專利名稱：水稻種胚特異表達的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及水稻種胚特異表達的啟動子的分離及鑒定。
背景技術：
植物作為真核生物中一大類群，其中有部分植物作為植物界最高等的類群，在生 長發育及繁衍后代的過程中能夠產生種子，被稱之為種子植物。種子在發育過程中主要包 括胚胎發生和種子成熟兩個重要的過程，種子成熟后經脫水進入休眠。植物的生命史中，種 子胚在植物傳宗接代以及植物形態發生和發育中都具有非常重要的作用，胚的發生及發育 直接影響著植物體的繁殖和發育。雖然前人對種子形態學和生理學研究已有一定的進展， 但對種胚特異性基因的分離及功能研究，并在分子水平上闡明種胚發育機制的報道仍較 少。基因正常而有規律的表達保證了真核生物生長發育的正常進行，其中轉錄水平的調控， 是基因表達調控中最有效、最直接的調控，也是近年來分子生物學的研究熱點之一。在此過 程中，啟動子作為基因中一段能準確有效起始轉錄的DNA序列，是最重要的順式元件，它通 常位于基因上游，通過與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子相互作用，從而 能夠調控基因在特定的組織、特定的發育階段以及一定的環境條件下表達。高等植物中啟 動子一般可分為三類，即組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。其中組織特異 性啟動子除具有一般的啟動子結構外，同時還存在幾種控制組織特異性表達的元件，通常 還有增強子和沉默子的一般特性，其表達特異性由這些元件的種類、數目及相對位置等共 同決定。同時，由于植物基因工程研究中也需要具有特異性、高表達的啟動子，從而根據需 要選擇或人工構建帶有合適啟動子的載體，使外源目的基因在植物體內實現特異的高效表 達，或在植物特定的部位或發育階段生產有用蛋白質或其他代謝產物，以實現對外源基因 表達的定時、定點、定量三維精確調控。因此具有植物組織表達特異性的啟動子的分離及鑒 定，也是植物基因工程研究的一個重要方面。鑒于啟動子與功能基因在結構及位置上的相關性，故種胚特異性啟動子的分離及 關鍵順式調控元件的鑒定，不僅是真核生物基因表達調控、種子發育研究的重要內容，也是 尋找相關種胚特異性基因的一種有效途徑。以往的研究中，已經從植物病毒和植物本身分別分離到組成型啟動子，組織專一 性啟動子及誘導型啟動子。其中，從花椰菜花葉病毒分離出來的35S啟動子是目前植物遺 傳操作中最常用的啟動子，該啟動子能較強地啟動基因在雙子葉植物中的表達，但是該啟 動子在單子葉植物中表達相對較弱。同時，研究發現在組成型啟動子的控制下外源基因的 表達存在一些缺陷。如外源基因一般在轉基因植物的所有部位和所有發育階段都會表達， 這樣不但增加了植株的代謝負擔，造成植物能量和養分的浪費，而且往往還會造成轉基因 植物的某些性狀發生改變，影響植物正常的生長發育。而組織特異性啟動子可以控制外源 基因在植物特定組織中高效表達，避免外源基因在植物的其它部位表達，減少對植物的不 利影響。同時，采用分子生物學對農作物進行遺傳改良過程中，人們也常常期望插入的外源基因能夠被限制在特定的組織中表達，從而使植物獲得有用的性狀，這也就要求通過有效 的組織特異性啟動子對靶基因的表達進行調控。近年來，隨著人們對種子特異性啟動子結 構、功能的深入研究，發現了一系列的種子特異性啟動子，為研究種子發育以及獲得外源基 因僅在種子中特異表達的轉基因植物奠定了基礎。如張世平等研究發現水稻醇溶蛋白4a 基因啟動子在轉基因水稻胚乳中特異表達；Hwang等將水稻球蛋白基因啟動子控制的溶菌 酶基因導入水稻中，結果發現，溶菌酶在水稻種子中表達，并且表達的溶菌酶占水稻種子中 全部可溶性蛋白的13%左右；Datta等分離了一個水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子，并 申請了專利保護；Qu等2004年將水稻26kDa的球蛋白啟動子和⑶S報告基因連接后導入水 稻，經檢測GUS基因僅在種子胚乳中表達；Minic等研究發現擬南芥a -阿拉伯糖苷酶基因 啟動子為胚乳特異性啟動子。