專利名稱：：一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物制劑檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種病毒制劑的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：^K^MM^MW'M^(Ectropisobliquanucleopolyhedrovirus,EoNPV)Mff狀病毒科，核型多角體病毒屬，該病毒于1977年在我國首次發(fā)現(xiàn)。EoNPV是茶尺蠖的病原性天敵，通過幼蟲取食后在蟲體內(nèi)迅速增殖，致使其感染發(fā)病而死亡。目前這種病毒已可以通過室內(nèi)大量增殖，經(jīng)配制形成產(chǎn)品，進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，近年來，EoNPV作為一種高效病毒殺蟲劑在各省茶區(qū)廣泛推廣使用，對(duì)茶尺蠖進(jìn)行有效的生物防治，產(chǎn)生了良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。因?yàn)檫@種病毒產(chǎn)品不同于一般的農(nóng)藥，它是一個(gè)活體，目前只有通過生物測定的方法進(jìn)行檢測。也就是說，用病毒產(chǎn)品喂飼茶尺蠖幼蟲，看是否發(fā)病來確定，因?yàn)椴《臼菍Ｒ坏模璩唧恫《局荒芨腥静璩唧队紫x。這種傳統(tǒng)的生物測定的方法使得目前在EoNPV病毒制劑的生產(chǎn)、使用過程中存在毒力指標(biāo)檢測粗放、評(píng)價(jià)周期過長、制劑質(zhì)量難以有效監(jiān)控等問題。為了快速有效檢測出生物殺蟲劑中EoNPV的含量，建立靈敏、特異而又簡易的病毒檢測方法至關(guān)重要。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明通過分子生物學(xué)的手段提供了一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法。即根據(jù)茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并從感染該病毒的蟲體中提取EoNPV基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將該基因片段與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，經(jīng)單克隆菌落篩選及測序鑒定后得到重組質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品模板稀釋后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以實(shí)時(shí)監(jiān)測待測樣品中病毒拷貝數(shù)，并求出樣品中病毒的濃度，用于檢測蟲體內(nèi)或生物藥劑內(nèi)EoNPV的絕對(duì)含量。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)根據(jù)茶尺蠖核型多角體病毒的plO基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物核苷酸序列如下EoNPVplOF5'-actgctctgcagcaacaagtcg-3‘；EoNPVplOR5'-gtcgttgacggtggtgctaatc-3，；2)從感染茶尺蠖核型多角體病毒的蟲體中提取茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA，獲取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增得到plO基因片段；3)制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測定其濃度將擴(kuò)增獲得的plO基因片段與載體pMDIS-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，挑單克隆菌株，搖菌；采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序并測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于-20°C冰箱中，備用；重組質(zhì)粒序列如下5’-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacacc3aaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3’；4)熒光定量PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進(jìn)行熒光定量PCR，以其實(shí)模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測尺蠖核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)樣品檢測提取待測樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣品的濃度。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟2)中提取尺蠖核型多角體病毒基因組DNA的方法為以茶尺蠖核型多角體病毒感染茶尺蠖幼蟲，收集蟲尸，以PBS溶液作緩沖液反復(fù)勻漿，緩沖液體積與蟲尸體積比為10l，10000g離心lOmin,重復(fù)3次，上清液即為病毒粗提液；病毒粗提液經(jīng)35000g離心2小時(shí)，沉淀即為經(jīng)純化的病毒粒子；用1XPBS反復(fù)洗滌純化的病毒粒子，至乳白色為止；加入裂解液0.lmol/LNa2C03，0.05mol/LNaCl,pHlO.3裂解多角體l_2h；3000g離心5min，去除其中未裂解的病毒粒子；先用等體積的苯酚氯仿異戊醇=25241的混合液抽提，然后用等體積的氯仿抽提，回收水層；加3mol/LNaAc至終濃度為0.3mol/L，加入2倍體積的冷無水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒將DNA纏出，70%乙醇洗滌，敞口65°C空氣浴蒸發(fā)殘余乙醇，溶于適量IXTE中，4°C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅囊环N茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟2)中PCR擴(kuò)增的程序?yàn)橄?4°C預(yù)變性3min；然后94°C30s,62°C45s；循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟4)中所述的熒光定量PCR反應(yīng)采用20iiL體系質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板2iiL，SYBRPremixExTaqTM(2X)10uL,ROXReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加滅菌雙蒸水至20uL；反應(yīng)程序?yàn)?5°C10s；95°C5s,60°C34s；共40個(gè)循環(huán)，陰性對(duì)照使用滅菌雙蒸水。