專利名稱：一種硝酸還原酶活性測定新方法
技術領域：
本發明涉及一種植物體內酶活性測定新方法，尤其是植物體內一種硝酸還原酶活 性測定新方法。
背景技術：
硝酸還原酶是植物體內硝態氮代謝的第一個關鍵酶，且硝酸還原酶是一種誘導 酶，即在硝態氮(no3_)存在條件下能夠誘導產生酶活性。植物從土壤中吸收的硝態氮首先 需要經過硝酸還原酶的催化而形成亞硝態氮，亞硝態氮再經過亞硝酸還原酶作用下轉化為 NH4+,然后NH4+在谷胺酰胺合成酶作用下形成氨基酸，進而完成蛋白質的合成。在植物生長 發育過程中，如果硝態氮代謝的第一個關鍵酶硝酸還原酶活性受到外界環境的影響則植物 體內氨基酸和蛋白質的合成就會受到阻礙，從而造成對植物生長發育的嚴重不利影響。因 此，對植物體內硝酸還原酶活性的測定，能正確反應出植物對氮素營養的吸收與代謝能力， 是正確評價外界環境對植物氮代謝影響的一種有效方法。目前已有的關于硝酸還原酶活性 的測定方法可以歸納為兩種一、活體法這種方法是在反應液中加入硝態氮(N03_)，通過測定硝態氮(N03_)被植物體內硝 酸還原酶還原成亞硝態氮的量來反應酶活性的高低。但由于硝酸還原酶是一種誘導酶，其 活性會受到反應液中加入硝態氮(no3_)的誘導而提高，因此這種“活體法”測定硝酸還原酶 的活性不能真實反應植物體內硝酸還原酶活性，只是作為一種相對比較而加以應用。二、離體法這是一種目前正在應用的測定植物體內硝酸還原酶活性真實值的方法。“離體法” 測定植物體內硝酸還原酶活性真實值方法具體步驟是1、反應液配制(1)利用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制0. lmol/L pH7. 5的磷酸緩沖液；(2)配制 0. lmol/L KNO3 磷酸緩沖液；(3)配制NADH2溶液稱取2. Omg NADH2溶于Iml 0. lmol/L的磷酸緩沖液中；(4)配制提取緩沖液25mmol/L的磷酸緩沖液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na2混合液。2、測定方法流程取實驗材料洗凈剪碎，放在研缽中置低溫冰箱冷凍30min。取出 在冰浴中加少量石英砂和提取緩沖液。研磨為勻漿，低溫離心5min(4000r/min)。上清液即 為粗酶提取液。上述操作盡量在冰浴中進行；3、比色取粗酶提取液，加入KNO3磷酸緩沖液和NADH2溶液。在30°C下保溫30min。 保溫后立即加ImL對-氨基苯磺酸溶液終止反應，加ImL α -萘胺溶液，顯色20min，在臺式 離心機上離心lOmin，取上清液在分光光度計上測波長540nm處的光密度值。離體法具有的缺點是(1)需要配制的反應液多(共4種)，所需化學藥品多，價格 貴；(2)測定方法流程復雜、人為造成誤差增大。首先需要低溫冰凍研缽研磨和低溫離心，費工、費時。從研缽中轉移至離心管離心時會造成研磨液的損失造成誤差；(3)比色時仍需 要進一步低溫離心，使測定時間加長，造成人為誤差加大；(4)方法復雜，難以實現快速、多 組測定植物體內硝酸還原酶的真實活性。本項發明所涉及的這種植物體內硝酸還原酶活性的測定方法是在多年試驗基礎 上獲得的一種簡便、精確并可快速、多組測定植物體內硝酸還原酶活性真實值的新方法。

發明內容
植物體內硝酸還原酶活性的高低能夠真實地反應植物對硝態氮吸收與代謝的能 力，是評價環境條件對植物氮代謝影響的一種有效方法。因此，建立一種能夠簡便、快速測 定植物體內硝酸還原酶真實活性的方法在植物氮代謝研究領域具有重要作用。本項發明解決其技術問題所采用的技術方案是在保持已有的“離體法”測定硝酸 還原酶活性比色時加入的顯色劑對-氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液不變前提下，進行如 下操作1、提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成IOOmM, pH7. 5的提取液。2、測定方法流程取植物樣品0. 3克左右剪碎裝入反應試管，加入提取液6毫升， 抽真空1-2分鐘，從反應試管中取出ImL反應液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應試管 吹氮氣30秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時后，取反應液 ImL放入潔凈試管。然后向反應試管中加入ImL提取液，再放入30_35°C水浴中保溫1小時 后，取反應液ImL放入潔凈試管。再向反應試管中加入ImL提取液，放入30_35°C水浴中保 溫1小時，取反應液ImL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有ImL反應液的試管中分別 加入去離子水4mL準備用于顯色反應。3、比色分別向上述4只試管中加入ImL 1 % (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應30分鐘。用提取液ImL加入4mL去離子水后分別 加入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液做空白，在 分光光度計上測定波長540nm處的光密度值，取同一時間的最佳光密度值計算硝酸還原酶 活性。單位為=μΜ NCVg-1FW IT1。本發明的有益效果是(1)提取液配制簡單(僅1種)，所需化學藥品少，成本低； (2)測定過程無需研磨、離心，且整個實驗過程中無硝態氮(N03_)的引入，不會誘導硝酸還 原酶活性的提高，因而誤差小，真正實現了對植物體內硝酸還原酶真實值的測定；(3)方法 簡便，可以實現快速、多組測定植物體內硝酸還原酶的真實活性。
