專利名稱：一種惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物培養(yǎng)基，特別是涉及一種用于培養(yǎng)惡臭假單胞菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
硝基苯是化工行業(yè)的基本原料之一，主要應(yīng)用于炸藥、農(nóng)藥、染料等有機(jī)合成工業(yè)。由于硝基苯在水中具有較高的穩(wěn)定性，一旦進(jìn)入水體，就會(huì)造成水體較長時(shí)間的污染，另外，硝基苯毒性較強(qiáng)，不僅能夠造成環(huán)境污染，而且一旦人吸入硝基苯蒸汽，還會(huì)引起急性中毒等。目前對(duì)硝基苯廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。化學(xué)法和物理法處理硝基苯廢水較多，但普遍存在二次污染和處理效果不理想等問題。生物法，特別是利用微生物處理該類廢水是目前研究的熱點(diǎn)。
有關(guān)硝基苯降解菌的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，孫凌等(活性炭固定耐冷菌對(duì)硝基苯的降解特性，中國環(huán)境科學(xué)，2009，29(9) =941 - 945)用活性炭固定惡臭假單孢菌(.Pseudomonas putida)進(jìn)行了硝基苯的降解研究。李明堂,徐鏡波，盧振蘭，等(兩株細(xì)菌對(duì)鄰氯硝基苯的協(xié)同降解[J]，環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30 (6) :1138 - 1143)研究結(jié)果表明Pseudomonas putida也可以降解對(duì)鄰氯硝基苯。王琦等(硝基苯降解菌的篩選馴化及其最適降解條件研究，廣東化工，2009，36 (11) =216-219)研究表明，隨著硝基苯濃度升高，短桿菌屬細(xì)菌對(duì)其降解效率降低，硝基苯濃度為500mg/L時(shí)，去除率僅為82%。王書航等(硝基苯降解菌篩選和鑒定，合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31 (11) 1751 - 1754)研究表明，假單孢菌對(duì)初始質(zhì)量濃度為25mg/L的硝基苯溶液經(jīng)過168h培養(yǎng)，降解效率為81. 86%。王松等(硝基苯微生物降解的優(yōu)化條件研究)研究了硝基苯初始濃度、PH值、重金屬和NaCl濃度對(duì)硝基苯降解率影響，結(jié)果表明硝基苯的初始體積比為1000 μ L/L，pH=8, NaCl質(zhì)量濃度50mg/L，ZnCl2質(zhì)量濃度50mg/L時(shí)，硝基苯降解率可達(dá)72. 9%。但是，上述報(bào)道均存在微生物作用時(shí)間較長，降解效率不高，微生物對(duì)硝基苯的耐受性較低等問題。上述問題的本質(zhì)是微生物數(shù)量少，培養(yǎng)條件差造成的。其原因是現(xiàn)在針對(duì)培養(yǎng)基的研究主要集中在菌種生長所需碳源、氮源和無機(jī)鹽等常規(guī)營養(yǎng)元素上，并未考慮到培養(yǎng)基中假單孢菌生長過程中所需要的限制成份。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基，以本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的惡臭假單胞菌培養(yǎng)時(shí)間快，生長速度快、菌株耐受性高，適應(yīng)能力強(qiáng)。每IOOOmL本發(fā)明的惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基中，各組分的含量分別為
牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氫二鉀2 3g，磷酸二氫鉀O. 5 2g，氯化鈣O. 3
1.2g，硝酸鈉3. 4 5. 6g，微量元素和生長因子溶液I 5mL，去離子水余量。其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MoSO4 2.4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5
2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 35mmol/L, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,η本發(fā)明制備得到的培養(yǎng)基的pH值范圍調(diào)節(jié)為7. 5 8. 2。進(jìn)一步地，每IOOOmL本發(fā)明的惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基中，各組分的含量分別為 牛肉膏8. 6 10. 8g，尿素2. 3 4. 6g，磷酸氫二鉀1.1 I. 7g，磷酸二氫鉀O. 6
