專利名稱：Egfp基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的發(fā)展及應(yīng)用，桿狀病毒已被開發(fā)成為高效的真核表達(dá)載體系統(tǒng)，用于各種外源基因的表達(dá)，并作為一種新型的疫苗、基因治療載體受到人們的高度重視，但現(xiàn)存的桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因表達(dá)量與工業(yè)化大生產(chǎn)的要求有較大差距。 并且持續(xù)表達(dá)的時(shí)間較短，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低等，這些因素都限制了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。因此，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究的重點(diǎn)就在于將外源基因表達(dá)時(shí)間延長，表達(dá)效率、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高。從而為改進(jìn)型重組桿狀病毒在脊椎動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因及新型重組活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前重組桿狀病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、表達(dá)效率較工業(yè)生產(chǎn)要求差距大、表達(dá)時(shí)間短等問題，提供EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、以質(zhì)粒peglk為模板，WK2和WK3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EFla基因；二、將EFla基因與pMD18_T載體連接，得到質(zhì)粒pT-EFl α ；三、分別對(duì)質(zhì)粒pT-EFl α和pFB_VSVGED_WPRE進(jìn)行雙酶切， 將酶切后獲得的目的片段EFl α和酶切后的pFB-VSVGED-WPRE連接，得到質(zhì)粒pWK ；四、以 PAAV-LacZ為模板，La和Lb為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測， 采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得L-ITR基因，分別對(duì)L-ITR基因和pWK進(jìn)行單酶切， 將酶切后的L-ITR和pWK連接，連接產(chǎn)物即為pWK-L-ITR ’五、以pAAV_LacZ為模板，Ra和1 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得R-ITR基因，分別對(duì)R-ITR基因和pWK-L-ITR進(jìn)行單酶切，將酶切后的R-ITR和 pWK-L-ITR連接，連接產(chǎn)物即為pWK-ITR ；六、以pEGFP_C3為模板，pEGFP-f和pEGFP-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EGFP基因，分別對(duì)EGFP基因和pWK_ITR進(jìn)行雙酶切，將酶切后的EGFP和pWK_ITR 連接，連接產(chǎn)物即為EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體pWK-ITR-EGFP ；其中步驟一中PCR擴(kuò)增所用引物 WK2 序列為 5，-TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物 WK3 序列為 5，-CCGGA ATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA-3，；步驟四中 PCR 擴(kuò)增所用弓丨物 La 序列為 5，-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3，，引物 Lb 序列為 5，-TGCTCTAGAGTAA TTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步驟五中 PCR 擴(kuò)增所用引物 Ra 序列為 5，-ATACGG TCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 Rb 序列為 5，-ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGG CG-3，；步驟六中 PCR 擴(kuò)增所用引物 pEGFP-f 序列為 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ，，引物 pEGFP-r 序列為 5’ -TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。
本發(fā)明通過添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，成功構(gòu)建EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體pWK-ITR-EGFP，WPRE增強(qiáng)了外源基因的表達(dá)效率，VSV-GED增強(qiáng)了病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率， ITR延長了表達(dá)時(shí)間。


圖1為重組桿狀病毒BV-pWK (-) -EGFP侵染OL細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況； 圖2為圖1相應(yīng)的細(xì)胞核染色的OL細(xì)胞；圖3為重組桿狀病毒BV-pWK-EGFP侵染OL細(xì)胞 48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況；圖4為圖3相應(yīng)的細(xì)胞核染色的OL細(xì)胞；圖5為重組桿狀病毒 BV-pffK-ITR-EGFP侵染OL細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況；圖6為圖5相應(yīng)的細(xì)胞核染色的OL細(xì)胞；圖7為peglk質(zhì)粒圖譜；圖8為pFB_VSVGED_WPRE質(zhì)粒圖譜；圖9為pAAV_LacZ 質(zhì)粒圖譜；圖10為PEGFP-C3質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、以質(zhì)粒peglk為模板，WK2和WK3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EFl α 基因；二、將EFl α基因與pMD18-T載體連接，得到質(zhì)粒pT_EFl α ；三、分別對(duì)質(zhì)粒 PT-EFl α和pFB-VSVGED-WPRE進(jìn)行雙酶切，將酶切后獲得的目的片段EFlα和酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE連接，得到質(zhì)粒pWK ；四、以pAAV_LacZ為模板，La和Lb為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得L-ITR 基因，分別對(duì)L-ITR基因和pWK進(jìn)行單酶切，將酶切后的L-ITR和pWK連接，連接產(chǎn)物即為 PffK-L-ITR ’五、以pAAV-LacZ為模板，Ra和Rb為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得R-ITR基因，分別對(duì)R-ITR基因和pWK-L-ITR進(jìn)行單酶切，將酶切后的R-ITR和pWK-L_ITR連接，連接產(chǎn)物即為pWK_ITR ； 六、以pEGFP-C3為模板，pEGFP-f和pEGFP-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EGFP基因，分別對(duì)EGFP基因和 PffK-ITR進(jìn)行雙酶切，將酶切后的EGFP和pWK-ITR連接，連接產(chǎn)物即為EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體pWK-ITR-EGFP ；其中步驟一中PCR擴(kuò)增所用引物WK2序列為5，-TGCTCTAGACG TGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物WK3序列為 5，_CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAA ATGGAAGAAAAAA-3 ’；步驟四中 PCR 擴(kuò)增所用引物 La 序列為 5 ’ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCT CACATGT-3，，引物 Lb 序列為 5，-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步驟五中 PCR 擴(kuò)增所用引物序列為 5，-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 1 序列為 5’ -ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3，；步驟六中 PCR 擴(kuò)增所用引物 pEGFP-f 序列為 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3，，引物 pEGFP-r 序列為 5，-TCAGTCGACTCACT TGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。本實(shí)施方式所述質(zhì)粒peglk購自hvitrogen公司，peglk質(zhì)粒圖譜如圖7所示； 所述pFB-VSVGED-WPRE購自addgene公司，pFB-VSVGED-WPRE質(zhì)粒圖譜如圖8所示；所CN 102533862 A
述pAAV-LacZ購自Biovector Science Lab公司，pAAV-LacZ質(zhì)粒圖譜如圖9所示；所述 PEGFP-C3購自上海研域化學(xué)試劑有限公司，PEGFP-C3質(zhì)粒圖譜如圖10所示。EGFP基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)IJfEFl α基因和pFastBac [ρΗ_]均采用Mil和EcoRI進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物 pFastBac [ρΗ_]和EFl α用Τ4 DNA連接酶連接，將連接有EFl α的pFastBac [ρΗ_]命名為 pffK-FB-[pH-]-EFl α，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定。然后以pEGFP_C3為模板，LM9和pA為引物擴(kuò)增 polyA 基因，引物 LM9 序列為 5，-ATACGGTCCGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3，，引物 PA 序列為 5，-CGGAATTCACGCATGCTTGTCGACTAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTT-3，，進(jìn)行 poIyA與pffK-FB-[pH-]-EFl α的酶切連接，將連接有PolyA的EcoRI命名為pWK(-)，即陰性對(duì)照質(zhì)粒，并用RsrII和EcoRI進(jìn)行雙酶切檢測。所述pFastBac[pH_]購自addgene公司。2、按照本實(shí)施方式的方法，以pEGFP-C3為模板，pEGFP-f和pEGFP_r為引物擴(kuò)增 EGFP基因，用限制性內(nèi)切酶Mil和EcoRI分別對(duì)EGFP、pWK、pffK-ITR和pWK(-)進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收目的條帶，并將酶切后的EGFP和酶切后的pWK、pWK-ITR、pffK(-)分別進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物命名為pWK-EGFP、pffK-ITR-EGFP和 pWK(-)-EGFP，并用Mil和EcoRI分別進(jìn)行酶切鑒定。3、重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-EGFP轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞首先分別將pWK-EGFP、pWK-ITR-EGFP 和 pWK (-) -EGFP 轉(zhuǎn)化 Ε. coli DHlOBac 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性的重組菌落，提取重組Bacmid質(zhì)粒，制備3種重組桿狀病毒穿梭載體 Bacmid-EGFP。再用3種重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-EGFP分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，收獲重組桿狀病毒P1。在處于對(duì)數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞懸液中以10%的接種量加入Pl病毒液，27°C， 70r/min懸浮培養(yǎng)至Sf9細(xì)胞病變明顯，收獲并保存含病毒的上清液P2。再用P2液體擴(kuò)增獲取P3液體，獲取大量的病毒上清，測定滴度后用來進(jìn)行重組桿狀病毒的表達(dá)。4、重組桿狀病毒侵染OL細(xì)胞將培養(yǎng)的OL細(xì)胞用胰酶消化吹散后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以2X IO4個(gè)細(xì)胞 /孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C培養(yǎng)1 后加入感染復(fù)數(shù)為40 (multiplicity of infection, MOI)的CMV-IE-GFP桿狀病毒P3儲(chǔ)備，開始病毒的侵染，37°C培養(yǎng)1 后更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)液。分別在重組桿狀病毒侵染后培養(yǎng)12h、Mh、48h、72h，96h對(duì)EGFP表達(dá)情況進(jìn)行觀察。5、綠色熒光蛋白的檢測首先進(jìn)行細(xì)胞固定及核染色，然后利用尼康公司生產(chǎn)的TE2000型倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及EGFP表達(dá)情況，采集細(xì)胞的數(shù)字圖像。圖1為重組桿狀病毒 BV-pffK (-) -EGFP侵染OL細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況，圖2為圖1相應(yīng)的細(xì)胞核染色的 OL細(xì)胞，圖3為重組桿狀病毒BV-pWK-EGFP侵染OL細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況，圖4 為圖3相應(yīng)的細(xì)胞核染色的OL細(xì)胞，圖5為重組桿狀病毒BV-pWK-ITR-EGFP侵染OL細(xì)胞 48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況，圖6為圖5相應(yīng)的細(xì)胞核染色的OL細(xì)胞。