單子葉植物中的禾本科植物包括許多重要經濟作物如水稻、 高梁、玉米等。目前，陸桂華等從水稻中分離到花藥專一性表達的啟動子，王金發等分離到 一段具有啟動子功能的重復序列。但水稻中高效表達組織特異性啟動子的分離研究工作并 不多。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，亞洲近3/4的人口以日常食用稻米為主。 而研究種子貯藏蛋白表達調控和克隆種子胚特異性啟動子是開展稻米品質分子改良工作 的基礎。對水稻中胚特異性表達的啟動子的功能研究與鑒定，將有利于實現外源基因在轉 基因植物特定組織中高效表達，為開展水稻品質分子改良提供重要手段。

發明內容
本發明提供了一種在水稻種胚中特異表達的啟動子，命名為OsESPl，并通過基因 工程技術研究它在水稻不同組織中表達的特異性。本發明的技術方案是一種在水稻種胚中特異表達的啟動子OsESPl，它是具有 SEQ IDN0. 1中所示核苷酸序列的基因片段。本發明以水稻基因組DNA為模板，該基因組DNA可使用常規手段獲得，以通過啟動 子序列設計的帶有酶切位點Xba UPstl的序列為引物，經過PCR獲得啟動子OsESPl。本發明以水稻為材料，克隆得到水稻種胚中特異表達啟動子OsESPl，將該啟動子 與報告基因GUS構建融合表達載體轉化水稻并獲得相應的轉基因植株，GUS染色顯示僅在 水稻胚中觀察到顯色反應，其他組織中沒有，證明該啟動子特異的在水稻種胚中表達。本發明還提供了一種含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的表達載體，尤其是表達 載體 pCambial301M: OsESPl。本發明通過試驗證明，啟動子特異的在水稻種胚中表達，進而可以應用于水稻或 其它植物育種、改良方面。本發明的有益效果是本發明分離并確定一水稻種胚特異性啟動子OsESPl。該啟 動子位于水稻一號染色體上，由于OsESPl是從水稻中分離出來的啟動子，因此，將該啟動 子應用于水稻的遺傳轉化研究中具有可靠的安全性。同時，從分子水平上解析植物種胚發育的調控機制，不僅有助于闡明植物形態、發 育、代謝途徑等基礎理論，而且可從根本上改良并提高種子品質，增加產量和經濟效益、提 高農業生產效率，具有廣泛的應用價值。


圖1 :PCR得出的片段OsESPl圖，其中M:分子量，泳道1是OsESPl片段，泳道2是 陰性對照。圖2 植物表達載體pCambial301M: OsESPl構建過程示意圖。圖3 通過PCR分子檢測法，對OsESPl轉基因水稻的鑒定結果圖。其中M:分子量； 1 陽性對照；2 陰性對照；3 非轉基因植株；4-8 :T1代轉基因植株。圖4 :GUS組織化學染色法，顯示啟動子特異性的在水稻種胚中表達圖。圖中A 陰 性對照，水稻種胚中無GUS染色后的藍色出現，如箭頭所示；B 陽性轉基因植株T2代種子， 水稻種胚中出現GUS染色后的藍色，如箭頭所示。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步闡述，以下實驗步驟及涉及的培養基均為本領 域常規技術，試劑均為市售產品。實施例1 水稻一號染色體上特異表達的啟動子序列OsESPl的克隆。通過水稻數據庫結合相關基因信息，檢索到水稻一號染色體上基因啟動子序列， 命名為OsESPl。以水稻“中花11”為材料，提取基因組DNA，以此為模板，利用特異性引物通 過 PCR 獲得 OsESPl。1、水稻基因組DNA的提取(1)參照CTAB法，稱取0. 2g新鮮組織或_70°C保存的樣品，在液氮中充分研磨至 粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。(2)將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C )的含有600 u 1CTAB提取液的EP管中， 在65°C中保溫15分鐘，中間混勻2-3次。(3)取出離心管，冷至室溫，lOOOOrpm離心lOmin。(4)用剪好的槍頭吸取上清至一新的EP管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(氯 仿甲醇=24 1 (V/V)，下同)，輕輕顛倒混勻，靜置lOmin，重復操作2_3次。