專利名稱：一種高效分離禽類胚胎干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及胚胎干細胞的分離技術領域，特別涉及一種高效分離禽類胚胎干細胞的方法。
背景技術：
胚胎干細胞是能夠長期增殖而不分化，可以在一定條件下分化為多種成體功能細胞的原始種子細胞。胚胎干細胞在適宜的生長條件下可以快速的增殖，人類胚胎干細胞的倍增時間大約為24小時，小鼠的胚胎干細胞的倍增時間更快，一般小于24小時。近年來以人類為代表的哺乳類胚胎干細胞技術發展迅速，其培養體系也逐漸由含血清非定量結合飼養層的培養體系向不含血清全定量無飼養層培養體系轉化，干細胞的培養朝可工業化生產的方向發展，即通過干細胞的無限增殖機能，在體外通過工業化手段大量的生產干細胞，然后運用蛋白，激素等化學物質將干細胞定向分化為功能細胞如神經細胞，心肌細胞等。現在已有研究表明，在體外將胚胎干細胞定向分化成的神經細胞注入神經受損的小鼠中可以明顯的改善神經損傷小鼠的運動機能，這為治療人類神經退行性疾病如帕金森氏癥和老年癡呆帶來了現實可能，美日等國家利用化學小分子誘導胚胎干細胞可以高效的定向分化為具有與自然心肌細胞相似電生理等功能指標的再生心肌細胞，現在正在結合生物材料向體外構建人工心臟的方向努力。與哺乳類動物胚胎干細胞研究應用于組織再生，器官重建等治療性目的不同，禽類胚胎干細胞的研究相對滯后，分離培養的胚胎干細胞在體外結合基因工程改造后，利用禽類特有的胚胎發育過程特點，將遺傳改造或修飾后的干細胞重新導入家禽體內制備轉基因嵌合體，利用干細胞可以參與宿主胚胎發育并整合到生殖腺中的特性，可以更快的獲得真正可以穩定遺傳的帶有外源基因片段的轉基因家禽。家禽飼養周期短，可以大量繁育，不斷的提供禽類，禽蛋，利用改造其胚胎干細胞來制備轉基因家禽簡單高效，國外已將雞的胚胎干細胞分離并轉染帶有GFP基因片段質粒，再將改造后的胚胎干細胞通過胚盤注射導入另一只種蛋內，最后成功獲得了可以激發綠色熒光蛋白的轉基因雞。如果將帶有生產干擾素，瘦素基因片段的禽類胚胎干細胞導入雞體內制備轉基因雞則可以源源不斷的提供帶有干擾素或瘦素蛋白的禽肉和禽蛋，這樣可以利用生物反應器生產昂貴的藥物蛋白并達到真正的食療，具有巨大的經濟利益。靈長類胚胎干細胞從單細胞受精卵經體外培養到囊胚階段，然后將囊胚移植到小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，待其貼壁生長4-5天后，通過顯微操作取得囊胚內細胞團細 胞(inner cell mass, ICM)移植到新的小鼠成纖維細胞飼養層上，待其形成單克隆后用顯微注射針劃取8-10個細胞的小團塊進行傳代進一步擴增建系。禽類具有獨特的生殖生理特點使其不能像靈長類動物那樣從單細胞受精卵建胚胎干細胞系，禽類受精卵在排出時就已經是5-6萬個細胞的胚盤(囊胚)了。已有研究將雞的胚盤從種蛋分離出來，將卵黃分離后，將胚盤細胞經胰酶消化后重新鋪到雞胚成纖維細胞飼養層上培養，采用含10%小牛血清和2%雞血清的DMEM高糖培養基分離培養。雖然已有的方法也能分離建立禽類的胚胎干細胞系，但是還存在諸多問題，包括取材方法，消化方法，培養基質亟需改進以提高效率，降低成本和勞動強度，減少血清等不明確因子以提高實驗的準確性和可重復性。現有的將胚盤從種蛋中分離出的方法主要有藥勺法，紙環法和發環法。紙環法在取得胚盤時撕裂胚盤，造成上胚層與下胚層剝離，造成預制液洗滌時丟失大量的上胚層胚胎干細胞；發環法操作極其繁瑣，造成胚胎細胞在體外暴露的時間過長；藥勺法容易引入大量的卵黃，不易分離胚盤，而且這幾種方法均需要準備或制備小物件，在37度的預制液中洗滌胚盤，此過程中容易丟失大量的胚盤細胞，在此過程中，由于溫度的刺激，過早的激活細胞復蘇，在多次洗滌中容易造成胚胎干細胞的應激死亡。