專利名稱：海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測方法，針對海洋無脊椎動物海 綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌進(jìn)行原位基因水平上的鑒定。屬于海洋分子生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海綿具有獨(dú)特的腔狀結(jié)構(gòu)，以濾食海水中的微生物為生，體內(nèi)聚集了大量的共生 微生物，一般可以達(dá)到海綿體積的40%以上。許多證據(jù)表明，海綿來源的藥用天然產(chǎn)物可能 是其共生微生物產(chǎn)生的，海綿共生微生物也因此成為了海洋藥物研發(fā)的重點(diǎn)之一。對這些 微生物的多樣性進(jìn)行分析，鑒定出具有宿主特異性的微生物是開發(fā)利用海綿共附生微生物 資源的前提。早期人們主要通過純培養(yǎng)的技術(shù)來分離、鑒定海綿中的微生物。盡管通過改進(jìn) 培養(yǎng)條件、延長培養(yǎng)周期等于段可以獲得一些新穎的微生物，但是海洋中的微生物的可培 養(yǎng)性不到1%，因此這種方法很大程度上不能滿足人們了解海綿共生微生物多樣性的要求。 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和核糖體RNA小亞基(16S/18S rRNA)基因序列分析為核心的現(xiàn) 代分子生態(tài)學(xué)技術(shù)可以繞開海洋微生物難培養(yǎng)的障礙，提供較為全面的多樣性信息。目前 常用技術(shù)有變性梯度凝膠電泳(DGGE)、末端限制性長度多態(tài)性分析(T-RFLP)和克隆文庫 技術(shù)。DGGE技術(shù)雖然可以快速的揭示海綿共生微生物的組成，但對于低豐度的類群敏感性 較低，且獲得的種屬信息相對少；T-RFLP技術(shù)可以較快的獲取大量多樣性信息，但是成本 高，結(jié)果分析較繁瑣；克隆文庫技術(shù)可以獲取較為全面的種屬信息，并且時間成本和資金成 本適中，且可以根據(jù)需求，克隆一些非核糖體RNA的管家基因，豐富多樣性的結(jié)果。人們應(yīng) 用這些分子生態(tài)學(xué)技術(shù)來研究海綿共生微生物多樣性取得了很大的進(jìn)展，但是很難通過得 到的多樣性信息認(rèn)識到海綿共生微生物的生態(tài)學(xué)功能。就多樣性研究來說，人們常常忽視 了海綿細(xì)胞內(nèi)的共生微生物。海綿細(xì)胞內(nèi)的共生微生物可以直接與海綿宿主發(fā)生作用，對 于宿主的表型有非常大的影響。因此，研究海綿細(xì)胞內(nèi)部微生物的組成，對于認(rèn)識海綿共生 微生物的功能以及海綿共生微生物_海綿宿主的相互作用有著非常重大的意義。放線菌作為藥用天然產(chǎn)物的重要來源，在海綿中廣泛存在。許多分離自海綿的放 線菌都具有一定抗菌活性和酶活性；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在這類微生物中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)海綿特 異性類群。因此，海綿中的放線菌是一類非常重要的、有代表性的功能性共生微生物。但在 海綿共生微生物多樣性研究中，放線菌卻經(jīng)常得不到足夠的重視，在現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)研究 中，缺乏應(yīng)用放線菌種屬特異性引物的應(yīng)用，人們很少得到較為全面、完整的海綿放線菌多 樣性信息和分布特點(diǎn)。綜上所述，海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌是一類十分重要卻又缺乏足夠研究的微生物類 群。研究海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的多樣性，探究海綿細(xì)胞內(nèi)共附生放線菌的組成，發(fā)現(xiàn)海綿 胞內(nèi)特異性的放線菌，不儀可以完整人們對于海綿共附生微生物多樣性的認(rèn)知，也更有利 于分析海綿共生放線菌的功能和分離培養(yǎng)這類具有很大生物技術(shù)潛力的微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子 檢測，能較為全面、準(zhǔn)確的對海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌進(jìn)行分子檢測。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明將機(jī)械法與化學(xué)法相結(jié)合，獲取海綿單細(xì)胞，按經(jīng)典的酶 解法提取海綿細(xì)胞內(nèi)共生微生物總DNA ；以提取的總DNA為模板，以放線菌種屬特異性引物 S-C-Act-235-S-20/S-C-Act-878-A-19聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增放線菌16S rRNA基因片段；將 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后構(gòu)建克隆文庫，隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行測序至文庫飽和，將測序結(jié)果上傳 到RDP核糖體數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)和同源性搜索，確定最相近序列和分類地位，將測 序結(jié)果及其最相近序列導(dǎo)入ARB序列分析軟件包中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，完成海綿細(xì)胞內(nèi)共 生放線菌的分子檢測。本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1、海綿組織解離與細(xì)胞分選在無菌條件下，將海綿組織于4°C以下解凍后切 成不超過0. 