專利名稱：惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶的原核表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達谷胱甘肽-非依賴型甲 醛脫氫酶蛋白(PADH)的原核表達載體pET28a-PADH及其在PADH蛋白的原核表達和制備 PADH重組蛋白中的應用。
背景技術：
甲醛在自然界中廣泛存在，主要通過含甲基或甲氧基團的化合物如木質素和果膠 的降解過程產生。甲醛也是工業生產中用于制造樹脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的主要 原料。室內空氣中游離的甲醛主要來源于建筑材料、家具、各種粘合劑以及合成織品等，甲 醛由于存在板材內部，揮發期可長達3 15年，裝修后一兩年內難以完全揮發掉。在城市 空氣中，甲醛主要來自機動車尾氣排放，在大氣中含量很高。高濃度的甲醛對神經系統、免 疫系統、肺和肝臟等都有毒害作用，長期接觸甲醛的人，容易引起鼻腔、口腔、皮膚和消化道 的癌癥，還可能導致白血病。目前，甲醛的危害及其去除的研究已經引起國內外眾多學者的 關注。但是，大多集中在其危害病理學方面，治理技術方面主要是物理和化學方法居多，存 在成本高、裝置復雜、治標不治本等特點。如何清除空氣中污染的甲醛已經成為關系到人類 健康亟待解決的問題，但是目前還沒有一個有效的解決辦法，現代生物技術的應用為解決 這一難題提供了新思路。甲醛是一個十分活躍的化合物，能與蛋白質、核苷酸共價交聯反應，但它也作為一 個內源代謝物產生于所有生物中，在體內甲醛可通過5，10-亞甲基四氫葉酸自發解離產 生，此外各種DNA和RNA脫甲基化反應都會產生低濃度的甲醛。在長期的進化過程中，幾乎 所有生物對甲醛都有各自的解毒機制，用以阻止甲醛的致命以及突變作用。生物體在長期 進化中已經建立了一些應對甲醛毒害的解毒機制，因此利用生物甲醛代謝途徑關鍵酶來治 理甲醛污染，具有經濟、環保、不產生二次污染等優點。由于生物體中這些酶的表達水平較 低，難以純化。國內外建立許多檢測空氣中甲醛含量的方法，如分光光度計法、氣相層析、高效液 相層析和極譜法等，但對甲醛的酶法檢測研究卻很少。利用甲醛脫氫酶的催化特性進行甲 醛的酶法檢測，不僅費用低而且操作簡單，適合于工作場合的日常使用。Vianello等把甲醛 脫氫酶偶合在場效應晶體管上，通過離子場效應敏感晶體管檢測空氣中甲醛的含量，其檢 測限可以達到0. 1 u g/mL，遠低于職業接觸的臨界值。生化和遺傳學研究表明GSH-依賴的甲醛解毒途徑是自然界廣泛存在的一個修復 系統，在絕大多數原核(除了古細菌)和所有的真核生物中都發現有這個修復系統。甲醛 脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase, ADH，EC 1. 2. 1. 1)是中等鋅鏈醇脫氫酶家族的一 員，廣泛存在于從大腸桿菌到人類的多種生物體中.大多數的甲醛脫氫酶都需要NAD+和 GSH參與甲醛的氧化，來自惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)的甲醛脫氫酶(PADH，EC 1. 2. 1. 46)則是不需另外添加GSH而依賴NAD+催化甲醛氧化的酶。純化的PADH是個由四個相同亞基組成的同型四聚體，每個亞基由398個氨基酸殘基組成，其相對分子量大約為 42kDa (Ando 等，J. Biochem, 1979,85 1165-1172)。由于 PADH 具有一些獨特的生化特性，如 可以直接利用甲醛做底物將其氧化為甲酸，因此該酶可以應用于甲醛污染的生物治理。用 較低的成本和簡便的方法快速生產并純化有活性的PADH蛋白是滿足其廣泛應用的必需條 件，PADH蛋白特異性抗體是檢測植物中PADH蛋白表達水平的有效工具，其抗體的制備在現 有研究中還未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種PADH的原核表達載體(pET28a_PADH)，該載體含有T7啟 動子和終止子、細菌核糖體結合位點和PADH基因及一個組氨酸標簽，利用該載體轉化大腸 桿菌(Rosetta)，可實現PADH蛋白的高水平表達，表達的重組蛋白質40%以可溶性形式存 在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30% )，60%存在于包涵體中，通過割膠純化從上包 涵體中很容易獲得高純度的重組蛋白質，用于抗體的制備。用親和層析很容易從大腸桿菌 可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，用于PADH酶制劑的生產及其生化特性 分析。純化PADH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案PADH的原核表達載體pET28a_PADH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體 結合位點RBS和PADH基因及一個組氨酸標簽。所述的原核表達載體，谷胱甘肽_非依賴型甲醛脫氫酶基因PADH來源于惡臭假單 胞菌，在GenBank中的登錄號為D21201。所述的原核表達載體，PADH基因的上游有T7啟動子和細菌核糖體結合位點RBS， T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠PADH基因的起始密碼子上游還有一 個組氨酸標簽序列。所述的原核表達載體，由下述方法構建而得(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的 一對引物PADH5 :5， -CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3，PADH3 :5， -CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3，5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點；3，端加CTCGAG特征 序列，由此形成Xho I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的 全長。