已有的方法采用胰酶消化干細胞成單個細胞鋪于飼養層細胞上進行分離培養，這并不符合干細胞培養的發展趨勢，因為胰酶對細胞的消化作用很劇烈，胰酶消化成單細胞培養容易使干細胞發生失巢性死亡(Anoikis)，并且長期使用胰酶會增加干細胞發生化學性畸變的可能性，造成染色體的丟失或損傷。 在培養基質方面，現有方法米用雞胚成纖維飼養層貼壁培養并在培養基中添加10%小牛血清和2%雞血清進行培養，雞胚成纖維細胞飼養層需要提前制備，容易引入不同遺傳背景的細胞影響，由于雞胚成纖維細胞具有批次的差異，血清中含有多種未知成分，其中含有的激素類分子如雌激素(P4)容易導致干細胞的分化，這樣就使所建立的胚胎干細胞系摻雜多種未知和不可控因素，造成實驗的可靠性和可重復性降低，不利于后續的研究和轉基因動物的制備。現有的分離制備禽類干細胞的方法繁瑣復雜，效率低下，存活率低，需要消耗數枚不同遺傳基因的種蛋才能建立，并且可靠性和可重復性存在巨大的疑問，無法定量和準確控制質量，因此，建立一種高效的分離禽類胚胎干細胞的方法顯得尤為重要。

發明內容
本發明的目的是提供一種高效分離禽類胚胎干細胞的方法。本發明所提供的高效分離禽類胚胎干細胞的方法包括以下步驟I)將胚盤細胞從種蛋中取出將種蛋平放，在種蛋赤道面開口，暴露出胚盤，將胚盤周邊卵黃膜剪開后用工具將胚盤細胞取出；2)采用機械方法消化胚盤細胞，清洗胚盤細胞，并去除卵黃；3)將消化清洗后的胚盤細胞進行原代培養；4)從原代培養的胚盤細胞中富集純化胚胎干細胞。其中，步驟I)為將種蛋平放，在種蛋赤道面最高點開口，使胚盤暴露在開窗正下，平置種蛋的最高點，將胚盤上下左右周邊卵黃膜剪開后用工具將胚盤細胞取出。步驟I)中所述工具為移液槍，其帶有剪掉尖端O. 5-lcm的Iml槍頭。所述槍頭為Iml規格，并經過剪去尖端約O. 5-lcm預處理的滅菌槍頭。具體地，步驟I)中將胚盤細胞從種蛋中取出的方法為將種蛋平放，在種蛋赤道面最高點開口，使胚盤暴露在開窗正下，平置種蛋的最高點，將胚盤上下左右周邊卵黃膜剪開，用裝有剪去尖端的滅菌槍頭的移液槍將胚盤整個吸出。所述種蛋為剛出產0-2天的2_6°C條件下保存的種蛋。此時種蛋中的胚胎發育處于X期，此時期形成了具有近6萬個細胞的盤狀囊胚，相當于哺乳動物的囊胚期，含有類似ES細胞的干細胞和能發育成精子和卵子的原始生殖細胞。優選地，所述種蛋為雞的種蛋。步驟I)將胚盤從種蛋中取出的方法與現有的三種方法不同，該步驟要求快速準確的將胚盤取出，在種蛋赤道面最高點開口，利用種蛋自身的結構特點，使胚盤暴露在開窗正下，平置種蛋的最高點，利用眼科剪快速將胚盤上下左右周邊卵黃膜剪開，此時受浮力作用，胚盤仍然定位于種蛋的最高點，利用剪去尖端的槍頭將胚盤整個吸出，簡單快速，不會損失胚盤細胞。該過程要求快速準確。其中，步驟2)中所述機械方法消化胚盤細胞為將取出的胚盤細胞移入裝有預制液的離心管中，用裝有剪去尖端的滅菌槍頭的移液槍 吹打胚盤細胞，將含有胚胎干細胞的上胚層通過機械方法吹散消化為含8-10個細胞的小團塊；所述清洗胚盤細胞的方法為將消化后的細胞懸液離心，將所得的細胞沉淀用預制液重懸，再次離心，將所得的細胞沉淀最后一次用預制液重懸，并轉入離心管中再一次離心，富集胚盤細胞并去除預制液；通過離心去除絕大部分卵黃。具體地，步驟2)中所述機械方法消化胚盤細胞為將取出的胚盤移入裝有預制液的50ml離心管中，用裝有剪去尖端的滅菌槍頭的移液槍吹打胚盤細胞，將含有胚胎干細胞的上胚層通過機械方法吹散消化為含8-10個細胞的小團塊；清洗胚盤細胞的方法為將消化后的細胞懸液于2-6°C，600-1000rpm下離心3_5min，將所得的細胞沉淀在50ml離心管中用預制液重懸，于2-6°C,600-1000rpm下再次離心3_5min,將所得的細胞沉淀再次用預制液重懸，并轉入1. 5ml離心管中于2-6°C，600-1000rpm下再一次離心3-5min,富集胚盤細胞并去除預制液,通過離心去除絕大部分卵黃。所述預制液為預冷至2_6°C的PBS。優選地，所述預制液為預冷至4°C的PBS。