一長段序列中的一致性。在一些實施例中，總體一致性是指至少50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、400個、500個或更多個氨基酸和/或核苷酸中的一致性。在一些實施例中，總體一致性是指指定序列的完整長度中的一致性。分離的如本文中所使用，術語“分離的”是指如下的物質和/或實體⑴與至少一些在最初產生(在自然界中和/或在實驗環境中)時與其結合的組分分離；和/或(2) 人工產生、制備和/或制造。分離的物質和/或實體可以與最初與其結合的其它組分的至少約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、 約98 %、約99 %或100 %分離。在一些實施例中，分離的藥劑的純度大于約80 %、約85 %、 約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99%、實質上100%或100%。如本文中所使用，如果物質實質上不含其它組分，那么其是“純的”。 如本文中所使用，術語“分離的細胞”是指不包含在多細胞生物體中的細胞。地衣多糖酶多肽如本文中所使用，術語“地衣多糖酶多肽”是指與表1中所列的一種或一種以上地衣多糖酶多肽顯示至少50%總體序列一致性的多肽。在一些實施例中， 地衣多糖酶多肽與所列地衣多糖酶多肽顯示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些實施例中，地衣多糖酶多肽與所列地衣多糖酶多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。核酸如本文中所使用，術語“核酸”在其最廣泛意義上是指并入或可以并入寡核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質。在一些實施例中，核酸是經由磷酸二酯鍵并入或可以經由磷酸二酯鍵并入寡核苷酸鏈中的化合物和/或物質。在一些實施例中，“核酸”是指個別核酸殘基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些實施例中，“核酸”是指包含個別核酸殘基的寡核苷酸鏈。如本文中所使用，術語“寡核苷酸”和“聚核苷酸”可互換使用。在一些實施例中，“核酸”涵蓋RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或CDNA0此夕卜，術語“核酸”、“DNA，，、 “RNA”和/或類似術語包括核酸類似物，即具有非磷酸二酯主鏈的類似物。舉例來說，所屬領域中已知且在主鏈中具有肽鍵以代替磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”被認為在本發明的范圍內。術語“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為簡并形式和/或編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質和/或RNA的核苷酸序列包括內含子。核酸可以從天然來源純化，使用重組表達系統產生且任選純化，化學合成等。適當時，例如在化學合成分子的情況下，核酸可以包含核苷類似物，諸如具有經化學修飾的堿基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另有指示，否則核酸序列以5'至3'方向呈現。術語“核酸區段”在本文中用于指作為較長核酸序列的一部分的核酸序列。在許多實施例中，核酸區段包含至少3個、至少 4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或10個以上殘基。在一些實施例中，核酸是以下物質或包含以下物質天然核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、 尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、(N-吡咯基)_嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)；經化學修飾的堿基；經生物修飾的堿基(例如甲基化堿基)；插入的堿基；經修飾的糖(例如2’ -氟核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或經修飾的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5 ‘ -N-亞磷酰胺鍵聯)。在一些實施例中，本發明可能具體涉及“未經修飾的核酸”，其意思是尚未經化學修飾以促進或實現
13傳遞的核酸(例如聚核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)?？刹僮鞯剡B接如本文中所使用，術語“可操作地連接”是指兩個核酸序列之間的關系，其中一個核酸序列的表達受另一核酸序列控制、調控、調節等。舉例來說，核酸序列的轉錄受可操作地連接的啟動子序列指導；核酸的轉錄后加工受可操作地連接的加工序列指導；核酸序列的翻譯受可操作地連接的翻譯調控序列指導；核酸或多肽的轉運或定位受可操作地連接的轉運或定位序列指導；且多肽的翻譯后加工受可操作地連接的加工序列指導。可操作地連接于第二核酸序列的核酸序列可以直接或間接共價連接于所述序列，不過任何有效三維結合都是可接受的。Pfs25多肽如本文中所使用，術語“Pfs25多肽”是指與圖1中所列的一種或一種以上Pfs25多肽顯示至少50%總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，Pfs25多肽與所列Pfs25多肽顯示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少 97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些實施例中，Pf s25多肽與所列Pf s25多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。編碼代表性Pfs25多肽的氨基酸序列展示于圖M中 (SEQ ID NO 41 ；基因庫(Genbank)編號AAF63684. 1)。與基因庫編號AAF63684. 1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10個或更多個氨基酸變化。