(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法 提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD18-PADH ；(3)構建原核載體 pET28a-PADH，用 Ndel 和 Xhol 雙酶切 pMD18T_PADH 和 pET28a， 并回收純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切 檢測，獲得原核表達載體pET28a-PADN。原核表達載體pET28a_PADH的制備方法，包括下述步驟(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的 一對引物
PADH5 :5， -CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3，PADH3 :5， -CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3，5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點；3，端加CTCGAG特征 序列，由此形成Xho I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的 全長。(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法 提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD18-PADH ；(3)構建原核載體 pET28a-PADH，用 Ndel 和 Xhol 雙酶切 pMD18T_PADH 和 pET28a， 并回收純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切 檢測，獲得原核表達載體pET28a-PADH。原核表達載體pET28a_PADH在制備重組PADH蛋白中的應用。原核表達載體pET28a_PADH在制備PADH抗體中的應用。應用原核表達載體pET28a_PADH制備PADH重組蛋白的方法，將載體pET28a_PADH 熱刺激法導入大腸桿菌蛋白表達專用受體菌株Rosetta中，獲得轉化子菌落，用0. 5mM IPTG于30°C誘導4小時后可獲使PADH重組蛋白達到較高的表達量，表達的重組蛋白質 40%以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30%)，60%存在于包涵體中， 通過割膠純化從包涵體中很容易獲得高純度的重組蛋白質，可作為抗原用于PADH抗體的 制備。用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，用 于PADH酶制劑的生產及其生化特性分析，為PADH酶制劑的生產及其生理生化分析，PADH特 異性抗體抗原的制備提供一條新途徑。


圖1、惡臭假單胞菌基因組DNA的檢測。M :DL2000,1 3 基因組。圖2、PADH基因的TA克隆策略。圖3、PADH基因TA克隆質粒的檢測。其中(A)重組質粒pMD18_PADH的電泳檢 測。M :DL2000 plus II ；1-12 重組質粒pMD18_PADH ； 13 正對照(分子量為3. 9kb的質粒 DNA)。(B)重組質粒pMD18-PADH的單酶切檢測。M :DNA markerlll ； 1-3 用Sal I單酶切的 PMD18-ADH ；4 沒有酶切的質粒pMD18_PADH。(C)重組質粒pMD18_PADH的雙酶切檢測。M :M DL2000 plus II;1:用Nco I+Xpn I雙酶切的pMD18_PADH ;2 沒有酶切的質粒pMD18_PADH。圖4、PADH基因的原核表達載體構建策略。圖5、PADH基因原核表達載體的檢測。其中(A)重組質粒pET28a_PADH的電泳 檢測。1-12 重組質粒pET28a-PADH ；8 正對照(分子量為6. 6kb的質粒DNA)。(B)重 組質粒pET28a-PADH的雙酶切檢測。M :DNA marker III ； 1-4 用Xho I+Sall雙酶切的 pET28a-PADH ；5 沒有酶切的質粒 pET28a_PADH。圖6、PFDH原核表達條件的優化(A)及可溶性蛋白和不溶性蛋白的分布⑶及其 純化(C)。圖7、PADH重組蛋白的純化。圖8、PFDH重組蛋白的酶活性分析。圖9、PFDH重組蛋白酶活性的耐熱性分析。
具體實施例方式試劑與儀器試劑主要分為分子生物學實驗試劑。各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等 為日本寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術有限公 司，其余試劑均為國產分析純。儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。 所有引物序列均在上海生工合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常 規方法。實施例1 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)基因組DNA的制備與檢測本發明所用的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)購自中國工業微生物菌種保 藏中心，惡臭假單胞菌基因組DNA的制備采用普通細菌基因組提取方法。