(5)上清移入另一 EP管中，加入2/3體積異戊醇，輕輕顛倒混勻，lOOOOrpm離心 lOmin，棄上清。(6)用75%乙醇洗滌沉淀，50ulRTE溶解，37°C保溫lh。(7)加入350ul的滅菌dd H20,再加400ul的氯仿/異戊醇混勻，lOOOOrpm離心 lOmin。(8)取上清，加入2倍體積(1ml即可)無水乙醇，-20°C沉淀lh，12000rpm離心 lOmin，棄上清。(9) 75%乙醇洗滌沉淀2-3次，干燥后溶于50_100uldd H20。2、以水稻中提取的基因組DNA為模板，通過啟動子的序列設計帶有合適酶切位點 (XbaUPstl)的引物，通過PCR獲得啟動子片段OsESPl。(1)引物序列為0sESPl-F(SEQ ID NO. 2) 5’GCTCTAGATATGGAATTACAAGGACAGC-3’ (下劃線Xbal 識別序列)；0sESPl_R(SEQ ID NO. 3) 5’ -AACTGCAGAGAGGGCAGAGAAAGAATGC-3’ (下劃線Pstl識別序列)。(2) PCR 反應體系:Taq 酶緩沖液(含有 Mg2+) 5u 1, dNTP (2. 5mM)3u 1, OsESP-F 弓 |物、OsESP-R引物(lOiiM)各liil，水稻DNA4iU，Taq酶(博大泰克公司產)0. 5 yl，加滅 菌雙蒸水至50iU。(3)PCR 反應程序98 °C 10min，94 °C lmin，58 °C 30s, 72 °C lmin，35 個循環， 72 °C 10min，4°C保存。取5 yl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果，有一 1500bp左右的條 帶，結果如圖1所示。3、0sESPl啟動子片段的回收。電泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收產物片段，步 驟如下(1)將凝膠放在紫外燈下用干凈的刀片將條帶切下，裝入滅菌的離心管中，稱取膠 的重量，每個管中膠的重量不能超過300mg。(2)按lOOmg膠加700 u 1溶膠液的比例，室溫溶膠(或55°C溶膠)，其間偶爾搖 動；裝柱，9000rpm，離心30s ；去掉廢液。(3) 500 u 1漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm離心30s。重復漂洗一次。倒掉 廢液以后，再于12000rpm離心2min ；(4)將柱子放入一個新的1. 5ml離心管中，在柱子膜中央加入合適體積的洗脫緩 沖液(Eloution buffer，通常用 30 ii 1-50 u 1)，室溫放置 2_5min，12000rpm離心 lmin，離心 管中的液體即為回收的DNA片段。實施例2 :0sESPl表達載體的構建(圖2)。1、商業化的表達載體pCambial301質粒經Hind III與Nco I雙酶切，將載體報告基 因⑶S之前的組成型啟動子CaMV35S切除，改造后的載體命名為pCambia1301M。雙酶切體系為pCambial301 質粒 15 illHind III2 u 1Nco I2u 1lxM 緩沖液5 u 1加水至50 ii 1，37°C 酶切 3h。2、Xbal、Pstl酶切改造后獲得的pCambial301M質粒，37°C酶切3h。雙酶切體系 為pCambial301M 質粒 15ii 1Xba12 illPst12u 1lxM 緩沖液5 u 1加水至50 U 13、Xbal、Pstl酶切啟動子OsESPlPCR產物，雙酶切體系同實施例2. 2。4、將兩個回收片段用T4連接酶連接，構建成OsESPl表達載體 pCambial301M: :0sESPl。連接體系如下a、回收的 OsESPlDNA 片段7 u 1b、pCambial301M 載體片段 1 u 1c、T4DNA 連接酶liil