Pfs25的已鑒別出的其它氨基酸序列包括例如(但不限于)AAD55785. 1 ；AAD39544. 1。Pfs28多肽如本文中所使用，術語“Pfd8多肽”是指與圖1中所列的一種或一種以上Pfs28多肽顯示至少50%總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，Pfs28多肽與所列Pfs^多肽顯示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些實施例中，Pfs28多肽與所列Pfs^多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。編碼代表性Pfs^多肽的氨基酸序列展示于圖M 中(SEQ ID NO 55 ；基因庫編號AAT00624. 1)。與基因庫編號AAT00624. 1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10個或更多個氨基酸變化。Pfs48/45多肽如本文中所使用，術語“Pfs48/45多肽”是指與圖1中所列的一種或一種以上Pfs48/45多肽顯示至少50%總體序列一致性的多肽。在一些實施例中， Pfs48/45多肽與所列Pfs48/45多肽顯示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些實施例中， Pfs48/45多肽與所列Pfs48/45多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。編碼代表性 Pfs48/45多肽的氨基酸序列展示于圖M中(SEQ ID NO 62 ；基因庫編號PF13_0M7)。與基因庫編號PF13_0M7的氨基酸序列相比，Pfs48/45的其它代表性形式的氨基酸序列具有 1、2、3、4、5、10個或更多個氨基酸變化。Pfs230多肽如本文中所使用，術語“Pfs230多肽”是指與圖1中所列的一種或一種以上Pfs230多肽顯示至少50%總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，Pfs230多肽與所列Pfs230多肽顯示至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些實施例中，Pf s230多肽與所列Pf s230 多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。編碼代表性Pfs230多肽的氨基酸序列展示于圖M中(SEQ ID NO 95 ；基因庫編號AAA^724)。與基因庫編號AAA297M的氨基酸序列相比，Pfs230的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10個或更多個氨基酸變化。醫藥劑如本文中所使用，短語“醫藥劑”是指當投予個體時具有治療作用和/或引發所需生物和/或藥理學作用的任何藥劑。醫藥學上可接受的載劑或賦形劑如本文中所使用，術語“醫藥學上可接受的載劑或賦形劑”的意思是任何類型的無毒、惰性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或調配助劑。瘧原蟲多肽如本文中所使用，術語“瘧原蟲多肽”或“瘧原蟲抗原多肽”是指與圖1中所列的一種或一種以上Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽顯示至少50% 總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，瘧原蟲多肽與所列Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和 /或Pfs230多肽顯示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些實施例中、瘧原蟲多肽與所列Pf s25、 Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽進一步共有至少一個特征性序列元件。在一些實施例中，瘧原蟲多肽不是Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽，而是由瘧原蟲屬的一個或一個以上物種天然產生的不同多肽。部分如本文中所使用，短語物質的“部分”或“片段”在最廣泛意義上是與相關完整物質共有一定程度的序列和/或結構一致性和/或至少一種功能性特征的部分或片段。 舉例來說，蛋白質或多肽的“部分”是含有一段連續氨基酸或共同作為蛋白質或多肽的特點的許多段連續氨基酸的集合的部分。在一些實施例中，各所述連續段一般將含有至少2個、 至少5個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個氨基酸。一般來說，部分是除以上所說明的序列一致性外還與相關完整蛋白質共有至少一種功能性特征的部分。在一些實施例中，所述部分可以具有生物活性。蛋白質如本文中所使用，術語“蛋白質”是指多肽(即，含至少兩個由肽鍵相互連接的氨基酸的鏈)。蛋白質可以包括除氨基酸以外的部分(例如可為糖蛋白、蛋白聚糖等) 和/或可以另外經加工或修飾。所屬領域的普通技術人員應了解，“蛋白質”可為由細胞所產生的完整多肽鏈(有或無信號序列)，或可為其特征性部分。所屬領域的普通技術人員應了解，蛋白質有時可以包括多個多肽鏈，例如由一個或一個以上二硫鍵連接或通過其它方式結合。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或兩者而且可以含有所屬領域中已知的多種氨基酸修飾或類似物中的任一種。適用的修飾包括例如末端乙?；Ⅴ０坊?。在一些實施例中，蛋白質可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其組合。術語“肽”一般用于指長度小于約100個氨基酸的多肽。相似性如本文中所使用，術語“相似性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。聚合分子彼此的相似性百分比的計算可以與計算一致性百分比相同的方式進行，除了相似性百分比的計算考慮如所屬領域中所了解的保守性取代以外。個體如本文中所使用，術語“個體”或“患者”是指例如出于實驗、診斷、預防和/ 或治療目的可以投予本發明的組合物的任何生物體。典型個體包括動物(例如哺乳動物， 諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物和人類；昆蟲；蠕蟲；等)。實質上如本文中所使用，術語“實質上”是指展現全部程度或接近全部程度的所關注特征或性質的定性條件。所屬領域的普通技術人員應了解，生物學和化學現象很少 (如果發生過的話)達到完全和/或進行到完全或達成或避免絕對結果。因此，術語“實質上”在本文中用于記錄許多生物學和化學現象中所固有的可能的完全性缺乏。