具體實施例方式1、提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成IOOmM, pH7.5的提取液。2、測定方法流程取植物樣品0. 3克左右剪碎裝入反應試管，加入提取液6毫升， 抽真空1-2分鐘，從反應試管中取出ImL反應液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應試管 吹氮氣30秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時后，取反應液 ImL放入潔凈試管。然后向反應試管中加入ImL提取液，再放入30_35°C水浴中保溫1小時后，取反應液ImL放入潔凈試管。再向反應試管中加入ImL提取液，放入30_35°C水浴中保 溫1小時，取反應液ImL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有ImL反應液的試管中分別 加入去離子水4mL準備用于顯色反應。3、比色分別向上述4只試管中加入ImL 1 % (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應30分鐘，用提取液ImL加入4mL去離子水后分別加 入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液做空白，在分 光光度計上測定波長540nm處的光密度值，取同一時間的最佳光密度值計算硝酸還原酶活 性。單位為:μΜ NCVg-1FW IT1。4、標準曲線用亞硝酸鉀分別配制 0，0. 05，0. 1，0. 3，0. 4，0. 5，1. 0，5. 0，10. 0， 15. 0,20. 0,25. 0,30. 0,40. 0,60. 0,80. 0，100. 0，120. 0，160. 0,200. 0μ M 的標準溶液，分別 取lmL，加入4mL去離子水后再分別加入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應30分鐘后在分光光度計上測定波長54 0nm處的光密度值， 做出亞硝酸鉀濃度和光密度值的直線圖。
權利要求
提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和1％(V/V)的1-丙醇配制成100mM，pH 7.5的提取液。
1.提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成100mM，pH 7. 5的提取液。
2.測定方法流程取植物樣品0.3克左右剪碎裝入反應試管，加入提取液6毫升，抽真 空1-2分鐘，從反應試管中取出lmL反應液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應試管吹氮 氣30秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時后，取反應液lmL放 入潔凈試管。然后向反應試管中加入lmL提取液，再放入30-35°C水浴中保溫1小時后，取 反應液lmL放入潔凈試管。再向反應試管中加入lmL提取液，放入30_35°C水浴中保溫1小 時，取反應液lmL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有lmL反應液的試管中分別加入去 離子水4mL準備用于顯色反應。
全文摘要
一種硝酸還原酶活性測定新方法，方法改進為用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和1％的1-丙醇配制100mM，pH7.5的提取液。樣品0.3克左右剪碎裝入反應試管，加入提取液6mL，抽真空后，取1mL反應液放入試管中；反應試管吹氮氣30秒后用錫紙密封，將該試管放入30-35℃水浴中保溫1小時，取反應液1mL放入試管；再向反應試管中加入1mL提取液，重復水浴保溫反應3次后，分別向裝有1mL反應液的試管中加入去離子水4mL，再分別加入1mL1％的對-氨基苯磺酸和1mL0.2％的α-萘胺，顯色30分鐘，測定540nm處的光密度值。用亞硝酸鉀做標準曲線，計算酶活性。單位為μMNO2-g-1FWh-1。
文檔編號C12Q1/26GK101831484SQ20101014038
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月7日 優先權日2010年4月7日
發明者丁偉, 戴航宇, 程茁 申請人:東北農業大學