I. 7g，氯化鈣O. 4 I. Og,硝酸鈉3. 4 4. 3g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。優(yōu)選地，每IOOOmL本發(fā)明的惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基中含有牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氫二鉀2. 96g，磷酸二氫鉀O. 84g，氯化鈣O. Sg,硝酸鈉4g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。將惡臭假單胞菌株接入本發(fā)明的培養(yǎng)基，于27 32 °C，搖床轉(zhuǎn)速120 150r/min下培養(yǎng)12 24h，即可得到高濃度銅綠假單孢菌液。 本發(fā)明根據(jù)惡臭假單胞菌的生理特性，篩選配制出了適合于惡臭假單胞菌生長的培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中引入了 Mo2+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，尿嘧啶，VB6, L-色氨酸等微量元素和生長因子。其中，無機(jī)鹽有助于促進(jìn)硝基苯降解相關(guān)酶類的合成和提高其酶活，促進(jìn)微生物的生長速率，而尿嘧啶，VB6和L-色氨酸等有利于細(xì)胞的生長和分裂，從而提高了微生物對(duì)硝基苯的降解效率。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基為惡臭假單胞菌提供了優(yōu)良的生長環(huán)境，經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的惡臭假單胞菌培養(yǎng)時(shí)間短，可在24h內(nèi)達(dá)到較高濃度(0D值達(dá)2. O以上)，在自然條件下適應(yīng)能力強(qiáng)，具有較高的活力及硝基苯降解能力，對(duì)硝基苯的降解效率特別是炸藥廢水中硝基苯的降解效率達(dá)94. 5%以上，同時(shí)還對(duì)含苯環(huán)和硝基類物質(zhì)具有較高的耐受性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。但不能將實(shí)施例理解為是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其內(nèi)容對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I
分別稱取 MoSO4 O. 52g, CuCl2 O. 26g, ZnCl2 O. 43g, FeSO4 O. 70g，尿嘧啶 2. 22g，VB65. 08g，L-色氨酸6. 35g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏8. 8g，尿素2. 6g，磷酸氫二鉀2. 4g，磷酸二氫鉀O. 9g，氯化鈣O. 5g，硝酸鈉3. Sg，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水?dāng)嚢枞芙馔耆螅匀ルx子水補(bǔ)足至IOOOmL,并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基。實(shí)施例2
分別稱取 MoSO4 O. 64g, CuCl2 O. 34g, ZnCl2 O. 51g, FeSO4 0.68g，尿嘧啶 I. 92g, VB64. 53g，L-色氨酸9. 85g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏9. 6g，尿素3. 9g，磷酸氫二鉀2. 5g，磷酸二氫鉀I. 3g，氯化鈣O. 8g，硝酸鈉4. lg，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水?dāng)嚢枞芙馔耆螅匀ルx子水補(bǔ)足至IOOOmL,并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基。
實(shí)施例3
分別稱取 MoSO4 O. 46g, CuCl2 O. 29g, ZnCl2 O. 48g, FeSO4 0.65g，尿嘧啶 I. 73g, VB67. 03g, L-色氨酸8. 27g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏10.(^，尿素3.38，磷酸氫二鉀2.78，磷酸二氫鉀L 6g，氯化鈣O. 9g，硝酸鈉3. 5g，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水?dāng)嚢枞芙馔耆螅匀ルx子水補(bǔ)足至IOOOmL,并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基。應(yīng)用例I I、采集興安化工廠硝化棉生產(chǎn)廢水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物lmL，轉(zhuǎn)移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫?fù)u床上振蕩重復(fù)培養(yǎng)24h，得到富集培養(yǎng)液。2、移取ImL上述富集培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接入含5mmol/L硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在溫度30 V下培養(yǎng)48h后，取其中的培養(yǎng)物ImL轉(zhuǎn)移到同樣濃度硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C下重復(fù)培養(yǎng)，至培養(yǎng)液濁度(0D值)達(dá)到1.2。3、在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取上述含硝基苯的培養(yǎng)液，在實(shí)施例I的培養(yǎng)基上劃線分離，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，得到獨(dú)立的典型菌株。4、將菌種接入實(shí)施例I提供的培養(yǎng)基中，27 32°C下，搖床轉(zhuǎn)速90 120r/min培養(yǎng)24 36h (對(duì)數(shù)期)，得到菌種，較平均培養(yǎng)時(shí)間縮短6 12h。5、取上述菌種5mL (0D值2. 2)，加入到含硝基苯300mg/L的IOOmL溶液中，30°C下，140r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h后測定硝基苯含量。經(jīng)測定，硝基苯降解率為96. 1%。6、將上述菌種按伯杰氏手冊(cè)進(jìn)行菌種分類鑒定，經(jīng)初步鑒定，該菌種為惡臭假單胞菌。應(yīng)用例2