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟4)中所述的梯度為1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103拷貝/uLo上述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，通過采用熒光定量PCR，與血清學(xué)方法及傳統(tǒng)PCR相比，在病毒檢測上有如下優(yōu)點(diǎn)(1)省時(shí)。熒光定量PCR無需PCR電泳檢測，可以實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，同時(shí)由于擴(kuò)增片段一般在100-200bp，縮短了反應(yīng)時(shí)間，多數(shù)情況下在1.5h左右內(nèi)完成。(2)靈敏度高。熒光定量PCR通過檢測熒光信號(hào)使其具有較高的靈敏性，在本實(shí)驗(yàn)中，熒光定量方法比傳統(tǒng)的血清學(xué)記數(shù)法的靈敏度高1000倍。(3)高通量。該方法可實(shí)現(xiàn)96個(gè)樣本的同時(shí)檢測。(4)可重復(fù)性好。由于熒光定量PCR儀的閉管操作的方式，大大降低了污染和假陽性出現(xiàn)的機(jī)率。本方案不僅能夠使EoNPV的流行病學(xué)的研究微觀化、精確化，還解決了我國在茶尺蠖病毒研究及應(yīng)用中依賴于單一傳統(tǒng)生物測定的問題，實(shí)現(xiàn)了病毒制劑加工和使用的全程監(jiān)控，有效的規(guī)范茶園生物農(nóng)藥市場，保護(hù)茶農(nóng)利益。圖1為plO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1中:1-DL2000Marker；2-plO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為重組質(zhì)粒pMD18T_plO的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖；圖2中1_DL2000Marker；2-重組質(zhì)粒pMD18T_plO的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為EoNPVplO基因擴(kuò)增的熔解曲線圖；圖4為EoNPVPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線圖；圖5為EoNPVplO基因不同稀釋梯度的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、EoNPV病毒樣品的獲得及其基因組DNA的提取以茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)感染茶尺蠖幼蟲，收集100頭染毒蟲尸，以PBS溶液作緩沖液反復(fù)勻漿，緩沖液體積與蟲尸的體積比為10l，10000g離心lOmin，重復(fù)3次，去除沉淀，上清液即為病毒粗提液；病毒粗提液經(jīng)35000g離心12小時(shí)，沉淀即為經(jīng)純化的病毒粒子；用1XPBS反復(fù)洗滌純化的病毒粒子，至乳白色為止；加入0.lmol/LNa2C03,0.05mol/LNaCl,pHlO.3的裂解液5mL，裂解茶尺蠖核型多角體病毒粒子多角體病毒粒子l-2h;3000g離心5min，吸取上清液，去除其中未裂解的茶尺蠖核型多角體病毒粒子；先用等體積的苯酚氯仿異戊醇=25241的混合液抽提，然后用等體積的氯仿抽提，回收水層；加3mol/LNaAc至終濃度為0.3mol/L,加入2倍體積的冷無水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒將DNA纏出，70%乙醇洗滌，敞口65°C空氣浴蒸發(fā)殘余乙醇，溶于適量IXTE中，4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例2、目的片段PCR擴(kuò)增根據(jù)EoNPV基因組序列(NC_008586.1)的plO基因，采用DNAStar軟件，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物EoNPVplOF和EoNPVplOR，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列分別為5’-actgctctgcagcaacaagtcg-3’(見序列表SEQNo.1)和5，-gtcgttgacggtggtgctaatc-3，(見序列表SEQNo.2)，擴(kuò)增plO,PCR反應(yīng)采用25iiL體系(模板21^，10\131^作『2.5uL,dNTP2yL，正反引物各0.5yL，Tag酶0.25yL，加滅菌雙蒸水至25yL)，PCR擴(kuò)增使用兩步法，程序如下先94°C預(yù)變性3min；然后94°C30s,62°C45s；循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。取PCR產(chǎn)物10ul于瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果見圖1，與預(yù)計(jì)大小相一致。最后，用瓊脂糖凝膠DNA試劑盒純化回收擴(kuò)增片段，按說明書操作進(jìn)行。實(shí)施例3、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)的制備及其濃度測定將實(shí)施例2中擴(kuò)增的plO基因片段與載體pMDIS-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，挑單克隆菌株，搖菌。使用試劑盒抽提單菌落質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。