取2mL過夜培養 菌液于4°C 4000rpm離心2min，棄盡上清液，收集菌體；加入100 μ ISolution I懸菌；30 μ 1 10% SDS, 1 μ 1 20mg/mL 蛋白酶 K，混勻，37°C 孵育 1 小時；加入 100μ 1 5mol/L NaCl，混 勻；加入 20 μ 1 CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%, NaClO. 7mol/L)，混勻，65°C，10 分鐘；加入等 體積酚/氯仿/異戊醇混合液(酚/氯仿/異戊醇25 24 1)混勻；離心12000rpm，5 分鐘；取上清，加入2倍體積無水乙醇，0. 1倍體積3mOl/LNa0AC，-20°C放置30分鐘；離心 12000rpm, 10分鐘；沉淀加入70%乙醇洗滌；沉淀干燥后，溶于20 μ 1 TE, -20°C保存。取 2μ 1基因組DNA用的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果(圖1)說明提取到的基因組DNA 質量符合要求。實施例2 =PADH基因的擴增與TA克隆ADH基因的擴增及TA克隆的策略如圖2所示，首選從GenBank中查找PADH的全長 基因序列(ADH基因的GenBank登錄號為D21201)，并設計一對引物，序列如下PADH5 CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCGPADH3 CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點；3，引物末端加3，端 加CTCGAG特征序列，由此形成Xho I酶切位點。在PCR反應混合液中加入IOng的惡臭假單胞菌基因組DNA作為模板，同時加 Λ 50ng 的特異性引物 PADH5 和 PADH3U. 8μ IdNTP(IOmM)，12. 5μ 1 的 2XGCBuffer I 禾口 0. 4 μ 1的Taq plus (2. 5U/ μ 1)聚合酶(天根生化科技公司)，加雙蒸水使反應終體積為 20 μ 1。在PCR儀上于94°C加熱3分鐘，然后按照94°C、45秒，55°C、30秒，72°C、1分鐘15 秒的程序進行30個循環的反應，最后在72°C延長反應10分鐘的程序進行PCR反應擴增得 到PADH基因。反應完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物。回收并純化PADH全長 基因DNA(1.2kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMD18_T (大連寶生物 公司)載體上，實驗操作按試劑盒的說明書進行，反應過夜后用反應混合液轉化大腸桿菌 感受態DH5ci (購自天根生化科技公司)，采用堿裂解法提取質粒DNA，用瓊脂糖凝膠電 泳檢測其大小(圖3A)，選取大小和理論值相符的重組質粒進行酶切檢測。用SalI單酶切 重組質粒，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒pMD-PADH有兩條帶， 其中一條為829bp條帶，另一條為3. OSkb條帶(因為SalI在載體和PADH基因片段上都有一個酶切位點)(圖3B)。選取單酶切檢測正確的重組質粒pMD18-PADH做進一步的雙酶切 檢測，用Ncol、Kpnl雙酶切重組質粒，連接成功的重組質粒有兩條帶，其中一條為499bp條 帶，另一條為3. 4kb條帶(因為Ncol只在PADH基因上有單一酶切位點，而Kpnl只在載體 片段上有單一酶切位點)(圖3C)。測序分析證明重組質粒載體中插入的PADH全長基因序 列正確。再次確認是連接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培 養，用試劑盒純化質粒PMD18-PADH。實施例3 原核表達載體pET28a_PADH的構建pET28a-PADH 的構建策略如圖 4 所示，用 Nde I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切開純化的原核表達質粒載體pET28a(購自Novagen公司)和pMD18_PADH，通過瓊脂糖 凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pET28a被切割后產生的載體片斷 pET28a(5. 3kb)及pMD18_PADH被切割產生的PADH基因的DNA片斷(1. 2kb)，然后用寶生 物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pET28a載體片段和PADH基因的DNA片斷產生原核表達 載體pET28a-PADH。用連接反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態細胞(DH5 a， 天根生化科技)，把轉化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(KmjOiig/ml)的平板上，于37°C 過夜培養，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質粒(圖5A)，用Xhol、 Sal I (Fermentas)進行雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產生5. 5kb和 800bp左右大小的兩條帶(因為Xho I和Sal I在PADH基因處都有單一識別位點，而在 pET-28a(+)載體沒有識別位點，故雙酶切質粒應有兩個片段)(圖5B)。將連接成功的質粒 載體pET28a-PADH重新轉化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒 pET28a-PADH. 實施例4 重組PADH蛋白的表達與表達條件的優化用原核表達載體pET28a_PADH轉化大腸桿菌Rosetta的感受態細胞(天根生化科 技)。挑取單菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C過夜培養(OD600值約為1. 