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，重組桿狀病毒BV-pWK-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為57. 3 %，重組桿狀病毒BV-pWK-ITR-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為69. 1 %，比陰性對(duì)照BV-pWK(-)-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高了 32. 6 %。與對(duì)照組 pWK (-) -EGFP 和 pWK-EGFP 相比，pWK-ITR-EGFP 增強(qiáng)了外源基因的表達(dá)效率；對(duì)照組pWK (-) -EGFP和pWK-EGFP的表達(dá)時(shí)間分別為邪h和144h，而本發(fā)明pWK-ITR-EGFP的表達(dá)時(shí)間為21他。本實(shí)施方式所構(gòu)建的重組桿狀病毒表達(dá)載體 PffK-ITR-EGFP通過添加WPRE增強(qiáng)了外源基因的表達(dá)效率、VSV-GED增強(qiáng)了病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，ITR延長了表達(dá)時(shí)間。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分用量質(zhì)粒peglk3 |iL20μΜ 引物 WK2Ιμ 20μΜ 引物 WK3Ιμ IOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL無菌水35.5|iLPCR 擴(kuò)增條件為94°C變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 1. 2min， 共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中連接的體系如下
成分用量EFloc基因3 |iLpMD18-T 載體Ιμ Solution I5 |iL無菌水Ιμ 連接反應(yīng)條件為16°C連接12h。其它與
具體實(shí)施例方式本實(shí)施方式所述Solution I為pMD18_T載體配套緩沖液，內(nèi)含T4DNA連接酶，購買自大連寶生物工程有限公司。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中質(zhì)粒 ρΤ-EFl α雙酶切的體系如下
成分用量
質(zhì)粒 pT-EFloc10|iLXbal2.5 |iL
EcoRl2.5|iL·
IOxMBuffer5μL
無菌水30|iL酶切反應(yīng)條件為37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中 pFB-VSVGED-WPRE雙酶切的體系如下
成分用量pFB-VSVGED-WPRE5 |iLXbal2.5|iLEcoRl2.5|iLIOxMBufFer5μL無菌水35μL酶切反應(yīng)條件為37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中連接的體系如下
成分用量目的片段EFla3 |iL酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA連接酶0.4|iL無菌水0.6|iL連接反應(yīng)條件16°C連接12h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分 pAAV-LacZ 0.8mmol^L 引物 La 0.4μιηο1/μ 引物 Lb IOxTaq Buffer
用量 2μL Ιμ Ιμ 5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL無菌水36.5|iL
PCR 擴(kuò)增條件為94°C變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 0. 2min，共20個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中L-ITR基因單酶切的體系如下
成分用量L-ITR基因10|iLXbal2.5|iLIOxMBuffer5μL無菌水32.5|iL
酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中pWK單酶切的體系如下
成分用量pWK10|iLXbal2.5|iLIOxMBuffer5μL無菌水32.5|iL
酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中連接的體系如下
成分用量酶切后的L-ITR3μL酶切后的pWK5μLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA連接酶0.4|iL無菌水0.6|iL
連接反應(yīng)條件16°C連接12h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分用量pAAV-LacZ2|iL0.8mmol^L 弓丨物 RaΙμΣ0.4μιηο1/μ 引物 RbΙμΣIOxTaq Buffer5|iLIOmMdNTP4|iL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL無菌水 36.5μ
PCR 擴(kuò)增條件為94°C變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 0. 2min， 共20個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中R-ITR基因單酶切的體系如下
成分用量R-ITR基因10|iLRsrll2.5|iLIOXHBuffer5|iL無菌水 32.5μ
酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中 PffK-L-ITR單酶切的體系如下
成分用量pWK-L-ITR10|iLRsrll2.5|iLIOXHBuffer5|iL無菌水 32.5μ
酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
系如下
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中連接的體成分用量酶切后的R-ITR3 |iL酶切后的pWK-L-ITR5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA連接酶0.4|iL無菌水0.6|iL連接反應(yīng)條件16°C連接12h。其它與具體實(shí)施方式
一才丨具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分用量pEGFP-C33 |iL20μΜ 引物 pEGFP-fΙμ 20μΜ 引物 pEGFP-rΙμ IOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL無菌水35.5|iLPCR擴(kuò)增條件為94°C變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 45s，共 30 個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中EGFP基因
雙酶切的體系如下
成分用量
EGFP 基因10|iL
SaK2.5μL
EcoRl2.5|iL·
IOXHBuffer5μL
無菌水30|iL酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中pWK-ITR
雙酶切的體系如下成分用量
pWK-ITR10|iL
Sail2.5μL