與參考序列進(jìn)行比較，確認(rèn)構(gòu)建結(jié)果，構(gòu)建完畢后用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，將1PL陽性質(zhì)粒稀釋100倍測定其0D26(i和0D28(i值，計(jì)算重組質(zhì)粒濃度及0D26(i/0D28Q比例，將重組質(zhì)粒稀釋至10,拷貝/yL，保存于-20°C冰箱中。重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果見圖2，片段大小為120bp，與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果如下5，-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacaccaaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3，。實(shí)施例4、熒光定量PCR反應(yīng)采用20iiL體系模板2iiL，SYBRPremixExTaq(2X)10uL,ROXReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加滅菌雙蒸水至20iiL。反應(yīng)程序?yàn)?5°C10s；95°C5s,60°C34s；共40個(gè)循環(huán)，陰性對(duì)照使用滅菌雙蒸水。熒光定量實(shí)驗(yàn)中的SYBRPremixExTaq(2X)和ROXReferenceDyeII均為Takara公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀型號(hào)為ABIPRISM7500。實(shí)施例5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及其靈敏性將含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍系列稀釋成1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.OX105、1.OX104、1.OX103拷貝/yL的模板，將各濃度標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR熔解曲線分析，結(jié)果見圖3，與預(yù)期完全相符，均為單峰，無非特異性擴(kuò)增，說明反應(yīng)特異，表明該方法有良好的特異性。將以上各濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增的熒光曲線見圖4，表明該方法檢測靈敏度可達(dá)到1.0X103拷貝/i!L。反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)液，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以其實(shí)模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測EoNPV的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，斜率為-2.9369，截距為38.948，R2=0.989，從而可以得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.9369x+38.948。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求出待測樣品的拷貝數(shù)。實(shí)施例6、FQ-PCR重復(fù)性將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)濃度，模板DNA含量為1.0X108、1.0X107、1.0X106拷貝/PL，對(duì)每個(gè)濃度的樣品經(jīng)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，分別重復(fù)3次檢測，批內(nèi)和批間重復(fù)性通過計(jì)算CT值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，濃度為1.0X108、1.0X107、1.0X106拷貝/yL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品其平均CT值分別為15.30、17.43、20.44。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得知，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)分別為0.26、0.18,0.34，變異系數(shù)(CV)分別為1.7%、1.65%、1.01%，證明此方法批間的重復(fù)性良好。表1陽性質(zhì)粒的重復(fù)檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例7、病毒制劑樣本檢測以實(shí)施例5中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為檢測依據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)血清學(xué)方法檢測的EoNPV-BT混合生物農(nóng)藥進(jìn)行檢測，首先將其稀釋成1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.OX104PIB/ml，分別提取基因組，以該基因組為模板按實(shí)施例4中的熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)4種不同濃度的EoNPV-BT樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果所測的CT值呈明顯的梯度分布，分別為14.8,17.2,21.0,24.8，按所建標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到病毒濃度分別為107_2、106_3、105、1038PIB/ml。血清學(xué)方法所測病毒濃度為1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104PIB/ml。兩組病毒樣品檢測數(shù)據(jù)的變異系數(shù)在1.4%3.6%，小于5%。表明用本方案的熒光定量PCR方法與傳統(tǒng)血清學(xué)方法所測結(jié)果基本一致，可用于檢測茶尺蠖核型多角體病毒制劑的EoNPV含量。