5)。加 0. 5和1. OmM的IPTG于28°C誘導0_8小時后，離心收集菌體，去掉上清液，加入5 X SDS-PAGE 上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于95°C加熱10分鐘煮沸菌體。冰浴冷卻后于4°C 離心(12000rpm)10分鐘，取上清作SDS-PAGE。根據文獻資料和軟件分析預測目的蛋白大 小為45kDa左右，采用12%分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實驗指南(第三版)》。 SDS-PAGE電泳結果(圖6A)表明用IPTG于30°C誘導的時間越長，PADH蛋白表達量越高， 用0. 5mM的IPTG誘導4小時后PADH蛋白表達量最高。實施例5 重組PADH蛋白的純化用原核表達載體pET28a_PADH轉化大腸桿菌Rosetta的感受態細胞，挑取單菌落 入 1000mL LB (含有 Kan 50mg/L)中，37°C培養至 0D600 值約為 0. 6。加 0. 5mmol/L IPTG 誘 導后4小時，離心收集菌體，用wash buffer (10mM Tris_Cl，pH7. 5)洗2次，加入30ml蛋白 抽提緩沖液(磷酸鈉緩沖液(pH7.4)20mmol/L)，懸浮菌體。于冰浴中超聲波破碎細菌細胞 (工作3秒，間歇9秒，功率30W,全程30分鐘)。于4°C離心(6000g) 30分鐘，得到上清和 沉淀。取適量上清和沉淀蛋白樣品加入適量上樣緩沖液作SDS-PAGE，結果說明所表達的重 組蛋白質40%為可溶性蛋白，60%形成包涵體蛋白(圖6B)。沉淀用8M尿素(10ml)溶解， 加入適量上樣緩沖液，跑12% SDS-PAGE，然后用0. 25M KC1于4°C染色30分鐘，割出PADH 蛋白條帶，放入透析袋，加入2ml SDS-PAGE buffer，進行水平電泳4_5小時或過夜，將PADH
8蛋白從凝膠中洗脫出來，可獲得純度達95%以上的PADH蛋白樣品(圖6C)，最后在1XPBS 溶液中透析過夜后可作為抗原用于PADH抗體的制備。上清液過0.23um濾膜，用親和層析柱分離純化可溶性PADH重組蛋白。參 看His-Trap HP說明書，首先用5柱體積純水洗柱，用5柱平衡緩沖液(磷酸鈉緩沖液 (pH7. 4)20mmOl/L，5mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白樣品，用5柱體積濃度分別為30、70、 500mM的咪唑緩沖液(磷酸鈉鹽緩沖液20mmOl/L，NaC10. 5mmol/L,咪唑)進行梯度洗脫，收 集洗脫液，每管1. 5mL。最后用分別用5柱體積純水和5柱體積20%乙醇洗柱。測定及各洗 脫液中蛋白的濃度，用50ug跑SDS-PAGE檢測蛋白的純度(圖7)，圖7的數據說明PADH重 組蛋白在500mM的咪唑緩沖液中被洗脫下來，蛋白質的純度達90%，加70%硫酸銨沉淀洗 脫液中的蛋白質，用磷酸鉀緩沖液(磷酸鉀緩沖液(PH7. 5) 100mmol/L, DTT lmmol/L,20% 甘油)溶解后可用于固定化酶的制備或生化特性分析。實施例6 重組PADH蛋白的酶活性分析由于PADH酶催化的反應伴隨著NAD的還原形成NADH，因此可通過測量PADH反應 液在340nm吸光度增加的量計算出其酶活。通過Bradford法測定可溶性總蛋白樣品和純 化后蛋白樣品的濃度，在lml的反應體系(磷酸鉀緩沖液(pH8.0)50mmol/L，甲醛2mmol/ L,NAD+lmmol/L)于40°C溫育10分鐘后加入200 u g蛋白啟動反應，測定340nm吸光度的增 值。一個酶活單位U定義為40°C每分鐘還原1 y mol NAD+為NADH所需的酶量。按公式酶 活性(U/mg) = (A/6. 22) X (1/B) X (1/C)計算酶的活性，其中A是A A34(lnm，B反應中可溶性 蛋白含量，C是時間，6. 22是每ii mol NADH在340nm處吸光系數。如圖8A所示，未純化的 粗蛋白酶活僅為0. 08U/mg，而純化后蛋白酶活達到1. 721U/mg，純化倍數為21. 5倍。同時 在30°C、40°C、5(rC、65°C四個溫度下分別測定了 PADH酶蛋白的活力，結果表明(圖8B)在 50°C左右ADH活性達到最高，為1. 95U/mg。PADH在65°C溫育lOmin后仍具有65% (1. 26U/ mg)的活性，表明純化的重組PADH是一種適用溫度較廣、耐熱性較強、活性較高的酶蛋白。實施例7 重組PADH蛋白酶活性的耐熱性分析取適量PADH純化蛋白樣品在不同溫度(30°C、40°C、5(TC、65°C )下保溫不同時 間(0min、10min、20min、40min、100min)后測定其相對剩余酶活，結構如圖9所示。從圖9 可以看出，PADH重組蛋白具有較好的熱穩定性，在30°C -40°C下相當穩定，酶活變化不大， 在30°C、40°C下保溫lOOmin后仍有接近85%和75%的相對活性。50°C時酶活性達到最 高(1.95U/mg)，不過隨著時間的延長，其相對酶活有所下降，但長時間保溫(lOOmin)仍然 具有61%的相對活性。從圖中可以看出PADH在65°C下溫育lOmin后活性開始急劇下降， 到20min時僅存11. 3%，40min后完全失活，說明在高溫下(65°C )長時間的溫育還是會對 PADH蛋白結構造成較大破壞，使其喪失活性。通過上述的實驗，本發明達到了如下的結果利用本發明的PADH的原核表達載體 (pET28a-PADH)轉化大腸桿菌(Rosetta)可實現PADH蛋白的高水平表達，表達的重組蛋白 質40%以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30% )，60%存在于包涵體 中，通過割膠純化從上包涵體中很容易獲得高純度的重組蛋白質，用于抗體的制備。用親和 層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，用于PADH酶制 劑的生產及其生化特性分析。純化PADH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。
