專利名稱：一種提取水稻dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到DNA的一種提取方法，尤其涉及到一種水稻葉片和谷粒等植物品種的DNA提取的方法。
背景技術(shù)：
SSR標(biāo)記具有快速、準(zhǔn)確，信息含量高、呈共顯性遺傳、易于分析和重復(fù)可靠等特點(diǎn)。因此，自1989年該技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，己被廣泛應(yīng)用于水稻基因定位和QTL分析，水稻品種 DNA指紋圖譜構(gòu)建、群體遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、雜交組合真實(shí)性和純度鑒定、 轉(zhuǎn)基因品種檢測(cè)等方面。DNA提取是PCR分析的前提。目前以水稻葉片或種子為研究材料進(jìn)行DNA提取的過程主要是采用2ml離心管，在每個(gè)單管中進(jìn)行研磨、離心、轉(zhuǎn)管、單槍加樣等。提取步驟多，時(shí)間長(zhǎng)，且每次轉(zhuǎn)管都需要寫編號(hào)，不適合DNA樣品的大量快速制備。發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)不適合DNA樣品的大量快速制備的缺陷，本發(fā)明提供一種快速、簡(jiǎn)便高通量提取水稻D NA的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提出一種提取水稻DNA的方法。
在本發(fā)明中，涉及到的植物材料優(yōu)選為水稻的幼苗或種子或成株的葉片。
本發(fā)明采用的步驟包括a)、采用96孔深孔板對(duì)植物材料進(jìn)行取樣；b)、在深孔板的每個(gè)孔中加入I粒小鋼珠，放入液氮中凍2-3分鐘；C)、安裝96深孔板適配器；d)、采用混合研磨儀對(duì)在96深孔板內(nèi)的植物材料進(jìn)行研磨、粉碎；e)、利用8槍頭的排槍對(duì)深孔板內(nèi)的植物材料進(jìn)行萃取；f)、萃取后的DNA進(jìn)行室溫干燥；g)、干燥后的DNA加入滅菌雙蒸水溶解；h)、利用RM520進(jìn)行PCR，并在瓊脂糖電泳上進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的一種優(yōu)選方案是，所述萃取使用的萃取液的順序依次為I單位的I.5XCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，I單位的氯仿/異戊醇(24:1)混合溶液，2/3單位異丙醇，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是，植物材料為種植成8株X 12行的水稻幼苗或水稻的種子或水稻成株的葉片。
本發(fā)明的一種優(yōu)選方案是，所述的研磨、粉碎的振蕩頻率為25-30HZ/S，所預(yù)計(jì)的時(shí)間為I. 5min。
在本發(fā)明提到的96孔深孔板不僅限于96孔深孔板，也可以為48孔深孔板，24 孔深孔板，192孔深孔板，具體根據(jù)實(shí)際的需要選取。
本發(fā)明提到的利用8槍頭的排槍不僅限于8槍頭的排槍，也可以為16槍頭的排槍，或4槍頭的排槍，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)際需要選取。本發(fā)明的技術(shù)效果是與一般植物DNA提取技術(shù)相比，有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1)無(wú)需寫每份材料的編號(hào)；2)無(wú)需使用單槍，提取DNA過程全程使用排槍；3)可通量提取，一次操作即為96份樣；4)簡(jiǎn)化了提取步驟，省時(shí)高效。


圖I為96孔板批量提取和一般單管提取的DNA電泳效果對(duì)比圖
具體實(shí)施例方式SSR(Si mple Sequence Repeats)標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(Micr0SatelliteDNA),是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為I飛個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列.由于每個(gè)SSR兩 側(cè)的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列。
用分子標(biāo)記RM520對(duì)旱恢3號(hào)與B5材料的后代群體進(jìn)行檢測(cè)，用96孔深孔板進(jìn)行取樣(田間材料選擇種植成8株X 12行)，在深孔板將材料取樣方向以及田間編號(hào)備注好。取約5cm左右的葉片卷著放入I. Iml深孔板中的離心管中，深孔板株行編號(hào)與田間編號(hào)對(duì)應(yīng)；將樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研磨，即在深孔板每個(gè)帶葉片孔中加入I粒小鋼珠，放入液氮中凍2-3分鐘,安裝96深孔板適配器對(duì)稱裝于混合研磨儀(Mixer Mill Type, Model:MM301)，然后進(jìn)行粉碎，以每秒25-30的頻率振蕩I. 5min，磨成粉樣；用排槍在96深孔板每個(gè)樣管中加入I. 5 X CTABC I. 5 X CTAB要56°C預(yù)熱)DNA提取緩沖液300 ul，56°C水浴30min，中間搖勻3-4次讓DNA充分裂解；用排槍加入等量氯仿/異戊醇(24:1) (300ul)，室溫下振蕩20分鐘，3500rpm離心lOmin，將上清液(吸取IOOul)轉(zhuǎn)入PCR板中；加入2/3體積(67ul)的異丙醇(_20°C預(yù)冷)，排槍上下吸混幾次，蓋好PCR板蓋，輕緩顛倒混勻后_20°C放置Ih以上或過夜，進(jìn)行DNA沉淀，在將平板放于離心機(jī)上3500rpm離心lOmin，排槍洗掉上清液，沉淀的DNA室溫干燥，加入200ul滅菌雙蒸水溶解DNA，每次取2ul直接進(jìn)行PCR。利用RM520進(jìn)行PCR，并在瓊脂糖電泳上進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)用96深孔板板提取DNA方法與2ml單離心管的提取方法的DNA檢測(cè)效果一致。
權(quán)利要求
1.一種提取水稻DNA的方法，其步驟包括 a)、采用96孔深孔板對(duì)植物材料進(jìn)行取樣； b)、在深孔板的每個(gè)孔中加入I粒小鋼珠，放入液氮中凍2-3分鐘； C)、安裝96深孔板適配器； d)、采用混合研磨儀對(duì)在96深孔板內(nèi)的植物材料進(jìn)行研磨、粉碎； e)、利用8槍頭的排槍對(duì)深孔板內(nèi)的植物材料進(jìn)行萃取； f)、萃取后的DNA進(jìn)行室溫干燥； g)、干燥后的DNA加入滅菌雙蒸水溶解； h)、利用RM520進(jìn)行PCR，并在瓊脂糖電泳上進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述萃取使用的萃取液的依次為I單位的I.5XCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，I單位的氯仿/異戊醇(24:1)混合溶液，2/3單位異丙醇，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試驗(yàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的植物材料為種植成8株X12行的水稻幼苗或水稻的種子或水稻成株的葉片。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的研磨、粉碎的振蕩頻率為25-30HZ/S，所預(yù)計(jì)的時(shí)間為I. 5min。
全文摘要
本發(fā)明利用96深孔板以及混合研磨儀進(jìn)行快速高效的水稻葉片或種子DNA的提取方法，涉及生物學(xué)領(lǐng)域，是一種快速有效的植物DNA的提取方法，提取全程無(wú)需單槍操作，全為排槍作業(yè)，且不需寫編號(hào)，實(shí)現(xiàn)快速高通量的提取方法。可用于水稻分子育種、純度鑒定、種子真實(shí)性檢測(cè)、基因克隆等。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102978200SQ201210564828
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者劉國(guó)蘭, 劉毅, 王飛名, 王加紅, 張安寧, 余新橋, 羅利軍 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心