專利名稱：一種提高基因重組腸道病毒71型vp1表達量的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白表達量的方法，尤其涉及一種在哺乳動物細胞中提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白表達量的方法。
背景技術：
腸道病毒71型(EntemVims71，EV 71)引起是手足口病主要病原體，目前還沒有預防手足口病的疫苗上市。常見的疫苗有滅活疫苗、DNA疫苗及重組疫苗、減毒活疫苗和多肽疫苗。其中重組疫苗是指利用重組DNA技術，將病原的保護性抗原基因在不同的表達系統中體外表達，生產能誘導機體產生保護性免疫反應的病原蛋白質，再經分離純化而制備的疫苗。重組疫苗因安全性好、制備簡單及成本較低等優點，在預防病毒性傳染病方面已經廣泛應用，EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突起，直徑大約在 24nm 30nm，核酸為單股正鏈RNA。病毒粒子的衣殼由60個亞單位構成，后者又是由四種衣殼蛋白(VPl VP4)拼裝成的五聚體樣結構(圖1)。四種結構蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內側與病毒核心緊密連接以外，其它三種結構蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本位于VP1-VP3上。EV71病毒衣殼蛋白VPl是該病毒主要的中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性。VPl基因具有與病毒血清型完全對應的遺傳多樣性，VPl 基因序列不僅可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據.并可作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考，因此VPl基因成了 EV71疫苗開發的最重要研究對象。利用基因工程技術， 重組表達VPl蛋白，用于開發手足口病疫苗是當前研究的熱點。目前，利用基因工程重組技術開發疫苗的難點在于如何提高重組蛋白的表達量和保持蛋白抗原性。

發明內容
本發明的目的是通過基因的改建，有效地提高在哺乳動物細胞中的腸道病毒71 型VPl蛋白的表達量，從而構建新型的重組腸道病毒71型VPl蛋白表達質粒，建立表達體系，并進行穩定表達株的全面篩選。為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種提高重組腸道病毒71型VPl蛋白的方法，包括如下步驟將內部核糖體進入位點序列IRES進行弱化處理；弱化后的所述序列一端連接目的基因，另一端連接篩選標記基因，構建含有雙重篩選標記的表達載體，其中，所述目的基因和篩選標記基因共用一個啟動子。優選的，所述篩選標記基因是二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表達載體是 PIRES-DHFR 或 ρ IRES-GS。進一步的，還包括通過氨甲喋呤或MSX加壓擴增篩選標記基因兩翼的基因。進一步的，所述弱化處理是指通過雙順反子載體將篩選標記基因二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因連在內部核糖體進入位點序列IRES的3'端，篩選標記基因的表達水平得到降低。本發明通過含弱化的內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，簡稱為“IRES”)序列的含有雙重篩選標記的表達載體來表達重組VPl蛋白，極大地簡化篩選過程，提高篩選效率，提高獲得高表達穩定株的概率，即經過一次單克隆篩選，即可獲得大量穩定表達細胞株，單克隆細胞的陽性率達到95%。


圖1是本發明中具有雙重篩選標記的表達載體pIRES-DHFR/GS示意圖。圖2是VPl基因克隆進入pIRES-DHFR/GS的示意圖。
具體實施例方式圍繞重組蛋白表達水平低的問題，人們進行了大量的實驗研究，以期提高其表達量。弱化技術，即通過有目的改造使得外源目的表達基因3'端下游的選擇標記基因的翻譯起始效率大大降低，基因表達被弱化。因此，提高外源基因的表達水平可以通過弱化選擇標記基因表達，提高外源基因擴增水平來達到。因此，提高外源基因的表達水平可以弱化選擇標記基因表達，提高外源基因擴增水平來達到。弱化選擇標記基因的表達，可使得在使用與常規的表達載體相同的選擇壓力時，選擇標記dhfr基因拷貝數更高，外源基因的表達水平也相應得到提高。如一種雙順反子載體將dhfr基因連在外源基因的3'端，從而位于外源基因3'端下游的dhfr基因的翻譯起始效率大大降低，dhfr基因表達被弱化。圖1是本發明中具有雙重篩選標記的表達載體pIRES-DHFR/GS示意圖，如圖1所示，本發明采用含內部核糖體進入位點(internal ribosome entrysite，IRES)序列的有雙重篩選標記的表達載體一pIRES-DHFR/GS，該載體利用弱化的IRES連接目的基因和篩選標記基因-二氫葉酸還原酶基因(DHFR)或谷氨酰胺合成酶基因(gs)，兩個基因共用一個啟動子，兩段基因同時得到翻譯，在翻譯過程中核糖體至第一個基因終止密碼子時，從mRNA 上解離下來，但由于存在IRES序列，核糖體又能自動結合mRNA，直接翻譯IRES后的基因。 同時由于本載體使用的IRES序列經弱化處理，第二個基因的表達水平(DHFR或gs)是前一個基因即目的基因的1/10，如果細胞系要在含MTX或MSX的培養基中生存，必須高水平表達二氫葉酸還原酶基因(DHFR)或谷氨酰胺合成酶基因(gs)，這樣弱化的IRES前的目的基因相應高水平的表達。此外，由于MTX或MSX加壓可以擴增DHFR或gs兩翼的基因，經過多輪加壓并提高加壓篩選濃度，可以進一步提高目的基因的表達量。圖2是腸道病毒71型VPl基因克隆進入pIRES-DHFR/GS的示意圖。重組VPl蛋白表達在哺乳動物細胞中的表達，在哺乳動物細胞內的各種加工修飾，可以最大程度保持重組VP蛋白的免疫原性，用使用較多的BHK表達體系和廣泛使用的 CHO表達體系分別進行表達研究。將克隆好的表達載體分別轉染到BHK或CHO細胞中。轉染48h后按照1 15傳代，24h后加入相應的篩選藥物MTX或MSX篩選穩定表達細胞株，并測定表達上清中的VPl抗原含量及生物活性。
權利要求
1.一種提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白的方法，其特征是包括如下步驟將內部核糖體進入位點序列IRES進行弱化處理；弱化后的所述序列一端連接目的基因，另一端連接篩選標記基因，構建含有雙重篩選標記的表達載體，其中，所述目的基因和篩選標記基因共用一個啟動子。
2.如權利要求1所述的一種提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白表達量的方法，其特征是所述篩選標記基因是二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表達載體是 ρIRES-DHFR 或 pIRES-GS。
3.如權利要求1所述的一種提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白表達量的方法，其特征是還包括通過氨甲喋呤或MSX加壓擴增篩選標記基因兩翼的基因。
4.如權利要求1所述的一種提高基因重組腸道病毒71型VPl蛋白的方法，其特征是 所述弱化處理是指通過雙順反子載體將篩選標記基因二氫葉酸還原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因連在內部核糖體進入位點序列IRES的3'端，篩選標記基因的表達水平得到降低。
全文摘要
本發明通過分子生物學技術，構建含弱化的內部核糖體進入位點(internalribosome entry site，簡稱為“IRES”)序列及雙重篩選標記的新型表達載體，本載體可用來重組表達腸道病毒71型VP1蛋白，通過穩定表達株的全面篩選，能夠有效地提高VP1蛋白在哺乳動物細胞中的表達量。
文檔編號C12N15/85GK102242139SQ20101017061
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者李昂, 馬境 申請人:上海吉美生物工程有限公司