專利名稱：一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法
技術領域：
本發明涉及胚胎干細胞的生物技術，采用機械剝離和無血清分離培養技術，為轉 基因綿羊的生產提供堅實的技術平臺。
背景技術：
胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)，是由哺乳動物著床前囊胚期內細胞團 (inner cell mass, ICM)，經體外特定培養環境選擇、適應后，獲得的具有保持未分化狀態 和無限增殖能力的細胞系，其特定的生物學特性能夠使其與ICM重新整合，并參與到胚胎 發育的全部過程中。采用ESC克隆技術，其整合效率遠遠高于傳統核移植技術，可在短期內 生產較多的具有遺傳同質性的動物，免去后裔測定，大幅度提高良種家畜的繁殖效率。同時 利用ESC細胞生產轉基因家畜，將會大幅度提高飼料轉化率，促進動物生長，提高畜產品產 量，并可在細胞水平對家畜胚胎進行性別、多胎、產肉、產毛性能的早期選擇，縮短家畜育種 時間。目前，國內外在綿羊ESC的研究中，普遍采用常規分離培養體系，借助小鼠胚胎干 細胞(Mouse Embryonic Stem Cell, mESC)、人胚胎干細胞(HumanEmbryonic Stem Cell, hESC)的成功經驗，將影響mESC、hESC增殖、分化的因素，如飼養層細胞、條件培養基、細 胞因子、生長因子、激素、胎牛血清和血清提取物等進行有機組合，依照mESC、hESC建系標 準，直接應用到綿羊ESC建系研究中，但截止目前為止，綿羊ESC研究尚未獲得實質性突 破，普遍存在建系效率低下等問題，且最高僅獲得了第8代ESC。關于綿羊胚胎干細胞的 相關研究及所獲ESC代數報道檢索有①白昌明.生物工程學報.2008《不同培養體系對 綿羊類胚胎干細胞分離、傳代的影響》oESC最高代數P8 ；②Zhu，Sun etal. Zygote. 2007 ((Ovine (Ovis aries)blastula from an in vitro productionsystem and isolation of primary embryonic stem cells〉〉oESC 最高代數 P3 ；③ Dattena，Chessa et al.Mol Reprod Dev. 2006《solation，culture，andcharacterization of embryonic cell lines from vitrified sheepblastocysts》oESC 最高代數 P5 ；④ Talbot，Rexroad et al.Mol Reprod Dev. 1993 ((Alkaline phosphatase staining of pig and sheep epiblast cells inculture》oESC 最高代數 PO ；⑤ Handyside, Hooper et al. Development Genesand Evolution.1987 《Towards the isolation of embryonal stem cell linesfrom the she印》oESC最高代數PI。這些都極大制約了 ESC技術在綿羊遺傳育種中的研究與應用。 本發明以此為切入點，結合目前國內外ESC研究最新趨勢，采用機械剝離和無血清分離培 養方法，具有較強的科學性、實踐性及應用價值。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于綿羊胚胎干細胞(ESC)的機械剝離和無血清分 離培養技術，使得綿羊ESC原代集落形成率提高至33% (14/42)，體外培養可傳至16代，拓 展了 ESC研究領域。
本發明的目的是這樣實現的一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法， 將體外培養的綿羊囊胚，采用Tyrode's Solution去除透明帶后，接種于自制的綿羊胚胎干 細胞無血清培養液中；用針頭固定內細胞團，置于38.6°C、5% CO2飽和濕度條件下培養，培 養中每48小時半量更換培養液，pH為6. 8-7. 2，原代培養7-9天；之后每3_4天采用常規機 械法按1 2-1 4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養可傳至16代。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，無血清培養液的配制D-MEM/ F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10μ L/mL Ν2+20 μ L/mL Β27+10 μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mM β -Mercaptoethanol。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，采用32號針頭將裸胚固定于培 養皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內細胞團，以最大限度的將裸胚滋養層細胞剝離。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，裸胚接種數量因以45-60枚/組為宜。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，該方法能使綿羊的胚胎干細胞原 代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，藥劑的選用均為市售產品。本發明研究機理包括綿羊囊胚原代接種與綿羊ESC無血清培養的兩項技術環節綿羊囊胚原代接種傳統綿羊囊胚內細胞團的分離，主要采用免疫外科手術法及 酶法等實驗手段剝離囊胚滋養層細胞，但由于囊胚經過長時間的免疫反應及酶處理操作 后，用于綿羊ESC建系的內細胞團，不同程度的受到了外源機械損傷，從而影響了后期綿羊 ESC的建系效率；并且無法根本性解決囊胚內細胞團貼壁的關鍵技術問題，而這就最終導 致綿羊ESC原代集落形成率較低。