罹患“罹患”疾病、病癥和/或病狀的個體已確診患有所述疾病、病癥和/或病狀或呈現所述疾病、病癥和/或病狀的一種或一種以上癥狀。易患“易患”疾病、病癥和/或病狀的個體尚未確診患有所述疾病、病癥和/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體可能不展現所述疾病、病癥和/或病狀的癥狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體將發展所述疾病、病癥和 /或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體不會發展所述疾病、病癥和/ 或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體為發展特定疾病或病癥或其癥狀的風險(通常基于遺傳傾向、環境因素、個人病史或其組合)高于一般群體中所觀察到的風險的個體。治療有效量術語醫藥劑或藥劑組合的“治療有效量”欲指在適用于任何醫學治療的合理益處/風險比下對所治療的個體賦予治療作用的藥劑的量。在一些實施例中，治療有效量是當投予罹患或易患疾病、病癥和/或病狀的個體時足以治療、診斷、預防和/或延緩疾病、病癥和/或病狀的癥狀發作的量。所述治療作用可為客觀的(即，可通過一些測試或標記來測量)或主觀的(即，個體聲明有作用或感到有作用)。治療有效量通常以可能包含多個單位劑量的給藥方案來投予。對于任何特定醫藥劑，治療有效量(和/或有效給藥方案中的適當單位劑量)可以例如視投藥途徑、與其它醫藥劑的組合而變化。用于任何特定個體的特定治療有效量(和/或單位劑量)也可以視多種因素而定，包括所治療的病癥和病癥的嚴重程度；所用特定醫藥劑的活性；所用的特定組合物；個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投藥時間、投藥途徑和/或所用特定醫藥劑的排泄或代謝速率；治療持續時間；和如醫學技術中熟知的類似因素。治療劑如本文中所使用，短語“治療劑”是指當投予個體時具有治療作用和/或引發所需生物和/或藥理學作用的任何藥劑。治療如本文中所使用，術語“治療”是指以任何形式投予生物活性劑，從而部分或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病癥和/或病狀的一種或一種以上癥狀或特征，延緩其一種或一種以上癥狀或特征發作，預防其一種或一種以上癥狀或特征，降低其一種或一種以上癥狀或特征的嚴重程度和/或降低其一種或一種以上癥狀或特征的發生率。所述治療可以用于不展現相關疾病、病癥和/或病狀的征兆的個體和/或僅展現疾病、病癥和/或病狀的早期征兆的個體。或者或另外，所述治療可以用于展現相關疾病、病癥和/或病狀的一種或一種以上既定征兆的個體。單位劑量如本文中所使用，術語“單位劑量”是指通常在給藥方案的情形下醫藥劑的不連續投予。載體如本文中所使用，“載體”是指可以轉運與其所連接的另一核酸的核酸分子。 在一些實施例中，載體可以在諸如真核和/或原核細胞等宿主細胞中實現與其所連接的核酸的染色體外復制和/或表達。能夠指導可操作地連接的基因的表達的載體在本文中稱為 “表達載體”。


圖1.來自瘧原蟲屬物種的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230。粗體氨基酸表示信號肽的位置。下劃線氨基酸表示存在地衣多糖酶、6XHis標簽和KDEL序列。正常字體氨基酸表示Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230序列。粗體又下劃線的氨基酸表示天然蛋白質中的跨膜結構域和/或gpi錨。圖2-12.肽與AlMVCP的融合物的表達、表征和純化圖 13 是二元投放載體(Binary Launch Vector)的圖形表示pGR_D4。圖14是用于產生構筑體的經修飾的地衣多糖酶基因的圖形表示。圖15顯示所選瘧疾抗原的蛋白質產生的實例。圖16. Pfs25和Pfs28目標的工程改造、表達和溶解性概況。圖17是總結Pfs25構筑體的IFA、SIFA和SMFA分析的結果的表格。圖18是總結Pfs28構筑體的IFA、SIFA和SMFA分析的結果的表格。圖19.Pfs48目標的工程改造、表達和溶解性概況。圖20是總結Pfs48/45構筑體的IFA、SIFA和SMFA分析的結果的表格。圖21. Pfs230目標的工程改造、表達和溶解性概況。圖22是總結Pfs230構筑體的IFA、SIFA和SMFA分析的結果的表格。圖23A描繪在鋁膠存在下由Pfs230A引發的IgG反應的同型分析的結果。圖2 描繪在Quil A佐劑存在下由Pfs230A引發的IgG反應的同型分析的結果。圖M提供來自瘧原蟲屬物種的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白序列。圖25提供來自瘧原蟲屬物種的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白構筑體。
具體實施例方式瘧原蟲和瘧原蟲療法瘧疾，一種常見傳染性疾病和巨大公眾健康問題，是由瘧原蟲屬的原生動物寄生蟲引起。四種瘧原蟲屬物種可感染人類惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形皰原蟲(Plasmodium ovale)和三日皰原蟲(Plasmodium malariae)。疾病的最嚴重形式是由惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲引起。如本文中所使用，術語 “瘧疾寄生蟲”用于指這些瘧原蟲屬物種中的一種、兩種、三種或四種。瘧疾寄生蟲通過雌性瘧蚊屬蚊蟲來傳播。瘧疾寄生蟲在紅血球中繁殖，引起包括貧血癥狀(例如頭暈目眩、呼吸急促、心動過速等)的癥狀，以及其它全身癥狀，諸如發熱、 寒戰、惡心、類似流感的疾病和在嚴重情況下甚至導致昏迷和死亡。瘧疾傳播可通過用蚊帳和驅蟲劑來防止蚊蟲叮咬，或通過諸如在室內噴灑殺蟲劑和排干積水(蚊蟲會在積水中產卵)等蚊蟲防治措施來減少。