d、T4DNA連接酶緩沖液1 P 1將上述a、b、c、d反應物混勻，16°C反應過夜，用于轉化大腸桿菌DH5a。5、大腸桿菌感受態細胞的制備。(1)挑取E. coil DH5 a單菌落接種到5ml的LB液體培養基，于37°C，250rpm震蕩 培養過夜。(2)次日將此菌液以的接種量轉移至100ml的液體培養基中，繼續培養至吸光 度(OD)600 = 0. 4-0.6。(3)將此菌液冰浴lOmin，在無菌條件下轉移至預先冰冷的50ml離心管中，4°C， 5000rpm離心lOmin，收集菌體。(4)重懸于 10ml 預冷的 0. lmol/L 的 CaCl2 中，冰浴 lOmin, 4 °C，5000rpm 離心 lOmin，收集菌體。(5)重懸于2ml (含15%甘油)的預冷的0. lmol/L的CaCl2中，分裝成100 yl/ 管，-70°C保存備用。6、轉化。(1)從-70°C冰箱取出感受態細胞置于冰上溶解。(2)將OsESPl與載體pCambial301M的連接產物5 u 1加至感受態細胞中，充分混 勻，冰上放置30min。(3) 42°C熱激90s，在此過程中不要晃動離心管。(4)熱激完畢后立即取出放于冰上2min。(5)加入 800 ill 的 LB 液體培養基，37 °C，200rpm 孵育 lh。(6)將菌液涂布在卡那(Kan)抗性的LB固體平板上，37°C培養12h。(7)將平板放入4°C保存。7、陽性克隆的菌液PCR檢測。(1)從轉化的平板上挑取白色菌落接種到LB液體培養基中，37°C，250rpm震蕩培 養 3-4h。(2) PCR 反應體系:Taq 酶緩沖液(含有 Mg2+) 2. 5u 1, dNTP (2. 5mM) 1 u 1, OsESPl-F 引物、OsESPl-R引物(10iiM)各liU，菌液2iU，Taq酶(博大泰克公司產)0. 3 yl，加滅 菌雙蒸水至25iU。(3) PCR 反應程序98 °C 10min，94 °C lmin，58 °C 30s, 72 °C lmin，35 個循環， 72 °C 10min，4°C保存。取5 yl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果，有一 1500bp左右的條
市o8、質粒的提取。(1)將菌液PCR陽性的菌液于37°C，250rpm震蕩培養過夜。(2)將菌液轉移到離心管中，室溫8000rpm離心2min，收集菌體。(3)倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，使殘余的液體流出。(4)加入100 yl預冷的溶液I，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，其中所述溶 液 I 配方為:50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0) U0mmol/L EDTA (pH8. 0)。(5)加入200 u 1新鮮配制的溶液II，快速顛倒混勻10次，冰浴5min，其中所述溶 液 II 配方為0. 2mol/LNa0HU% SDS。
(6)加入150 u 1預冷的溶液III，溫和地顛倒10次，冰浴5min,4°C 12000rpm離心 lOmin，其中所述溶液III配方為:5mol/L乙酸鉀60ml、3mol/L冰乙酸11. 5ml、H2028. 5ml、 pH5. 2。(7)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積 比為 25 24 1)，反復混勻，4°C 12000rpm 離心 lOmin。(8)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為 24 1)，反復混勻，4°C 12000rpm 離心 lOmin。(9)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積預冷(-20°C )的異丙醇，混勻 后-20°C沉淀 lh，4°C 12000rpm 離心 lOmin。(10)倒掉上清，加入500 u 170%的乙醇洗滌沉淀兩次，空氣中干燥。(11)加入適當體積的TE溶液和2 u lRNaseA，37°C消化0. 5h。9、pCambial301M: :0sESPl雙元表達載體的酶切檢測。(l)XbaUPstl對質粒進行雙酶切檢測，反應體系如下質粒3 U 1Xba10. 5 u 1Pst10. 5u 1lxM 緩沖液1.5 ill加水至15 ill(2) 37°C酶切2h，取10 yl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條1500bp左右的條