本發明從導致綿羊ESC原代建系效率低主要誘因出發， 經過大量實驗室驗證發現，采用32號注射器針頭，將去除透明帶的裸胚固定于培養皿底部 (同時應盡量避免損傷囊胚內細胞團，及最大限度的將裸胚滋養層細胞剝離)，能顯著改善 綿羊囊胚內細胞團在無飼養層、無血清培養體系下的原代克隆形成率，該體系下其綿羊ESC 原代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。綿羊ESC無血清培養體系的建立結合國際最新ESC研究趨勢，采用無血清培養 體系，參考小鼠胚胎干細胞(Mouse Embryonic Stem Cell, mESC)、人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cell,hESC)的全能性維持機制，將影響mESC、hESC增殖、分化的因素進行 分類與組合，先后從維持小鼠、人胚胎干細胞全能性的關鍵信號調控通路LIF-STAT3途徑、 MAPK-ERK途徑、FGF途徑、Wnt途徑入手，對原代獲得的綿羊ESC集落從2種培養液(DMEM/ F12,KnockOut DMEM)、4 種主添加成分(FBS、Serum R印lacement、N2、B27)、4 種小分子化合 物(SU5402、PD0325901、CHIR99021)、4 種添加因子(mLIF、hLIF、bFGF、EGF)進行了大量優 化組合試驗，累計使用綿羊體外囊胚2100多枚。研究發現，當添加bFGF，激活FGF途徑時 (圖IbFGF組)，能顯著促進綿羊ESC的自我更新，此時綿羊ESC倍增時間為2. 0天；與之相 反，加入FGF受體抑制劑，阻斷FGF途徑時(圖ISU組)，綿羊ESC體外倍增時間延長為3. 7 天，自我更新受到明顯抑制，因此篩選對比后，所得結論為綿羊ESC自我更新的調控途徑為 FGF途徑，這也為進一步建立綿羊ESC無血清培養體系提供了科學依據。其次，我們又對綿羊ESC無血清培養體系中，bFGF的添加量進行了一系列對比試 驗。研究發現，該無血清培養體系下，綿羊ESC對bFGF的添加量存在量性需求(見圖2)當添加10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL bFGF時，綿羊ESC自我更新有所改善，高于對照組(見 圖2)；當bFGF添加量提高至80ng/mL、100ng/mL時，綿羊ESC自我更新進一步得到顯著提 高，且二者效果相當(見圖2)。因此我們認為該無血清培養體系下，bFGF的最佳添加量應 在 80ng/mLo本發明的技術效果(1)用于綿羊ESC建系研究的體外培養囊胚，應以A級囊胚(內細胞團大、且明顯) 為宜；B級、C級囊胚不易形成原代集落，且原代集落形成率偏低；采用Tyrode’ s Solution 去除透明帶的時間尤為重要，應時刻觀察透明帶的變形程度；處理時間長，易導致囊胚腔塌 陷，為后續機械法剝離滋養層細胞造成一定難度；(2)裸胚接種數量因以45-60枚/組左右為宜；接種數量過低，會因旁分泌途徑缺 失，導致綿羊ESC原代集落形成率偏低；(3)原代接種后，應隔日觀察內細胞團生長情況，并及時采用32號針頭剝離接種 過程中殘留的滋養層細胞；殘留的滋養層細胞，其生長優勢遠遠高于內細胞團中的細胞，滋 養層細胞過度增殖是導致原代集落形成率偏低，及培養液極易偏酸的主要誘因；(4)原代接種后，每48小時須半量更換ESC培養液；及時更換培養液，能有效將培 養體系pH維持在6. 8-7. 2之間，對綿羊ESC長期增殖具有十分重要的作用；(5)每次胚胎干細胞體外操作時間不宜過長；時間過長，對綿羊ESC長期增殖具有 不可逆的損傷作用。本發明以提高綿羊囊胚內細胞團原代集落形成率及篩選綿羊ESC自我更新的關 鍵調控因子為突破口，通過精心設計與方法實踐，采用機械剝離和無血清分離培養技術，使 得綿羊ESC原代集落形成率達33 % (14/42)，體外培養可傳至16代，該研究成果為通過ESC 技術生產轉基因綿羊提供了堅實有力的技術平臺，拓展了 ESC研究領域，彰顯技術進步。


下面將結合附圖對本發明作進一步說明。附圖1為不同信號通路對綿羊ESC維持自我更新的效果生長圖；如圖，所示Control——對照組，基礎培養液；bFGF——基礎培養液中加入bFGF，激活FGF途徑；SU——基礎培養液中加入SU5402，抑制FGF途徑；hLIF、mLIF——基礎培養液中加入hLIF、mLIF,激活LIF-STAT3途徑；PD——基礎培養液中加入PD0325901，抑制ERK途徑。附圖2為bFGF途徑對綿羊ESC自我更新效果生長圖；附圖3為綿羊ESC原代接種7天的放大顯微片(40x)；附圖4為綿羊ESC原代接種7天的放大顯微片(IOOx)；附圖5為綿羊ESC接種9天的第1代的放大顯微片(IOOx)；附圖6為綿羊ESC接種12天的第2代的放大顯微片(IOOx)；附圖7為綿羊ESC接種19天的第5代的放大顯微片(IOOx)；附圖8為綿羊ESC接種30天的第8代的放大顯微片(IOOx)；
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附圖9為綿羊ESC接種35天的第10代放大顯微片(IOOx)；附圖10為綿羊ESC接種54天的第16代的放大顯微片(IOOx)；附圖11為綿羊第9代ESC堿性磷酸酶活性檢測片，紅色為陽性(IOOx)；附圖12為綿羊第14代ESC堿性磷酸酶活性檢測片，紅色為陽性(IOOx)。