所述槍頭為Iml規格，并經過剪去尖端約O. 5-lcm預處理的滅菌槍頭。優選地，所述離心的轉速為800rpm，時間為3min，溫度為4°C。其中，步驟3)中所述原代培養的方法為將由2)獲得的胚盤細胞沉淀用37. 5-38. 5°C預熱的培養基重新懸浮，均勻播種在已有37. 5-38. 5°C預熱培養基的培養皿中，移入37. 5-38. 5°C，5% 二氧化碳細胞培養箱中，培養過夜。優選地，培養基預熱的溫度和培養箱培養的溫度為38°C。其中，所述培養基為無血清干細胞培養基；所述培養皿為對細胞低貼附性培養皿；所述原代培養的方式為不貼壁懸浮培養。所述培養基優選為無血清mTeSRl培養基，培養基中添加Y-27632，其終濃度為10 μ M/ml ο所述培養皿優選為Petri皿。其中，步驟4)將胚胎干細胞富集的方法是收集含有胚盤細胞的培養基，除去貼壁的卵黃顆粒。利用干細胞在懸浮狀態下集聚成團特性，利用細胞篩除去單個細胞(包括死細胞和下胚層細胞)。具體地，步驟4)將胚胎干細胞富集的方法是在24_36h后將收集培養基，殘余的卵黃顆粒貼附在培養皿底壁上，將培養基過細胞篩，去除死細胞和下胚層細胞，將細胞篩反轉，置于另一個培養皿上方，用培養基洗脫，獲得大量的經過富集純化的來源于胚盤上胚層的胚胎干細胞。所述細胞篩為網口大小為35-50 μ m、滅菌后的細胞篩。上述過程可能會有殘留的少量卵黃膜碎塊，可以在體式鏡下用移液槍將其去除；富集純化后的胚胎干細胞可以用于后續的基因轉染操作，并可用于制備轉基因家禽。·
本發明方法在已有方法的基礎上，創新出簡單快速的抽吸法，絕無遺漏地取得完整的胚盤。利用禽類生殖發育的特點，利用2-6°C預冷的PBS洗滌胚盤，并在這一過程中完成胚盤細胞的機械消化，胚胎干細胞在單個細胞狀態下易于凋亡，本發明利用槍頭將含有大量胚胎干細胞的上胚層細胞輕輕吹打成含8-10個細胞的小團塊進行培養，加上2-6°C可以使細胞處于低活性狀態，這樣胚胎干細胞便在半休眠狀態中快速完成了洗滌分離消化，極大地提高了胚胎干細胞的存活率。本發明方法中所用的mTeSRl培養基是無血清成分全已知的商品化培養基，特別適合培養靈長類生物胚胎干細胞，本發明利用其成功的分離培養了非哺乳類禽類胚胎干細胞。本發明的一種高效的分離培養禽類胚胎干細胞的方法具有的有益效果如下( I)本發明在取材，消化方法和培養基質方面進行改進創新，建立一種高效的分離禽類胚胎干細胞的方法，該方法簡單易行，準確有效，可重復性高并且成本低廉，整個分離培養體系中的設備或試劑均可自制或商品化。(2)本發明的方法中無需制備飼養層，無需酶消化及相關處理，無需血清，即使從一枚種蛋中也可分離培養出大約2萬個純化過的胚胎干細胞。(3)本發明的方法可以供體外轉染進行基因改造或表觀修飾，為轉基因家禽的制備夯實了技術基礎，為生物反應器的發展和實現巨大商業化價值安裝了助推加速器，具有極大的科研價值和推廣意義。(4)本發明的方法為禽類的發育研究提供了可靠素材，為轉基因禽類的制備夯實了現實可行的技術基礎。


圖1為雞胚胎干細胞在懸浮條件下形成的干細胞和非干細胞的形態圖；其中A為雞胚胎干細胞在懸浮條件下聚集成團，形成干細胞小球的形態；B為非干細胞的形態；圖2為對所分離雞胚胎干細胞貼壁培養后第二天觀察到的形態及染色結果；其中，Phase contrast為典型干細胞克隆的形態圖；SSEA_1為干細胞的細胞膜染色后的陽性特征圖；DAPI標記的是干細胞的核。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1從一枚剛出產的雞的種蛋中取得全部的胚盤細胞、消化清洗并進行原代
培養1、將用新潔爾滅清洗消毒后的、剛出產0-2天的2_6°C條件下保存的雞的種蛋平放，置于低溫冷藏柜過夜；