5cm3的小塊，加到盛有人工海水的錐形瓶中，海綿組織與人工海水的體積比 為1 15-20，110印111，201以下振蕩、洗滌401^11-601^11;將洗滌后的海綿小塊于200目 的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行機(jī)械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工 海水沖洗，沖洗液轉(zhuǎn)入錐形瓶中110rpm，20°C以下振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞 的粗懸液；粗懸液經(jīng)300g，5min離心后收集沉淀，再用無鈣鎂人工海水洗滌三次，300g， 5min離心獲得包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物的海綿細(xì)胞；所述無鈣鎂人工海水的組分為 31. 6gNaCl,0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl，0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子 水，pH 7. 6。2、共生微生物總DNA提取對獲得的海綿細(xì)胞采用TE溶液洗滌、離心，取壓積 20-30 μ 1的細(xì)胞沉淀，采用酶解法破壁后用酚氯仿抽提法提取細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物總 DNA。3、放線菌16S rRNA基因片段擴(kuò)增以提取的DNA為模板，以 S-C-Act-235-S-20(5' -CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG-3' )/S-C-Act-878-A-19(5‘ -CCG TAC TCC CCA GGC GGG G-3')為引物采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增放線菌16S rRNA基因片段。4、克隆文庫構(gòu)建與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后構(gòu)建克隆文庫，隨機(jī)挑取陽性 克隆測序至文庫飽和，將測序結(jié)果上傳到RDP核糖體數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)和同源性搜 索，剔除嵌合體，確定最相近序列。5、海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析把測序結(jié)果及其最相近序列導(dǎo)入ARB序 列分析軟件包中，采用最大似然性法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定不同放線菌的分類地位，并觀察 聚類情況，揭示出海綿細(xì)胞內(nèi)特異性的放線菌，完成海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測。按照本發(fā)明的思路和方法，可以快速獲取海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物，為海綿共生 微生物多樣性與功能的研究提供新的視角。采用放線菌特異性引物，提高了放線菌檢測的 敏感度，可以提供更加全面、準(zhǔn)確的多樣性信息。分析系統(tǒng)發(fā)育樹中的分支和聚類情況，能 直觀的確定特異分布于海綿細(xì)胞內(nèi)的放線菌。


圖1為本發(fā)明方法的技術(shù)路線流程圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例中海綿共生放線菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成對 本發(fā)明的限定。本發(fā)明方法的流程如圖1所示，首先進(jìn)行海綿組織解離與細(xì)胞分選，獲得海綿細(xì) 胞，提取細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物總DNA，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到放線菌的16S rRNA基 因片段，通過構(gòu)建克隆文庫結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)與系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的組 成，發(fā)現(xiàn)海綿細(xì)胞內(nèi)特異性放線菌。具體實(shí)施步驟如下1、海綿組織解離與細(xì)胞分選 (1)以下操作都在無菌條件下進(jìn)行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0. 5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2gMgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110印111，201溫和振蕩401^11-601^11。上清取出后12000g離心lOmin，收集沉淀，為海 綿體表及內(nèi)腔表面的細(xì)胞外外共生微生物，記為樣品W。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行 機(jī)械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用2025倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉(zhuǎn) 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞的粗懸液。粗懸液經(jīng)300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細(xì)胞產(chǎn)生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細(xì)胞(記為樣品B)，其中包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物。