目前沒有可用于瘧疾的疫苗。現有預防性療法必須連續使用以降低感染風險。這些預防性處理對于生活在地方病流行地區的人來說通常太過昂貴。瘧疾感染通過使用抗瘧疾藥來治療，諸如奎寧或青蒿素衍生物，但耐藥性越來越常見。本文提供用于誘導或增強針對在瘧原蟲生命周期的有性繁殖階段表達的抗原的免疫反應的材料與方法。更具體來說，提供多肽和制備所述多肽的方法。針對寄生蟲的有性繁殖階段的免疫性提供減少或阻止瘧疾傳播的有效方式。特異性靶向蚊蟲媒介中的寄生蟲的有性發育的傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine,TBV)可引出制造可有效地阻斷寄生蟲從無脊椎動物蚊蟲媒介傳播到脊椎動物宿主的抗體。瘧疾的傳播取決于在受感染者的周邊血液中存在傳染性雄性和雌性配子體和瘧蚊屬蚊蟲成功攝取這些配子體。攝取后不久，在蚊蟲的中腸中形成小配子，且新出現的雄配子使雌配子受精，從而形成合子。合子經歷受精后轉化成為活動型動合子，其穿過中腸上皮并發育成卵囊，從而產生傳染性子孢子。最后，子孢子釋放到血腔中，侵入唾液腺并且在隨后取食血液期間傳播到脊椎動物宿主。傳播阻斷抗體的目標可包括在循環配子體中表達的受精前抗原(Pfs230和 Pfs48/45)和在蚊蟲階段動合子發育期間表達的受精后抗原(Pfs25和Pfs28)。不同于 Pfs25和Pfs28，受精前抗原也是天然免疫反應的目標且因此由基于任何這些抗原的疫苗誘導的免疫性將增加免疫性的天然加強的益處。因為傳播阻斷抗體靶向蚊蟲媒介中的寄生蟲所表達的抗原，所以預期所述抗體有效減少寄生蟲傳播到下一宿主。傳播阻斷抗體適用于減少群體(例如一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上個體的群組)中的瘧原蟲傳播。 所述個體可存在于同一有限地理區域內，例如家庭或社區。瘧原蟲抗原—般來說，瘧原蟲抗原可以包括引發針對瘧原蟲屬寄生蟲的免疫反應的任何免疫原性多肽。根據本發明，所關注的免疫原性多肽可以獨立多肽形式、以融合蛋白形式、以經修飾多肽(例如含有其它側接基團，諸如碳水化合物基團、甲基、烷基[諸如甲基、乙基等]、 磷酸酯基、脂質基團、酰胺基、甲?；?、生物素基、血紅素基、羥基、碘基、異戊二烯基、十四烷酰基、黃素基、軟脂?；?、硫酸酯基、聚乙二醇等)形式提供。在一些實施例中，用于本發明的瘧原蟲抗原多肽具有是或包括與自然界中所發現的瘧原蟲多肽序列一致的序列的氨基酸序列；在一些實施例中，瘧原蟲抗原多肽具有是或包括與自然界中所發現的瘧原蟲多肽的特征性部分(例如免疫原性部分)一致的序列的氨基酸序列。在某些實施例中，利用全長蛋白質作為本發明的疫苗組合物中的瘧原蟲抗原多肽。在一些實施例中，使用瘧原蟲多肽的一個或一個以上免疫原性部分。在某些實施例中， 以一個或一個以上單獨多肽形式或以一個或一個以上融合多肽中連接在一起的形式利用兩個或三個或三個以上免疫原性部分。用于本發明的瘧原蟲抗原多肽可以包括全長瘧原蟲多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。當無論單獨還是以融合蛋白形式利用瘧原蟲蛋白質的部分時，所述部分都保留免疫活性(例如與抗瘧原蟲抗體的交叉反應性)。本發明涵蓋認識到Pfs25多肽、PfdSg 肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽是產生疫苗中所關注的抗原。因此，本發明提供表達異源蛋白質(例如瘧原蟲抗原多肽，諸如瘧原蟲蛋白質或其免疫原性部分，或包含瘧原蟲蛋白質或其免疫原性部分的融合蛋白)的植物細胞和植物。本發明的異源蛋白質可以包含所關注的任何瘧原蟲抗原多肽，包括(但不限于)Pfs25 多肽、PfdS多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽、其部分、其免疫原性部分、其融合物和/或其組合。所屬領域中已知多種不同瘧原蟲Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/ 或Pfs230多肽(例如來自不同物種和/或品系)的氨基酸序列且其可在諸如基因庫 (GenBank)等公共數據庫中獲得。圖1中提供多種瘧原蟲屬物種和/或品系的Pfs25多肽、 Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽的例示性全長蛋白質序列。
18
在某些實施例中，本發明的疫苗組合物中利用全長Pfs25。在一些實施例中，可使用Pfs25的一個或一個以上結構域。在某些實施例中，以一個或一個以上單獨多肽形式或以在一個或一個以上融合多肽中連接在一起的形式利用兩個或三個或三個以上結構域。圖 1中呈示例示性Pfs25多肽的序列。在某些實施例中，本發明的疫苗抗原中利用全長PfdS抗原。在一些實施例中，可使用PfdS的結構域。在某些實施例中，兩個或三個或三個以上結構域可用作本發明的抗原。某些例示性實施例提供包含全長PfdS但缺乏跨膜錨定肽序列的瘧原蟲抗原多肽。圖 1中呈示例示性Pfs28多肽的序列。在某些實施例中，本發明的疫苗抗原中利用全長PfS48/45抗原。在一些實施例中，可使用Pfs48/45的結構域。在某些實施例中，兩個或三個或三個以上結構域可用作本發明的抗原。某些例示性實施例提供包含全長Pfs48/45但缺乏跨膜錨定肽序列的瘧原蟲抗原多肽。圖1中呈示例示性Pfs48/45多肽的序列。在某些實施例中，本發明的疫苗抗原中利用全長Pfs230抗原。在一些實施例中， 使用Pfs230的結構域。在某些實施例中，在本發明的抗原中提供兩個或三個或三個以上結構域。某些例示性實施例提供包含全長Pfs230的瘧原蟲抗原多肽。圖1中呈示例示性 Pfs230多肽的序列。還提供融合蛋白。融合物可包括經修飾的SEQ ID NO :40的地衣多糖酶B序列。 融合蛋白的實例展示于圖M中；對應于瘧原蟲多肽或其部分的氨基酸序列加有下劃線。融合蛋白可為具有以下任一者的氨基酸序列的多肽SEQ ID N0:152、1M、156、158、160、162、 164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、 202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 M2、M4、M6、M8、250、252和254。