專利名稱：一種快速提取水稻dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速提取水稻DNA的方法。
背景技術：
基于PCR技術為基礎的分子標記已廣泛地運用于種子純度鑒定、親緣關系的分 析、分子標記輔助育種、基因定位以及轉基因植株檢測等。尤其是，DNA分子標記輔助選擇 育種已成為分子技術在作物改良中的一個重要應用，即通過對與表型緊密連鎖的DNA分子 標記的篩選，以快速獲取帶目的表型的理想植株。隨著生物技術的不斷發展、水稻基因組測 序的完成、功能基因鑒定的日益增多，分子標記輔助選擇育種越來越多地應用于作物新品 種改良。為了應用PCR檢測技術，人們需要從組織樣品中提取DNA。然而，DNA提取是一項 耗費人力、物力的繁瑣工作，提取的DNA也僅在篩選、鑒定時使用了很少的一部分，剩余的 大部分DNA將作為累贅而被廢棄。盡管人們也一直致力于DNA抽提方法的探討，但目前應 用的主要方法仍然煩瑣費時。因此，在大規模的基于PCR的基因型檢測作業中，高效、快速、 簡便的模板DNA制備顯得非常重要。目前已公開的一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法(王蘭、龍云銘、劉耀 光，分子植物育種.2009，7 (2) 425-428)，存在著如下缺陷1、操作較費時，僅破碎組織樣品的時間就需要5min ；2、僅能以葉片為原料進行提取，且最少要求有4mg的葉片；因此原料的適應性較 差；3、所得的DNA溶液主要用于短期使用用TE制備的DNA在4°C下可保存IOd以上， 在冷凍下可保存半年；不利于長期保存。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速提取水稻DNA的方法，采用該方法能從 水稻組織中高效、快速、簡便的提取模板DNA。為了解決上述技術問題，本發明提供一種快速提取水稻DNA的方法，包括以下步 驟1)、取0. OOlg 0. Olg水稻樣品放入離心管內，然后向離心管內加入500 μ 1試劑 C和200 μ 1氯仿，并加入1 2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑Α、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 1 0. 3%體積比的β -巰基乙醇，得作為DNA提取液的試 劑C;試劑A包括100 200mM sorbitol (山梨醇)、100 150mM Tris (三羥甲基氨基 甲烷)、20 30mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二鈉)、400 600mM NaCl,15 25mM Na2S03、 質量濃度0. 8%的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)和質量濃度2%的sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉)，其余為蒸餾水；PH7. 5 ；試劑B包括90 IlOmM Tris (三羥甲基氨基甲燒)、450 550mM KC1、15 20mMMgCl2和質量濃度的Triton X_100 (聚乙二醇辛基苯基醚)，其余為蒸餾水；pH9. 0 ；2)、對步驟1)所得的離心管內的水稻樣品進行破碎處理；
3)、將步驟2)所得的破碎后的樣品進行離心處理；得含DNA的上清液。作為本發明的快速提取水稻DNA的方法的改進將上述步驟3)所得的含DNA的上 清液繼續依次進行以下步驟4)、取步驟3)所得的上清液于另一個離心管內，加1 2體積倍的無水乙醇輕搖 混勻，沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm離心10 15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用體積濃度60 80%的乙醇洗滌，8，000 10，OOOrpm 離心10 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀為DNA。作為本發明的快速提取水稻DNA的方法的進一步改進取步驟3)所得的4 6μ 1 上清液直接作為模板DNA，以試劑D作為PCR反應緩沖液，進行PCR檢測；根據PCR檢測結 果選擇所需的上清液進行步驟4)；試劑D包括40 60mM Tris (三羥甲基氨基甲燒)、200 300mM KCl、8 IOmM MgCl2、質量濃度0.5%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)和體積濃度5 10%的 BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9. 0。作為本發明的快速提取水稻DNA的方法的進一步改進步驟2)的破碎為將步驟 1)所得的離心管放入細胞破碎儀內，于28HZ的頻率破碎1. 5 2. 5min ；所述步驟3)的離 心為將步驟2)所得的破碎后的樣品于8，000 10，OOOrpm離心4 6min。作為本發明的快速提取水稻DNA的方法的進一步改進步驟6)為棄步驟5)所得 的上清液，倒置離心管至晾干，附著于離心管壁上的沉淀為DNA。作為本發明的快速提取水稻DNA的方法的進一步改進步驟1)中鋼珠的粒徑為 4 6mm。在本發明中，試劑A、試劑B和試劑D均可利用HCl或NaOH對pH值進行調整。實 際應用時，在使用前，先將試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成混合液，然后 再加入占混合液0. 1 0. 3%體積比(優選的0. 2%體積比)的β -巰基乙醇，得作為DNA 提取液的試劑C。試劑A可以破壞水稻組織的細胞壁和細胞膜，試劑B則協調提供一個細胞 裂解、DNA釋出的pH環境和離子環境；在使用前才進行試劑C的配制是為了保證試劑A和 試劑B長期存放的穩定性。