市o10、序列測定。以上步驟中獲得的陽性克隆pCambia1301M: :0sESPl由山東省農科院高新技術研 究中心測序，序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例3 :pCambial301M: :0sESPl植物表達載體轉化農桿菌。1、農桿菌感受態細胞的制備。(1)挑取單菌落(EHA105)接種到約3ml的YEB液體培養基中，于28°C，220rpm震 蕩培養至0D6(1(1 = 0.5。(2)吸取1. 5ml菌液于離心管中，冰浴lOmin。(3) 5000rpm離心30S，棄去上清液。(4)沉淀用 1. 5ml0. 5M NaCl 懸浮，冰浴 20min。(5) 5000rpm離心30S，棄去上清液。(6)每管用100ia20mM CaCl2懸浮，用于轉化，_70°C保存備用。2、DNA直接轉化農桿菌。(1)50 ill農桿菌感受態細胞中加入pCambial301M: :0sESPl表達載體質粒DNA 0. 1-1118(5-10111)，之后冰浴30111土11。(2)放入液氮中5min (或lmin)然后立即放入37°C水浴鍋中水浴5min。(3)取出離心管，加入0.5ml的YEB，于28°C，220rpm震蕩培養3至5小時。(4)取出菌液涂布于含有相應抗生素的YEB平板上，28 V下倒置培養2天左右菌落 可見。
3、陽性農桿菌鑒定。(1)挑取農桿菌單菌落，接種于含有相應抗生素的YEB液體培養基中，28°C震蕩培 養過夜。(2)菌液PCR鑒定步驟同實施例2-6。實施例4 農桿菌介導水稻遺傳轉化。一、以水稻成熟胚為材料誘導愈傷組織。1.消毒取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消1)將種子放入100ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒1分鐘；2)倒去酒精，加入100ml30%次氯酸鈉(NaCIO)溶液，浸泡30分鐘；3)倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘。2.誘導與繼代培養(以下步驟需無菌操作)1)種子放在無菌濾紙上吸干，置成熟胚于誘導培養基中，每皿12-14顆；2)操作完畢用封口膜(Micropore Surgical Tape)封好培養皿，在30°C光照培 養箱，培養4周；3)在超凈工作臺上打開培養皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色， 致密呈球狀)，置入繼代培養基中，在30°C光照培養箱，繼代培養1-2周。(沒有脫落的可在 原培養基上繼續培養)。二、農桿菌培養。挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌(EHA105)菌液100 ill于4ml YEP (含 50mg/lSpec 和 50mg/l Str)培養液中，28 °C，250rpm 振蕩培養 20_36h 至菌液 0D6(1。為 0. 8-1. 0。三、感菌與共培養。1)取培養好的菌液1ml于1. 5ml離心管中，4°C，5000rmp，離心lmin，去上清。用 含200 u mol/LAs的30ml AAM感菌液制成懸浮液。2)將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農桿菌懸浮液侵染5分鐘，愈傷量 沒過50ml離心管錐形部位即可。