2、將平放的種蛋保持位置水平，移入超凈工作臺中，在種蛋赤道面最高點及周圍2-3cm半徑處用酒精棉球消毒；3、在平放的種蛋赤道面最高點用無菌的眼科鑷挑開半徑2cm的窗口，可見其正下方胚盤所在的位置；4、用眼科剪將胚盤上下左右周邊卵黃膜剪開；5、用裝有Iml剪去尖端約O. 5-lcm滅菌槍頭的移液槍對準胚盤,將其吸出，迅速移入裝有40ml預冷至4°C的PBS的50ml離心管中吹打3_5次，將含有胚胎干細胞的上胚層吹散消化為含8-10個細胞的小團塊；6、將離心管上下顛倒3次,4°C、800rpm離心3min ；7、用3ml預冷PBS重懸細胞沉淀，加入37ml預冷PBS ；8、將離心管上下顛倒3次,4°C、800rpm離心3min ；9、用Iml預冷PBS重懸細胞沉淀，移入1. 5ml離心管中；10、4°C、800rpm 離心 3min ;11、用Iml 38 °C預熱的含終濃度為10 μ M/ml Y-27632的無血清mTeSRl培養基重新懸浮細胞沉淀，將懸浮液均勻播種在裝有3ml 38°C預熱的前述無血清mTeSRl培養基的Petri皿中；12、將培養皿前后左右水平晃動2次，輕輕移入38°C，5% 二氧化碳培養箱中，培養過夜。上述過程中，雞胚胎干細胞在懸浮條件下形成的干細胞和非干細胞的形態圖如圖1所示；其中A為雞胚胎干細胞在懸浮條件下聚集成團，形成干細胞小球的形態；B為非干細胞的下胚層細胞形態，非干細胞為單個球形細胞，直徑約為25 μ m，下胚層細胞與單個死 細胞及其他雜質可通過細胞篩一并除去。實施例2從原代培養的胚盤細胞中富集純化胚胎干細胞1、將原代培養24h后的培養皿取出，傾斜30°，使用5ml移液管收集培養基；2、將培養基從網口大小為40 μ m、滅菌的細胞篩濾過，去除死細胞和胚盤下胚層細胞；3、將細胞篩反轉，置于另一枚Petri皿上方，用5ml新鮮的含終濃度為10 μ M/mlY-27632的無血清mTeSRl培養基洗脫，獲得大量的經過富集純化的來源于胚盤上胚層的胚胎干細胞。上述過程可能會有殘留的少量卵黃膜碎塊，可以在體式鏡下用移液槍將其去除；富集純化后的雞胚胎干細胞可以用于后續的基因轉染操作，并可用于制備轉基因雞。實施例3將分離培養的原代雞胚胎干細胞進行SSEA-1和DAPI染色鑒定將分離純化后的雞胚胎干細胞小球轉入普通細胞培養皿中，待其貼壁培養后第二天(24h)，觀察其形態。1、將貼壁的胚胎干細胞樣品在4%多聚甲醛中固定10min，PBS洗兩次，每次5min ；2、加入 O. 3%Ttiton-X1002mL,室溫放置 lOmin，隨后 PBS 洗兩次，每次 5min ；3、樣品在5%BSA中封閉20min，用PBS稀釋一抗(鼠抗SSEA-1IgM)，稀釋比例為1:500，將樣品與一抗室溫孵育lh，隨后PBS洗2次，每次5min ；4、所用二抗為生物素化羊抗小鼠IgM，用PBS按1:100稀釋后，將樣品與二抗室溫孵育30min,隨后PBS洗2次,每次5min ；5,SABC-Cy3用PBS按1:100稀釋，室溫避光，與樣品孵育30min，隨后PBS洗3次，每次5min ；6,DAPI染色DAPI用PBS按1:50稀釋，與樣品室溫孵育lOmin，熒光顯微鏡觀察。如圖2所示，所分離的胚胎干細胞能形成典型的干細胞克隆形態(見Phasecontrast)，使用SSEA-1多能型標志抗體染色，觀察到并顯示細胞膜染色后的陽性特征(見SSEA-1 )，通過DAPI染色來標記胚胎干細胞的核，可見胚胎干細胞克隆中細胞核很密集，所占比重大，符合干細胞核質比高的特征。本發明的高效分離禽類胚胎干細胞的方法除了實施例中雞的種蛋外，同樣適用于其他禽類的種蛋，采用本發明所述的方法均能夠富集純化到所用禽類的胚胎干細胞。