EcoRI2.5|iL· IOXHBuffer 5μL 無菌水 30|iL酶切反應(yīng)條件37°C水浴，2h。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中連接的體系如下
成分用量酶切后的EGFP3 |iL酶切后的pWK-ITR5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA連接酶0.4|iL無菌水0.6|iL 連接反應(yīng)條件37°C連接池。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、以質(zhì)粒Peglk為模板，WK2和WK3為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EFl α基因；二、將EFl α基因與pMD18_T載體連接，得到質(zhì)粒pT_EFl α ；三、分別對(duì)質(zhì)粒pT-EFl α和pFB-VSVGED-WPRE進(jìn)行雙酶切，將酶切后獲得的目的片段EFl α和酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE連接，得到質(zhì)粒pWK ；四、以pAAV_LacZ為模板，La和Lb為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得L-ITR 基因，分別對(duì)L-ITR基因和pWK進(jìn)行單酶切，將酶切后的L-ITR和pWK連接，連接產(chǎn)物即為 PffK-L-ITR ；五、以pAAV-LacZ為模板，和Rb為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得R-ITR基因，分別對(duì)R-ITR基因和pWK-L-ITR進(jìn)行單酶切，將酶切后的R-ITR和pWK-L_ITR連接，連接產(chǎn)物即為pWK_ITR ； 六、以pEGFP-C3為模板，pEGFP-f和pEGFP-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，獲得EGFP基因，分別對(duì)EGFP基因和 PffK-ITR進(jìn)行雙酶切，將酶切后的EGFP和pWK-ITR連接，連接產(chǎn)物即為EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體pWK-ITR-EGFP ；其中步驟一中PCR擴(kuò)增所用引物WK2序列為5，-TGCTCTAGACG TGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物 WK3 序列為 5，-CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAA ATGGAAGAAAAAA-3 ’；步驟四中 PCR 擴(kuò)增所用引物 La 序列為 5 ’ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCT CACATGT-3，，引物 Lb 序列為 5，-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步驟五中 PCR 擴(kuò)增所用引物 Ra 序列為 5，-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 1 序列為 5’ -ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3，；步驟六中 PCR 擴(kuò)增所用引物 pEGFP-f 序列為 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3，，引物 pEGFP-r 序列為 5，-TCAGTCGACTCACT TGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量質(zhì)粒 peglk3μL20μΜ 引物 WK2\μL20μΜ 引物 WK3\μLIOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL無菌水35.5μ PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸1. 2min，共30 個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量pAAV-LacZ2μ \0.8mmol^L 引物 LalμL\0.4pmol>L 引物 Lb\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5pL無菌水36.5μ 〇尺擴(kuò)增條件為94で變性5min，94°C變性308，56で退火308，72で延伸0. 2min,#20 個(gè)循環(huán)，再72で延伸10min，4°C保溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步 驟五中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量pAAV-LacZ2μ 0.8mmol^L 引物 RalμL0.4pmol>L 引物 Rb\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5pL無菌水36.5μ 〇尺擴(kuò)增條件為94で變性5min，94°C變性308，56で退火308，72で延伸0. 2min,#20 個(gè)循環(huán)，再72で延伸10min，4°C保溫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步 驟六中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量pEGFP-C33μL20μΜ 引物 pEGFP-f\μL20μΜ 引物 pEGFP-r\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL 5υ/μ Taq DNA 聚合酶 0.5pL無菌水35.5μ PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
全文摘要
EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，涉及EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法。是要解決目前重組桿狀病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、表達(dá)效率較工業(yè)生產(chǎn)要求差距大、表達(dá)時(shí)間短等問題。方法；一、PCR擴(kuò)增EF1α基因；二、構(gòu)建質(zhì)粒pT-EF1α；三、構(gòu)建質(zhì)粒pWK；四、PCR擴(kuò)增L-ITR基因，構(gòu)建pWK-L-ITR；五、PCR擴(kuò)增R-ITR基因，構(gòu)建pWK-ITR；六、PCR擴(kuò)增EGFP基因，構(gòu)建EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體pWK-ITR-EGFP。本發(fā)明通過添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，增強(qiáng)了外源基因的表達(dá)效率，增強(qiáng)了病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，延長了表達(dá)時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102533862SQ20121001281
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者平文祥, 樓莊偉, 葛菁萍, 高冬妮 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)