表2EoNPV病毒樣品檢測結(jié)果血清學(xué)方法檢測熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)樣品號(hào)(Log病毒數(shù))(Log病毒數(shù))SD(CV%)17.07.20.142.0%26.06.30.213.4%35.05.10.071.4%44.03.80.143.6%權(quán)利要求一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)根據(jù)茶尺蠖核型多角體病毒的p10基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物核苷酸序列如下EoNPVp10F5’-actgctctgcagcaacaagtcg-3’；EoNPVp10R5’-gtcgttgacggtggtgctaatc-3’；2)從感染茶尺蠖核型多角體病毒的蟲體中提取茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA，獲取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增得到p10基因片段；3)制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測定其濃度將擴(kuò)增獲得的p10基因片段與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，挑單克隆菌株，搖菌；采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序并測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于-20℃冰箱中，備用；重組質(zhì)粒序列如下5’-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacaccaaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3’；4)熒光定量PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進(jìn)行熒光定量PCR，以其實(shí)模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測尺蠖核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)樣品檢測提取待測樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣品的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟2)中提取尺蠖核型多角體病毒基因組DNA的方法為以茶尺蠖核型多角體病毒感染茶尺蠖幼蟲，收集蟲尸，以PBS溶液作緩沖液反復(fù)勻漿，緩沖液體積與蟲尸體積比為101，10000g離心lOmin，重復(fù)3次，上清液即為病毒粗提液；病毒粗提液經(jīng)35000g離心2小時(shí)，沉淀即為經(jīng)純化的病毒粒子；用1XPBS反復(fù)洗滌純化的病毒粒子，至乳白色為止；加入裂解液0.lmol/LNa2C03，0.05mol/LNaCl，pH10.3裂解多角體l_2h；3000g離心5min，去除其中未裂解的病毒粒子；先用等體積的苯酚氯仿異戊醇=25241的混合液抽提，然后用等體積的氯仿抽提，回收水層；加3mol/LNaAc至終濃度為0.3mol/L，加入2倍體積的冷無水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒將DNA纏出，70%乙醇洗滌，敞口65°C空氣浴蒸發(fā)殘余乙醇，溶于適量1XTE中，4°C保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟2)中PCR擴(kuò)增的程序?yàn)橄?4°C預(yù)變性3min；然后94°C30s,62°C45s；循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟4)中所述的熒光定量PCR反應(yīng)采用20yL體系質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板2uL，SYBRPremixExTaqTM(2X)10uL,R0XReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加滅菌雙蒸水至20iiL；反應(yīng)程序?yàn)?5°C10s；95°C5s,60°C34s；共40個(gè)循環(huán)，陰性對(duì)照使用滅菌雙蒸水。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于步驟4)中所述的梯度為1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103拷貝/yLo全文摘要一種茶尺蠖核型多角體病毒的定量檢測方法，屬生物制劑檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，其特征在于包括以下步驟根據(jù)茶尺蠖核型多角體病毒基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并從感染該病毒的蟲體中提取茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將該基因片段與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，經(jīng)單克隆菌落篩選及測序鑒定后得到重組質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品模板稀釋后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.989，檢測范圍為103～108拷貝/μL，特異性和重復(fù)性較好。該方法可以準(zhǔn)確地判斷出病毒拷貝數(shù)，為茶尺蠖核型多角體病毒在蟲體內(nèi)增殖動(dòng)態(tài)的研究和病毒制劑的質(zhì)量檢測提供了方法依據(jù)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101831508SQ201010185410公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年5月27日優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日發(fā)明者付建玉,唐美君,杜軍利,肖強(qiáng)申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所