具體實施例方式下面將結合實例就發明進一步的說明。實施例分離培養方法步驟收集綿羊體外培養獲得的囊胚42枚，采用Tyrode'sSolution 去除透明帶后，將裸胚接種于該發明所提供的綿羊ESC無血清培養液中，并采用32號針 頭將裸胚固定于培養皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內細胞團，及最大限度的將裸胚滋 養層細胞剝離，之后置于38. 6°C、5 % CO2飽和濕度條件下培養，原代培養時間7天(見 圖3、4原代集落)，之后每4天采用常規機械法按1 2-1 4傳代一次，培養期間每48 小時半量更換培養液。并對獲得的第9代、第14代綿羊ESC進行常規堿性磷酸酶染色， 對其體外長期培養過程中干細胞特性是否丟失加以判定(具體檢測方法見Leukocyte AlkalinePhosphatase Kit 說明，紅色為陽性)。試劑的配制D-MEM/F-12 (I η ν i tr ο gen , 1 1 3 2 00 3 3) , bFGF (Sigma, F0291-25UG), N2Supplement(Invitrogen,17502048)， B27 Supplement (Invitrogen,17504044)， CHIR99021(Stemolecule,04-0004)， NEAA(Invitrogen,11140050)， L-Glutamine(Sigma, G8540-100G), β -Mercaptoethanol(Amresco,0482-100ml), Tyrode' s Solution(Sigma, T1788-100ML), Leukocyte AlkalinePhosphatase Kit (Sigma，86R)。(上述試劑均為市售 產品)綿羊ESC 培養液D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10 μ L/ mLN2+20μ L/mL Β27+10μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mMβ -Mercaptoethanol。實驗結果原代接種7天后，分離原代集落14枚，原代集落形成率33% (14/33)(見圖3、4原 代集落)；采用綿羊ESC無血清培養液培養9天、12天、19天、30天、35天、54天后獲得第1、 2、5、8、10、16代綿羊ESC細胞(見圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10)；對獲得的第9代、第14 代綿羊ESC進行常規堿性磷酸酶染色，檢測結果為強陽性(見圖11、圖12)，表明該無血清 培養體系下，長期培養獲得的細胞堿性磷酸酶活性較高，細胞具備胚胎干細胞的典型特征。
權利要求
一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于將體外培養的綿羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明帶后，接種于自制的綿羊胚胎干細胞無血清培養液中；用針頭固定內細胞團，置于38.6℃、5％CO2飽和濕度條件下培養，培養中每48小時半量更換培養液，pH為6.8 7.2，原代培養7 9天；之后每3 4天采用常規機械法按1∶2 1∶4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養可傳至16代。
2.按照權利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于無 血清培養液的配制D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10 μ L/mL Ν2+20 μ L/mL Β27+10 μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mM β-Mercaptoethanol。
3.按照權利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于采用 32號針頭將裸胚固定于培養皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內細胞團，以最大限度的將 裸胚滋養層細胞剝離。
4.按照權利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于裸胚 接種數量因以45-60枚/組為宜。
5.按照權利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于該方 法能使綿羊的胚胎干細胞原代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。
6.按照權利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，其特征在于藥劑 的選用均為市售產品。
全文摘要
本發明提供的一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養方法，將體外培養的綿羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明帶后，接種于綿羊胚胎干細胞無血清培養液中，并用針頭固定，置于38.6℃、5％CO2飽和濕度條件下培養，培養中每48小時半量更換培養液，pH為6.8-7.2，原代培養7-9天；之后每3-4天采用常規機械法按1∶2-1∶4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養可傳至16代。綿羊胚胎干細胞無血清培養液的配制D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3μMCHIR99021+10μL/mL N2+20μL/mL B27+10μL/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0.2mM β-Mercaptoethanol。使用32號針頭將裸胚固定于培養皿底部，避免損傷囊胚內細胞團并將裸胚滋養層細胞剝離。裸胚接種數量因以45-60枚/組為宜。該方法能使綿羊的胚胎干細胞原代集落形成率提高至33％(14/42)。
文檔編號C12N5/0735GK101914487SQ20101010010
公開日2010年12月15日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者林嘉鵬, 汪立芹, 趙云程, 陳世彬, 陳童, 黃俊成 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國—澳大利亞綿羊育種研究中心