試劑D則為PCR反應提供穩定的環境和必需的因子。本發明的主要原理為采用試劑A破壞水稻組織的細胞壁和細胞膜，有助于細胞 中DNA的釋出，進一步在機械破碎的作用下，使絕大部分的組織細胞破裂，DNA逸出。試劑B 則協調提供一個細胞裂解、DNA釋出的pH環境和離子環境，防止釋出的DNA發生沉淀或氧 化褐變。當DNA釋出于由溶液A和溶液B配制的溶液C中時，通過氯仿的純化和離心后，獲 得的上清液可直接用于PCR反應或通過乙醇沉淀析出DNA用于長期保存或使用。本發明所得的DNA可于_20°C長期保存備用或加100 200 μ 1超純水溶解用于直 接使用。利用本發明能從水稻組織中高效、快速、簡便地提取DNA，可以簡化PCR檢測技術中提取DNA的耗費人力、物力的繁瑣工作。與現有的植物DNA提取方法相比，本發明具有如下優點1)、快速、簡便。本發明能夠在2min內完成細胞破碎，且一次性可完成48份樣品 的破碎。10分鐘就可完成96份樣品的DNA提取，用于PCR擴增。 而傳統的CTAB提取法，完成96份樣品的DNA提取則在5小時以上。
2)、成本低。提取過程中減少了多種試劑的使用量，使用本發明從水稻中快速提取 DNA僅應用于PCR反應時，無需使用乙醇或異丙醇沉淀。3)、DNA產量高。0. OOlg的水稻樣品用本試劑盒提取，可用作100次PCR擴增的 DNA模板使用。而按照背景技術中告知的《用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法》，以 0. 004g的水稻樣品為原料進行提取，所得也無法滿足100次PCR擴增的DNA模板所需使用量。4)、周期短。由于所需的水稻樣品少，催芽、播種5 8天就可取少量葉片用于PCR 檢測。5)、本發明不但可以葉片作為原料，還可以用別的組織(例如根、莖、老葉、嫩葉、 葉鞘、穗等)作為原料；一般來說，根在催芽、播種的5 8天內即能取得。6)、本發明可實現短期使用，也可實現長期保存；具有更大的通用性；具體為利 用本發明所得的DNA溶液可用于短期使用，進一步沉淀獲得的DNA與傳統方法獲得的DNA 是一樣的，在冷凍條件下可以保存若干年。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是從水稻葉片中快速提取DNA經PCR擴增后實施的效果圖；RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217、RM3183 引物序列來自 GRAMENE 網站 (http://www. gramene. org/)的公開信息，并委托上海申能博彩公司合成用于PCR擴增； Marker為DL2000標準分子量圖譜。圖2是經沉淀提取的DNA經光密度測定得出的含量對比圖，1 5為5份樣品的測定值。 圖3是來自不同組織樣品的模板DNA的PCR擴增產物電泳圖。
具體實施例方式實施例1、一種快速提取水稻DNA的方法，依次進行以下步驟1)、取0.005g水稻葉片(日本晴經浸種、催芽后，播種7天后的幼嫩葉片)放入 2ml的圓底離心管(江蘇海門耀華玻璃儀器廠生產)，加入500 μ 1試劑C和200 μ 1氯仿， 并加入1粒鋼珠(為粒徑5mm的碳素鋼鋼珠，購自上海自行車鋼珠廠)；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 2%體積比的β -巰基乙醇，得試劑C ；該試劑C作為DNA提 取液。試劑A 包括 150mM sorbitol, 125mM Tris,25mM EDTA-Na2,500mM NaCl, 20mMNa2S03，質量濃度0. 8%的CTAB，質量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；
試劑B 包括 IOOmM Tris,500mM KCl, 18mM MgCl2，質量濃度 1 % 的 Triton X-100， 其余為蒸餾水；PH9. 0 ；2)、將步驟1)所得的離心管放入細胞破碎儀(TiSSueLySerII，QIAGEN，德國)內， 于28HZ的頻率破碎2min ；從而實現對水稻葉片進行破碎。3)、將步驟2)所得的破碎后樣品于10，OOOrpm離心5min ；得上清液。4)、以2 μ 1的試劑D作為PCR反應緩沖液，取5 μ 1上清液直接作為模板DNA，進行 PCR檢測。試劑D 包括 50mM Tris,250mM KCl,9mM MgCl2，質量濃度 0. 5%的 Triton X-100， 體積比10%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9.0。該試劑D為10XPCR反 應緩沖液，即試劑D占PCR反應體系的總體積的1/10。用于PCR檢測的PCR反應體系具體如下5μ 1 上清液，2μ 1 試劑 D，lunit Taq 酶，200mM dNTP (包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各50mM)，引物濃度0. 2mM,加ddH20補至20 μ L·所用引物分別為以下任意一種RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217 和 RM3183 ；上述引物均可從 gramene 網站 (http //www. Rramene. ors/)上獲得。PCR反應過程控制條件如下94 "C 6 分鐘94 "C 50 秒55 "C 30 秒72 "C 40 秒 42cycle72 °C 15 分鐘15°C 保存所得的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果如圖1所示不同的引物均能擴增 出清晰的條帶。從而證明步驟3)所得的上清液的確含有足夠含量DNA可用于PCR擴增， 并且不同引物均能擴出良好的效果。