(3)合并(2)中的上清，12000g離心lOmin，獲得的沉淀為存在于海綿中膠層中的 海綿細(xì)胞外內(nèi)共生微生物(記為樣品J)。樣品W和樣品J起到對照分析的作用。2.共生微生物總DNA提取(1)之前獲取的B、J、W三種樣品采用TE(pH8.0，10mM Tris(三羥甲基氨基甲 烷)和ImM EDTA (乙二胺四乙酸二鈉))溶液反復(fù)的懸浮、高速離心(12000g，5min)。取 20 μ 1-30 μ 1的細(xì)胞沉淀作為提取DNA的起始樣品。(2)加入 450 μ 1 溶菌酶混勻(10mg/ml)，37°C水浴 lh。再加入 45 μ 1 10% 的 SDS 及5μ 1 10mg/ml的蛋白酶K混勻，55°C水浴30min至溶液清亮。13000g離心IOmin取上清， 加入等體積的Tris-飽和酚充分混勻處理。13000g離心lOmin，取上清用Tris-飽和酚重復(fù) 抽提一次。將上清加入等體積的Tris飽和酚氯仿異戊醇(ν ν ν, 25 24 1), 混勻。13000g離心5min取上清，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)混勻處理。13000g 離心5min取上清。(3)在⑵中得到的上清中加入O. 1倍體積的5mol/LNaCl，再加入1-1. 5倍體積 的異丙醇，輕輕混勻，14000g離心151^11，棄去異丙醇，加入50(^1 70%的乙醇洗滌沉淀。 13000g離心IOmin，棄去乙醇，風(fēng)干，沉淀加入30 μ 1 ΤΕ，再加入不含DNA酶的RNase酶 5 μ 1，37°C水浴IOmin消解RNA。0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB (溴化乙錠)染色分析檢測。提取的基因組DNA位于20kb條帶處，成明亮的單一條帶。3.放線菌16S rRNA基因片段擴(kuò)增(1)三種共生微生物總DNA分別作為模板，所用引物為針對放線菌16SrRNA基因 V3-V5 區(qū)的 S-C-Act-235-S-20 (5 ‘ -CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG-3 ‘ )/ S-C-Act-878-A-19(5' -CCG TAC TCC CCA GGC GGG G-3')。擴(kuò)增體系如下:5μ L IOxPCR 緩沖液(50mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 2)，18mmol/LMgCl2, 500mmol/LKCl, 0. 1 % 甘油，1 % 的 TritonX-100)，正反向引物各 25pmol，1. 75 μ L lOmmol/LdNTP，20ng基因組DNA及 2. 5U Taq 酶，用無菌去離子水補(bǔ)充體積至50 μ L0(2)總DNA模板組成復(fù)雜，為此采用降落PCR的方法95 °C預(yù)變性5min， IOx (95 °C 30s, 72 °C 45s, -0. 5 °C 每循環(huán)，72 °C 45s) ； 15x(95°C 30s, 68 °C 45s, 72 °C 45s)； 72°C 5min。若產(chǎn)物濃度低，可適當(dāng)調(diào)整循環(huán)數(shù)，在第三階段時把循環(huán)數(shù)從15個增加到20-25 個。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小為640bp。4.克隆文庫構(gòu)建與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(1)將PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle Pure Kit純化后與pEasy-Tl載體連接。連接體系為 1 μ 1載體+4 μ 1純化的PCR產(chǎn)物。25°C水浴lOmin。(2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、 NaCl 10g/L)(含卡那霉素)平板上，平板在使用前預(yù)先用10μ 1 IPTG(200mg/ml，異丙 基-β -D-硫代半乳糖苷)和40 μ ΙΧ-gal (20mg/ml,5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)涂布。 沸水浴煮沸15min，12000g離心2min后取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增確認(rèn)是否是陽性克隆。擴(kuò)增 所用引物是載體引物，序列如下T7(5' -TAATAC GAC TCACTATAG GG-3' ), M13(5' -CAG GAAACAGCTATGACC-3 ‘ )，50 μ 1 體系，力口入 2 μ 1 模板。(3)經(jīng)鑒定的陽性克隆送交測序公司測序，測序引物為Τ7/Μ13。采用DOTUR軟 件(http://www.mothur.org)對測序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算稀疏曲線(Rarefraction Curve)確定文庫的飽和度。若文庫飽和度不足80%，則繼續(xù)送樣測序。5.海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析(1)利用DOTUR軟件對每個文庫進(jìn)行計(jì)算分類單元(OTU)的劃分。差異度選擇 2%。每個OTU選擇1個代表性的克隆導(dǎo)入到RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp. cme. msu. edu)中進(jìn) 行嵌合體檢驗(yàn)和同源性搜索。(2)去掉嵌合體后把代表性O(shè)TU及其最相近序列導(dǎo)入ARB序列分析軟件包中 (http://www. arb-home. de)，采用最大似然性法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。使用Fastdnaml算法， 進(jìn)行100次重復(fù)取樣，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過比對不同文庫間序列的聚類情況確定海綿細(xì) 胞內(nèi)宿主特異性放線菌。