雖然，上文中已經用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種高效分離禽類胚胎干細胞的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 1)將胚盤細胞從種蛋中取出將種蛋平放，在種蛋赤道面開口，暴露出胚盤，將胚盤周邊卵黃膜剪開后用工具將胚盤細胞取出； 2)采用機械方法消化胚盤細胞，清洗胚盤細胞，并去除卵黃； 3)將消化清洗后的胚盤細胞進行原代培養； 4)從原代培養的胚盤細胞中富集純化胚胎干細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中將胚盤細胞從種蛋中取出的方法為將種蛋平放，在種蛋赤道面最高點開口，使胚盤暴露在開窗正下，平置種蛋的最高點，將胚盤上下左右周邊卵黃膜剪開，用裝有剪去尖端的滅菌槍頭的移液槍將胚盤整個吸出。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述機械方法消化胚盤細胞為將取出的胚盤細胞移入裝有預制液的離心管中，用裝有剪去尖端的滅菌槍頭的移液槍吹打胚盤細胞，將含有胚胎干細胞的上胚層通過機械方法吹散消化為含8-10個細胞的小團塊；所述清洗胚盤細胞的方法為將消化后的細胞懸液離心，將所得的細胞沉淀用預制液重懸，再次離心，將所得的細胞沉淀最后一次用預制液重懸，并轉入離心管中再一次離心，富集胚盤細胞并去除預制液；通過離心去除絕大部分卵黃。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述原代培養的方法為將由2)獲得的胚盤細胞沉淀用37. 5-38.5°C預熱的培養基重新懸浮，均勻播種在已有37. 5-38. 5°C預熱培養基的培養皿中，移入37. 5-38. 5°C，5% 二氧化碳細胞培養箱中，培養過夜。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)將胚胎干細胞富集的方法是在24-36h后收集培養基，殘余的卵黃顆粒貼附在培養皿底壁上，將培養基過細胞篩，去除死細胞和下胚層細胞，將細胞篩反轉，置于另一個培養皿上方，用培養基洗脫，獲得大量的經過富集純化的來源于胚盤上胚層的胚胎干細胞。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述種蛋為剛出產0-2天的2-6°C條件下保存的種蛋。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述預制液為預冷至2-6°C的PBS。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述培養基為無血清干細胞培養基；所述培養皿為對細胞低貼附性培養皿；所述原代培養的方式為不貼壁懸浮培養。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養基為無血清mTeSRl培養基，培養基中添加Y-27632，其終濃度為10 μ M/ml ;所述培養皿為Petri皿。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述細胞篩為網口大小為35-50μ m、滅菌后的細胞篩。
全文摘要
本發明涉及一種高效分離禽類胚胎干細胞的方法。該方法包括以下步驟1)將胚盤從種蛋中取出；2)將取出的胚盤消化、清洗并去除卵黃；3)將消化后的胚盤細胞進行原代培養；4)從原代培養的胚盤細胞中富集純化胚胎干細胞。本發明的方法簡單易行，準確有效，可重復性高并且成本低廉，整個分離培養體系中的設備或試劑均可自制或商品化，無需制備飼養層，無需酶消化及相關處理，無需血清，即使從一枚種蛋中也可分離培養出大約2萬個純化過的胚胎干細胞，可以供體外轉染進行基因改造或表觀修飾，為轉基因家禽的制備夯實了技術基礎，為生物反應器的發展和實現巨大商業化價值安裝了助推加速器，具有極大的科研價值和推廣意義。
文檔編號C12N5/0735GK103013909SQ20121051678
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者李贊東, 蔣斌, 燕麗, 張文新, 萬志毅 申請人:中國農業大學