實施例2、一種快速提取水稻DNA的方法，在實施例1的基礎上，根據PCR檢測結果 選擇所需的上清液繼續依次進行以下步驟4)、取400μ 1步驟3)所得的上清液于另一個離心管內，加600 μ 1無水乙醇輕搖 混勻，沉淀45min后，10，OOOrpm離心15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用500 μ 1體積濃度70%的乙醇洗滌，10，OOOrpm離心 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，倒置離心管至晾干；所得DNA可長期保存。也可將其 加100 μ 1超純水溶解獲得含DNA的溶液。上述6個步驟總計花費在2小時。經測試0. 005克葉片克最終能獲得25 μ g左右的核酸。5次重復實驗所得的數據 如圖2所示。實施例3、分別選用水稻(日本晴)的老葉、莖、鞘、穗、根各0. 005克作為原料替代實施例1中的幼嫩葉片，以RM8213作為引物，其余同實施例1 ；老葉、莖、鞘、穗、根均為90天所得；最 終所得的結果如圖3所示。圖3證明不同組織所得的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果相一致。對比實施例1 選用同實施例1的水稻葉片0. 005g水稻葉片，按照背景技術所告知的DNA快速制 備方法進行提取，所得的上清液再按照上述實施例2的步驟4) 步驟6)進行操作，最終僅 能獲得IOyg左右的核酸。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
一種快速提取水稻DNA的方法，其特征是包括以下步驟1)、取0.001g～0.01g水稻樣品放入離心管內，然后向離心管內加入500μl試劑C和200μl氯仿，并加入1～2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1∶2∶7的體積比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％體積比的β-巰基乙醇，得作為DNA提取液的試劑C；所述試劑A包括100～200mM山梨醇、100～150mM三羥甲基氨基甲烷、20～30mM乙二胺四乙酸二鈉、400～600mM NaCl、15～25mM Na2SO3、質量濃度0.8％的十六烷基三甲基溴化銨和質量濃度2％的N-十二烷基肌氨酸鈉，其余為蒸餾水；pH7.5；所述試劑B包括90～110mM三羥甲基氨基甲烷、450～550mM KCl、15～20mM MgCl2和質量濃度1％的聚乙二醇辛基苯基醚，其余為蒸餾水；pH9.0；2)、對步驟1)所得的離心管內的水稻樣品進行破碎處理；3)、將步驟2)所得的破碎后的樣品進行離心處理；得含DNA的上清液。
2.根據權利要求1所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是將上述步驟3)所得的含 DNA的上清液繼續依次進行以下步驟4)、取步驟3)所得的上清液于另一個離心管內，加1 2體積倍的無水乙醇輕搖混勻， 沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm離心10 15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用體積濃度60 80%的乙醇洗滌，8，000 10，OOOrpm離心 10 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀為DNA。
3.根據權利要求1或2所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是取步驟3)所得的 4 6 μ 1上清液直接作為模板DNA，以試劑D作為PCR反應緩沖液，進行PCR檢測；根據PCR 檢測結果選擇所需的上清液進行步驟4)；所述試劑D包括40 60mM三羥甲基氨基甲燒、200 300mM KC1、8 IOmM MgCl2、質 量濃度0. 5%的Triton X-100和體積濃度5 10%的BSA，其余為去離子滅菌水；pH9. 0。
4.根據權利要求3所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟2)的破碎為將步驟1)所得的離心管放入細胞破碎儀內，于28HZ的頻率破 碎 1. 5 2. 5min ；所述步驟3)的離心為將步驟2)所得的破碎后的樣品于8，000 10，OOOrpm離心4 6min。
5.根據權利要求4所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟6)為棄步 驟5)所得的上清液，倒置離心管至晾干，附著于離心管壁上的沉淀為DNA。
6.根據權利要求5所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟1)中鋼珠的 粒徑為4 6mm。
全文摘要
本發明公開了一種快速提取水稻DNA的方法，包括以下步驟1)取0.001g～0.01g水稻樣品放入離心管內，然后向離心管內加入500μl試劑C和200μl氯仿，并加入1～2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1∶2∶7的體積比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％體積比的β-巰基乙醇，得作為DNA提取液的試劑C；2)對步驟1)所得的離心管內的水稻樣品進行破碎處理；3)將步驟2)所得的破碎后的樣品進行離心處理；得含DNA的上清液。采用本發明的方法能從水稻組織中高效、快速、簡便的提取模板DNA。
文檔編號C12N15/10GK101812446SQ20101015740
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者劉堅, 張光恒, 曾大力, 楊窯龍, 胡江, 郭龍彪, 錢前, 饒玉春, 高振宇 申請人:中國水稻研究所