采用本發(fā)明的技術(shù)路線對于我國南海Holoxea sp.海綿的細(xì)胞內(nèi)共生放線菌進(jìn)行 了研究，取得了很好的效果。圖2是該海綿共生放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。標(biāo)尺表明每100個 堿基中有10個存在差異。其中BAct代表根據(jù)樣品B的總DNA構(gòu)建的放線菌16S rRNA基 因克隆文庫，類似的JAct、WAct分別代表根據(jù)樣品J和樣品W的總DNA構(gòu)建的放線菌16S rRNA基因克隆文庫。TAct是之前采用傳統(tǒng)方法對海綿樣品整體進(jìn)行研究獲得的海綿共生 放線菌序列，與JAct和WAct —起作為對照。序列名后的括號中的數(shù)值代表每個OTU中包 含的克隆數(shù)。虛框圈出的分支表示此類群只在海綿細(xì)胞內(nèi)存在，具有空間特異性。從圖2中可以看出海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌主要分布在棒桿菌亞目(Corynebacterineae)、微球菌亞目(Micrococcineae)和丙酸桿菌亞目(Propionibacterineae)中。可以看到在棒桿菌 亞目(Corynebacterineae)和丙酸桿菌亞目(Propionibacterineae)中部有特異性分布于 海綿細(xì)胞內(nèi)的放線菌。對比細(xì)胞內(nèi)共生放線菌與來自中膠層的放線菌，可以發(fā)現(xiàn)它們在進(jìn) 化地位上較為疏遠(yuǎn)，在進(jìn)化樹中表現(xiàn)為BAct系列的克隆與JAct系列的克隆不出現(xiàn)緊密相 聚的情況。
權(quán)利要求
一種海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測方法，其特征包括如下步驟1)在無菌條件下，將海綿組織于4℃以下解凍后切成不超過0.5cm3的小塊，加到盛有人工海水的錐形瓶中，海綿組織與人工海水的體積比為1∶15-20，110rpm，20℃以下振蕩、洗滌40min-60min；將洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上輕輕摩擦進(jìn)行機(jī)械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工海水沖洗，沖洗液轉(zhuǎn)入錐形瓶中110rpm，20℃以下振蕩、解離40min-60min，得到海綿細(xì)胞的粗懸液；粗懸液經(jīng)300g，5min離心后收集沉淀，再用無鈣鎂人工海水洗滌三次，300g，5min離心獲得包含海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物的海綿細(xì)胞；所述無鈣鎂人工海水的組分為31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0g Na2SO4，2.4gTris-HCl，0.02g NaHCO3，7.2g EDTA，1L去離子水，pH 7.6；2)對獲得的海綿細(xì)胞采用TE溶液洗滌、離心，取壓積20-30μl的細(xì)胞沉淀，采用酶解法破壁后用酚氯仿抽提法提取細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物總DNA；3)以提取的DNA為模板，以S-C-Act-235-S-20(5′-CGC GGC CTA TCAGCTTGTTG-3′)/S-C-Act-878-A-19(5′-CCG TAC TCC CCA GGC GGGG-3′)為引物采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增放線菌16S rRNA基因片段；4)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后構(gòu)建克隆文庫，隨機(jī)挑取陽性克隆測序至文庫飽和，將測序結(jié)果上傳到RDP核糖體數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)和同源性搜索，剔除嵌合體，確定最相近序列；5)把測序結(jié)果及其最相近序列導(dǎo)入ARB序列分析軟件包中，采用最大似然性法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定不同放線菌的分類地位，并觀察聚類情況，揭示出海綿細(xì)胞內(nèi)特異性的放線菌，完成海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測方法，采用機(jī)械法與化學(xué)法相結(jié)合，獲取海綿單細(xì)胞，提取海綿細(xì)胞內(nèi)內(nèi)共生微生物總DNA；以提取的總DNA為模板，以放線菌種屬特異性引物用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增放線菌16SrRNA基因片段；將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后構(gòu)建克隆文庫，隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行測序至文庫飽和，將測序結(jié)果及其最相近序列導(dǎo)入ARB序列分析軟件包中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，完成海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測。本發(fā)明建立了一套較為全面、準(zhǔn)確的海綿細(xì)胞內(nèi)共生放線菌的分子檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101880713SQ20101018610
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者劉放, 周康, 張風(fēng)麗, 李志勇 申請人:上海交通大學(xué)