在一些實施例中，融合蛋白可為與以下任一者的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列一致性的多肽SEQ ID NO :152、 154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、 192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、 232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。在一些實施例中，融合蛋白構筑體可包括其它序列，例如前導序列和/或His/ KDEL標簽。包含前導序列(斜體)和His/KDEL標簽的融合蛋白構筑體的實例展示于表 24中且可包括具有以下氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :44、46、48、50、52、54、57、59、61、 62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、97、99、101、103、105、107、109、 111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147 和 149。另外，范例提供若干種可用于本發明的其它瘧原蟲多肽序列。雖然本文提供例示性瘧原蟲抗原多肽的序列，但應了解可使用具有Pfs25多肽、 Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽的免疫原性特征的任何序列。在一些實施例中，用于本發明的瘧原蟲抗原多肽具有如下氨基酸序列與選自圖1中所示的任何序列的序列約60%—致、約70%—致、約80%—致、約85%—致、約90%—致、約91%—致、約 92%一致、約93%一致、約94%一致、約95%一致、約96%一致、約97%一致、約98%一致、 約99%—致或100%—致。在一些實施例中，所述瘧原蟲抗原多肽保留免疫原性活性。
在一些實施例中，用于本發明的瘧原蟲抗原多肽具有包含選自圖1中所示的任何序列的序列的約50個至約700個連續氨基酸的氨基酸序列。在一些實施例中，瘧原蟲抗原多肽具有如下氨基酸序列與具有選自圖1中所示的任何序列的序列的約100個氨基酸的連續段約60 % —致、約70 % —致、約80 % —致、約85 % —致、約90 % —致、約91 % —致、約 92%一致、約93% —致、約94% —致、約95% —致、約96% —致、約97% —致、約98% —致、 約99%—致或100%—致。在一些實施例中，用于本發明的瘧原蟲抗原多肽具有如下氨基酸序列包含選自圖1中所示的任何序列的序列的約150個、約200個、約250個、約300個、約350個、約400 個、約450個、約500個、約550個或更多個連續氨基酸。在一些實施例中，瘧原蟲抗原多肽具有如下氨基酸序列與具有選自圖1中所示的任何序列的序列的約150個、200個、250 個、300個、350個或更多個氨基酸的連續段約60%—致、約70%—致、約80%—致、約85% 一致、約90%—致、約91%—致、約92%—致、約93%—致、約94%—致、約95%—致、約 96%—致、約97%—致、約98%—致、約99%—致或100%—致。舉例來說，與瘧原蟲抗原多肽具有足夠一致性且保留免疫原性特征的序列能夠同與本文所提供的一種或一種以上抗原反應的抗體結合。免疫原性特征常常包括相關氨基酸或側基的三維呈現。所屬領域的技術人員可容易地鑒別在序列上具有適度差異的序列(例如在邊界和/或某些序列替代物中具有差異，然而仍保留免疫原性特征)。在一些實施例中，可從瘧原蟲多肽中刪去圖1中所示的任何例示性序列的特定部分和/或結構域。舉例來說，？作251作觀和？作48/45多肽通常含有跨膜錨定序列。本發明涵蓋刪去跨膜錨定序列的Pfs25、Pfs28和Pfs48/45多肽。我們已利用來自如本文所詳述的特定物種的瘧原蟲屬寄生蟲的特定序列作為例示性抗原。存在各種物種的瘧原蟲屬寄生蟲且當新亞型出現時，其可被持續鑒別出。所屬領域的技術人員應了解，本文所提供的方法和組合物可適合于利用其它物種的序列。本文所提供的方法和組合物涵蓋和包涵所述變化。瘧原蟲多肽與熱穩定性蛋白質的融合物在某些方面，提供包含融合多肽的瘧原蟲抗原多肽，所述融合多肽包含瘧原蟲蛋白質(或其部分或變異體)可操作地連接于熱穩定性蛋白質。本發明融合多肽可在所屬領域中已知的任何可用表達系統中制備。在某些實施例中，本發明融合蛋白是在植物或其部分(例如植物、植物細胞、根、芽等)中制備。人類或動物細胞中未天然發現的酶或其它蛋白質尤其適合用于本發明的融合多肽中。當融合時賦予融合產物熱穩定性的熱穩定性蛋白質是適用的。熱穩定性允許所產生的蛋白質保持構形，且將所產生的蛋白質保持在室溫下。這一特征有利于以容易、節省時間和節省成本的方式回收融合多肽。適用于本發明的熱穩定性酶的代表性家族為葡聚糖水解酶家族。這些酶特異性裂解混合連接型多糖中與1，3-β鍵聯相鄰的1，4-β糖苷鍵(漢(Hahn)等人，1994 美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA), 91 :10417 ； 以引用的方式并入本文中)。這些酶發現于諸如燕麥和大麥等谷物中，而且也在包括熱纖梭菌(C. thermocellum)等許多真菌和細菌物種中發現(金科瓦(Goldenkova)等人，2002， 分子生物學(Mol. Biol. )36:698;以引用的方式并入本文中)。因此，用于本發明的融合多肽中的所需熱穩定性蛋白質包括糖苷酶。例示性熱穩定性糖苷酶蛋白質包括由選自表1中所示的基因庫保藏編號的基因庫保藏編號表示的蛋白質，各自內容是通過完全并入各參考編號的基因庫保藏信息以引用的方式并入本文中。用于本發明的融合蛋白中的例示性熱穩定性酶包括熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)P^716、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodthermus marinus)P45798，其各自以引用其基因庫保藏編號的方式并入本文中。代表性融合蛋白利用經修飾的從熱纖梭菌分離的熱穩定性酶，然而，根據本發明可類似地利用任何熱穩定性蛋白質。例示性熱穩定性糖苷酶蛋白質列于表1中表1 熱穩定性糖苷酶蛋白質
權利要求