權利要求
PADH的原核表達載體pET28a-PADH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和PADH基因及一個組氨酸標簽。
2.如權利要求1所述的原核表達載體，所述載體中的谷胱甘肽_非依賴型甲醛脫氫酶 基因PADH來源于惡臭假單胞菌，在GenBank中的登錄號為D21201。
3.如權利要求1所述的原核表達載體，所述PADH基因的上游有T7啟動子和細菌核糖 體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠PADH基因的起始密 碼子上游還有一個組氨酸標簽序列。
4.如權利要求1所述的原核表達載體，由下述方法構建而得(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的一對 引物PADH5 :5’ -CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3’PADH3 :5’ -CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3’5，端引物含有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點；3，端加CTCGAG特征序 列，由此形成Xho I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的全長。(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMDlS-T載體上，采用堿裂解法提取 質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD 18-PADH ；(3)構建原核載體pET28a-PADH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD18T-PADH和pET28a，并回收 純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切檢測， 獲得原核表達載體pET28a-PADH。
5.權利要求1-4的原核表達載體的制備方法，包括下述步驟(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的一對 引物PADH5 :5’ -CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3’PADH3 :5’ -CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3’5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點；3，端加CTCGAG特征序列， 由此形成Xho I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的全長。(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMDlS-T載體上，采用堿裂解法提取 質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD18-PADH ；(3)構建原核載體pET28a-PADH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD18T-PADH和pET28a，并回收 純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切檢測， 獲得原核表達載體pET28a-PADH。
6.權利要求1-4的原核表達載體在制備重組PADH蛋白中的應用。
7.權利要求1-4的原核表達載體在制備PADH抗體的抗原中的應用。
8.應用權利要求1-4所述原核表達載體制備PADH重組蛋白的方法，用0.5mMIPTG于 30°C誘導4小時后使PADH重組蛋白達到較高的表達量，表達的重組蛋白質40%以可溶性形 式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30% )，60%存在于包涵體中，通過割膠純化從 包涵體中獲得高純度的PADH重組蛋白質，可作為抗原用于PADH特異性抗體的制備。用親 和層析從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，可用于PADH酶制劑的生產及其生化特 性分析。
全文摘要
本發明公開了一種高效表達惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶蛋白的原核表達載體pET28a-PADH。該載體是含有惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶基因(PADH)的原核表達載體。本發明從惡臭假單胞菌中克隆出PADH基因，用T7啟動子控制它在大腸桿菌中的表達，表達的重組蛋白質40％以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30％)，60％存在于包涵體中，通過割膠純化從上包涵體中很容易獲得高純度的PADH重組蛋白質，可作為抗原用于PADH特異性抗體的制備。用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，用于PADH酶制劑的生產及其生化特性分析。
文檔編號C12N15/53GK101864446SQ20101017223
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者孟慶超, 年洪娟, 張婧, 李昆志, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學