3)將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40分鐘；4)將愈傷組織置于共培養基上(上面墊上一層9cm無菌濾紙)。25°C (組培室) 暗培養2. 5天。四、抗性愈傷組織的篩選。將愈傷組織取出，用無菌水清洗6次，其間需不停的振蕩。再用含500mg/l羧芐青 霉素(Car)的無菌水浸泡lh。最后置于無菌濾紙上浙干2小時。第一輪篩選將晾干的愈傷轉入含250mg/L羧芐青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的 選擇培養基上進行第一輪選擇，30°C，光照培養箱中培養14天；將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到含250mg/l羧芐青霉素(Car)和50mg/ 了潮霉 素的培養基上進行第二輪選擇，30°C，光照培養箱中培養10天，然后轉移到組培室中培養4 天。
將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到含250mg/l羧芐青霉素(Car)和50mg/l潮霉素 的培養基上進行第三輪選擇，30°C，光照培養箱中培養21天。五、抗性愈傷組織的誘導分化和生根。挑取顏色鮮黃的抗性愈傷移入裝有分化培養基的培養皿或塑料廣口瓶中，用封口 膜封好，放入恒溫培養室中，等待分化成苗(30天左右)。待苗長至lcm左右，放入生根培養
基中壯苗。六、轉基因苗的鍛煉和移栽。轉基因苗從分化到移栽最短時間為兩至兩個半月。將苗根部和莖葉分化得較完好 的試管挑出，打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水，煉苗3天至一周，然后洗去瓊脂，移栽 到溫室的土缽中生長，檢測。實施例5 陽性轉基因水稻植株的鑒定。1、植物基因組DNA的簡易提取，步驟同實施例1-1。2、以上述簡易法提取的植物基因組DNA為模板，以實施例1-2_(2)中RT-PCR引物 進行PCR，擴增出相應大小特異條帶的為T1代轉基因株系，如圖3所示。3、獲得的T1代水稻種子，經抗性篩選及分子鑒定，獲得T2代轉基因植株，進一步 獲得T2代種子，以之為材料進行種子胚GUS染色分析。實施例6 ⑶S染色分析。對經PCR方法鑒定為陽性的轉基因株系，進一步進行T1代及T2代篩選，對陽性植 株進行GUS活性檢測，將準備好的水稻根、莖、葉、小穗、種子等組織浸泡在GUS染液里，37°C 保溫過夜。用75%乙醇脫色至陰性對照為白色，于顯微鏡下觀察染色結果，照相并記錄，結 果如圖4所示。圖4顯示啟動子特異性的在水稻種胚中表達。
權利要求
一種水稻種胚中特異表達的啟動子，它是具有SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的片段。
2.一種含有權利要求1的啟動子的表達載體。
3.一種含有權利要求1的啟動子的表達載體pCambial301M: :0sESPl。
4.如權利要求1所述的啟動子在水稻或其它植物育種、改良方面的應用。
5.權利要求1所述水稻種胚中特異表達的啟動子的獲取方法，其特征是，水稻基因組 DNA為模板，該基因組DNA可使用常規手段獲得，以通過啟動子序列設計的帶有酶切位點 XbaUPstl的序列為引物，經過PCR獲得啟動子OsESPl。
全文摘要
本發明公開了水稻種胚特異表達的啟動子OsESP1及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明主要是分離出水稻一號染色體上特異在種胚中表達的啟動子序列OsESP1，利用遺傳學、分子生物學的方法進一步對該啟動子序列進行深入、細致的分析，對其表達模式做進一步的驗證，證明啟動子OsESP1僅在種胚中特異性表達，為開展水稻品質改良及分子育種提供重要手段。
文檔編號C12N15/113GK101875936SQ20101022157
公開日2010年11月3日 申請日期2010年7月8日 優先權日2010年7月8日
發明者任怡怡, 劉煒, 姚方印, 房孝良, 李海青, 李臻, 王慶國, 黃聰 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心