1.一種分離的融合蛋白，其包含熱穩定性蛋白質和瘧原蟲(Plasmodium)多肽，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予個體時誘導或增強針對所述瘧原蟲多肽的免疫反應。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其中所述熱穩定性蛋白質為地衣多糖酶 (Iichenase)多月太。
3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽為與SEQID N0:40具有至少90%序列一致性的經修飾的地衣多糖酶B多肽。
4.根據權利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽與SEQID NO :40具有至少95%的序列一致性。
5.根據權利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽與SEQID NO :40具有至少98%的序列一致性。
6.根據權利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽與SEQID NO :40具有至少99%的序列一致性。
7.根據權利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽具有SEQID N0:40的氨基酸序列。
8.根據權利要求1至7中任一權利要求所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽為 Pfs25多肽，其中所述Pfs25多肽與SEQ ID NO 42具有至少90%的序列一致性。
9.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID N0:42具有至少 95%的序列一致性。
10.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID N0:42具有至少 98%的序列一致性。
11.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID N0:42具有至少 99%的序列一致性。
12.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
13.根據權利要求1至7中任一權利要求所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽為與 SEQ ID NO 55具有至少90%序列一致性的Pfs^多肽。
14.根據權利要求13所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :55具有至少95%的序列一致性。
15.根據權利要求13所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :55具有至少98%的序列一致性。
16.根據權利要求13所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :55具有至少99%的序列一致性。
17.根據權利要求13所述的融合蛋白，其中所述PfdSg肽具有SEQID NO :55的氨基酸序列。
18.根據權利要求1至7中任一權利要求所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽為 Pfs48/45多肽，其中所述Pfs48/65多肽為與SEQ ID NO 62具有至少90%序列一致性的多肽。
19.根據權利要求18所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :62具有至少95%的序列一致性。
20.根據權利要求18所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :62具有至少98%的序列一致性。
21.根據權利要求18所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :62具有至少99%的序列一致性。
22.根據權利要求18所述的融合蛋白，其中所述Pfs48/45多肽具有SEQID NO :62的氨基酸序列。
23.根據權利要求1至7中任一權利要求所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽為 Pfs230多肽，其中所述Pfs230多肽與SEQ ID NO 95具有至少90%的序列一致性。
24.根據權利要求23所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :95具有至少95%的序列一致性。
25.根據權利要求23所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :95具有至少98%的序列一致性。
26.根據權利要求23所述的融合蛋白，其中所述瘧原蟲多肽與SEQID NO :95具有至少99%的序列一致性。
27.根據權利要求23所述的融合蛋白，其中所述Pfs230多肽具有SEQID NO :95的氨基酸序列。
28.一種融合蛋白，其包含與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少90%的序列一致性的多肽:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、 176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、 214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。
29.根據權利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性=SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
30.根據權利要求觀所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少98%的序列一致性=SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