I、采集興安化工廠硝化棉生產(chǎn)廢水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物lmL，轉(zhuǎn)移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫?fù)u床上振蕩重復(fù)培養(yǎng)24h，得到富集培養(yǎng)液。2、移取ImL上述富集培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接入含5mmol/L硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在溫度30 V下培養(yǎng)48h后，取其中的培養(yǎng)物ImL轉(zhuǎn)移到同樣濃度硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C下重復(fù)培養(yǎng)，至培養(yǎng)液濁度(0D值)達(dá)到1.2。3、在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取上述含硝基苯的培養(yǎng)液，在實(shí)施例2的培養(yǎng)基上劃線分離，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，得到獨(dú)立的典型菌株。4、將菌種接入實(shí)施例2提供的培養(yǎng)基中，27 32°C下，搖床轉(zhuǎn)速90 120r/min培養(yǎng)24 36h (對(duì)數(shù)期)，得到菌種，較平均培養(yǎng)時(shí)間縮短6 12h。5、取上述菌種5mL (0D值2. 4)，加入到含硝基苯500mg/L的IOOmL溶液中，32°C下，120r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h后測定硝基苯含量。經(jīng)測定，硝基苯降解率為95. 2%。6、將上述菌種按伯杰氏手冊(cè)進(jìn)行菌種分類鑒定，經(jīng)初步鑒定，該菌種為惡臭假單胞菌。
權(quán)利要求
1.一種惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基中含有 牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氫二鉀2 3g，磷酸二氫鉀O. 5 2g，氯化鈣O. 3 1.2g，硝酸鈉3. 4 5. 6g，微量元素和生長因子溶液I 5mL，去離子水余量； 其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MoSO4 2. 4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5 2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 3Smmol /T,, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,； 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值范圍為7. 5 8. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基中各組分的含量分別為牛肉膏8. 6 10. 8g,尿素2. 3 4. 6g,磷酸氫二鉀2. 2 2. 7g,磷酸二氫鉀O. 6 I. 7g，氯化鈣O. 4 I. Og,硝酸鈉3. 4 4. 3g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基中各組分的含量分別為牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氫二鉀2. 96g，磷酸二氫鉀O. 84g，氯化鈣O. Sg，硝酸鈉·4g,微量兀素和生長因子溶液ImL,去尚子水余量。
全文摘要
一種惡臭假單胞菌用培養(yǎng)基，每1000mL培養(yǎng)基中含有牛肉膏7～13g，尿素2～5g，磷酸氫二鉀2～3g，磷酸二氫鉀0.5～2g，氯化鈣0.3～1.2g，硝酸鈉3.4～5.6g，微量元素和生長因子溶液1～5mL，去離子水余量，其中微量元素和生長因子溶液中含MoSO42.4～3.6mmol/L，CuCl21.5～2.8mmol/L，ZnCl23.0～4.0mmol/L，F(xiàn)eSO44.2～4.8mmol/L，尿嘧啶15～21mmol/L，VB620～35mmol/L，L-色氨酸30～50mmol/L。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基為惡臭假單胞菌提供了優(yōu)良的生長環(huán)境，使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)惡臭假單胞菌培養(yǎng)時(shí)間快，菌株耐受性高，適應(yīng)能力強(qiáng)，對(duì)硝基苯的降解效率達(dá)94.5%以上，同時(shí)還對(duì)含苯環(huán)和硝基類物質(zhì)具有較高的耐受性。
文檔編號(hào)C12R1/40GK102888378SQ201210432500
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者郭峰波, 賈萬利, 李穎 申請(qǐng)人:中北大學(xué)