31.根據權利要求觀所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白與選自由以下組成的群組的氨基酸序列具有至少 99% 的序列一致性=SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
32.根據權利要求觀所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有選自由以下組成的群組的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、·176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、 214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。
33.一種核酸，其包含編碼根據權利要求1至32中任一權利要求所述的融合蛋白的序列。
34.一種表達載體，其包含根據權利要求33所述的核酸。
35.根據權利要求34所述的表達載體，其進一步包含前導序列。
36.根據權利要求34或35所述的表達載體，其中所述表達載體為農桿菌質粒 (Agrobacterial plasmid)、植物病毒載體或克隆到農桿菌質粒中的植物病毒載體。
37.一種宿主細胞，其包含根據權利要求34至36中任一權利要求所述的表達載體。
38.根據權利要求37所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為植物細胞。
39.一種植物，其包含根據權利要求38所述的植物細胞。
40.一種醫藥組合物，其包含根據權利要求1至32中任一權利要求所述的融合蛋白和醫藥學上可接受的載劑或賦形劑。
41.一種在個體中誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含向所述個體投予有效量的根據權利要求40所述的醫藥組合物。
42.一種產生根據權利要求1至32中任一權利要求所述的融合蛋白的方法，所述方法包含(a)提供包含編碼所述融合蛋白的核酸的核酸構筑體；(b)將所述核酸構筑體引入植物細胞中；和(c)在允許表達所述融合蛋白的條件下維持所述細胞。
43.一種制備誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的組合物的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含a)在植物中產生根據權利要求1至32中任一權利要求所述的融合蛋白；b)分離所述融合蛋白；和c)將步驟(b)的所述融合蛋白與醫藥學上可接受的載劑組合。
44.一種制備誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的組合物的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含a)在植物中產生所述瘧原蟲多肽；b)分離所述多肽；和c)將所述多肽與醫藥學上可接受的載劑組合。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25多肽，其中所述Pf s25 多肽為與SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
47.根據權利要求44所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為PfdS多肽，其中所述PfdS 多肽為與SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述PfdSg肽具有SEQID NO :55的氨基酸序列。
49.根據權利要求44所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs48/45多肽，其中所述 Pfs48/45多肽為與SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。
50.根據權利要求49所述的方法，其中所述PfS48/45多肽具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列。
51.根據權利要求44所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs230多肽，其中所述 Pfs230多肽為與SEQ ID NO 95具有至少90%序列一致性的多肽。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQ ID NO :95的氨基酸序列。
53.根據權利要求42至52中任一權利要求所述的方法，其中所述植物短暫表達所述多肽或融合蛋白。
54.根據權利要求53所述的方法，其中所述短暫表達是來自農桿菌質粒、植物病毒載體或克隆到農桿菌質粒中的植物病毒載體。
55.根據權利要求42至52中任一權利要求所述的方法，其中所述植物是所述多肽的轉基因植物。
56.根據權利要求43至55中任一權利要求所述的方法，其進一步包含將所述組合物與至少一種佐劑組合。
57.根據權利要求56所述的方法，其中所述佐劑是選自由以下組成的群組明礬、Quil A、QS21、氫氧化鋁、磷酸鋁、礦物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund' s adjuvant)、完全弗氏佐齊[J (complete Freund ‘ s adjuvant)、招膠(alhydrogel)、3 去-0-酰化單磷?；|A(3D-MPL)、脂質Α、百日咳桿菌(Bortadella pertussis)、結核分 feff (Mycobacterium tuberculosis)齊[J 65 (Merck Adjuvant 65)、_gji、^|_ 顆粒(virosome)、SBAS2、SBASl、AS03 和未甲基化 CpG 序列。
58.一種產生瘧原蟲多肽的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或 Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含(a)提供包含編碼所述瘧原蟲多肽的核酸的核酸構筑體；(b)將所述核酸構筑體引入植物細胞中；和(c)在允許表達所述融合蛋白的條件下維持所述細胞。
59.根據權利要求58所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs25多肽，其中所述Pf s25 多肽為與SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。
60.根據權利要求59所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
61.根據權利要求58所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為PfdS多肽，其中所述PfdS 多肽為與SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述Pfs28多肽具有SEQ ID NO :55的氨基酸序列。
63.根據權利要求58所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs48/45多肽，其中所述 Pfs48/45多肽為與SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。
64.根據權利要求63所述的方法，其中所述PfS48/45多肽具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列。
65.根據權利要求58所述的方法，其中所述瘧原蟲多肽為Pfs230多肽，其中所述 Pfs230多肽為與SEQ ID NO 95具有至少90%序列一致性的多肽。
66.根據權利要求65所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQID NO 95的氨基酸序列。
67.根據權利要求38、39或42至66中任一權利要求所述的方法，其中所述植物是來自選自由以下組成的群組的屬蕓苔屬(Brassica)、煙草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、西紅棉屬(Lycopersicon)、^jp 屬(Solanum)、番椒屬(Capsium)、古月蘿卜屬(Daucus)、旱芹屬(Apium)、萵苣屬(Lactuca)、芥子屬(Sinapis)或擬南芥屬 (Arabidopsis)。
68.根據權利要求38、39或42至66中任一權利要求所述的方法，其中所述植物是來自選自由以下組成的群組的物種本塞姆氏煙草(Nicotima benthamima)、埃塞俄比 M^f (Brassica carinata) λ^f^ (Brassica juncea) λ 1^^11 (Brassica napus) λS^f (Brassica nigra) λ(Brassica oleraceae) λ^Ρ^ ^Ρ (Brassica tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)禾口蘿卜(Raphanus sativus)。
69.根據權利要求38、39或42至66中任一權利要求所述的方法，其中所述植物是選自由以下組成的群組紫花苜蓿(alfalfa)、蘿卜(radish)、芥菜(mustard)、綠豆(mung bean)、西蘭花(broccoli)、/K 田序(watercress)、大豆(soybean)、小麥(wheat)、向日葵 (sunflower)、卷心菜(cabbage)、三葉草(clover)、矮牽牛(petunia)、西紅棉(tomato)、馬(potato)(tobacco) ^ (spinach)禾口/j、j^_M (lentil)。
70.根據權利要求38、39或42至66中任一權利要求所述的方法，其中所述植物為發芽的籽苗。
71.根據權利要求43至70中任一權利要求所述的方法，其中通過根據權利要求58所述的方法來進行步驟(a)。
72.—種植物細胞，其是通過根據權利要求58至71中任一權利要求所述的方法產生的。
73.一種植物，其包含根據權利要求72所述的植物細胞。
74.一種在個體中誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的方法，所述方法包含向個體投予通過根據權利要求42、58至73中任一權利要求所述的方法產生的植物或植物細胞。
75.—種在個體中誘導或增強針對瘧原蟲多肽的免疫反應的方法，所述方法包含向所述個體投予治療有效量的通過根據權利要求43至55中任一權利要求所述的方法產生的組合物。
76.根據權利要求41或75所述的方法，其中經口、鼻內、皮下、靜脈內、腹膜內或肌肉內投予所述組合物。
77.根據權利要求41、74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述個體為人類。
78.根據權利要求41、74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述個體為非人類靈長類動物、鳥類或嚙齒動物。
79.一種保護個體群體免受瘧原蟲感染的方法，所述方法包含向個體投予有效量的根據權利要求40所述的組合物。
80.一種減少瘧原蟲在個體群體中傳播的方法，所述方法包含向一個或一個以上個體投予有效量的根據權利要求40所述的組合物。
81.一種減少瘧原蟲傳播到處于瘧原蟲感染風險中的群體中的個體的方法，所述方法包含向所述群體中的一個或一個以上個體投予有效量的根據權利要求40所述的組合物。
82.—種減少瘧原蟲從個體傳播的方法，所述方法包含向所述個體投予有效量的根據權利要求40所述的組合物。
83.根據權利要求79至82中任一權利要求所述的方法，其中所述個體為人類。
84.根據權利要求79至82中任一權利要求所述的方法，其中所述個體為非人類靈長類動物、鳥類或嚙齒動物。
全文摘要
本發明涉及免疫學和蛋白質工程改造的交叉領域，且具體來說涉及適用于預防瘧原蟲屬(Plasmodium)寄生蟲感染的抗原和疫苗。提供重組蛋白抗原、組合物和在植物中產生所述抗原的方法。在一些實施例中，瘧原蟲抗原包括Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽、Pfs230多肽和/或其組合。
文檔編號C12N15/82GK102227444SQ200980147667
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月28日 優先權日2008年9月28日
發明者克里斯蒂娜·E·法蘭斯, 康斯坦丁·穆西丘克, 瓦季姆·梅特, 維達季·尤西波夫 申請人:美國弗勞恩霍夫股份有限公司