專利名稱：水稻種胚特異表達的基因OsESG1、克隆方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及水稻種胚特異表達的基因OsESGl、克隆方法及應用。
背景技術：
植物作為真核生物中一大類群，其中有部分植物作為植物界最高等的類群，在生長發育及繁衍后代的過程中能夠產生種子，被稱之為種子植物。種子在發育過程中主要包括胚胎發生和種子成熟兩個重要的過程，種子成熟后經脫水進入休眠。植物的生命史中，種子胚在植物傳宗接代以及植物形態發生和發育中都具有非常重要的作用，胚的發生及發育 直接影響著植物體的繁殖和發育。胚的發育主要包括胚胎的形成和胚的成熟。植物的胚胎發育過程在分子水平上受到一系列基因的精確調控，從受精卵被激活開始，胚的發育經過細胞分裂與分化、細胞命運的決定、胚體發育模式的形成、器官的發生等過程，最終形成成熟胚。研究表明，FACl、GRP23、RSH、YODA等基因都參與了早期胚胎發育的調控過程。在種胚基因表達調控網絡研究中，對基因及其所編碼蛋白產物的研究構成了其中一個必要組份。國內外相關研究結果顯示，目前大約有四十多個與胚發育相關的種胚特異表達基因被克隆，它們涉及了胚發育過程中細胞有絲分裂和胞質分裂、器官發生、信號轉導和代謝以及表觀遺傳調控等方面，這些基因的克隆及相關研究大大促進了人們對植物胚形成機理的了解。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，已分離和鑒定了一些影響胚胎形成的基因,例如LEC2 (Leafy Cotyledon 2)、GN0M、M0N0PTER0 和 FACKE 等。LEC2 編碼一個含 B3 區域(植物特有的一種DNA結合基序)的轉錄調控因子，它控制胚發育的正確啟動，在胚發育早期和后期均大量表達。GNOM基因編碼鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，它作用于ADP核糖基化因子(ARF)-G型蛋白，影響合子第一次分裂。與正常合子第一次不對稱分裂相反，GNOM基因突變體的受精卵第一次分離是對稱的，表現出頂端-基部極性(apical-basal polarity)缺陷型，沒有根和下胚軸。MONOPTEROS(MP)基因編碼一種含DNA結合域的蛋白質，它影響胚中維管組織和胚體模式的建立。FACKEL基因的產物是參與脂類生物合成的一種固醇還原酶(sterol C_14reductase),它影響發育中胚細胞的分裂、擴展和有序排列。FACKEL基因突變特異地減少了下胚軸形成，使得胚根幾乎貼到子葉上。然而，至今在水稻中有關種胚特異性基因功能研究仍較少。本發明在水稻中成功克隆到一個表達特異的基因，其僅在水稻種胚中表達，而在其他組織中未檢測到其表達，故將該水稻種胚特異表達基因命名為OsESGl (Oryzo Sativa Embryo Specific Genel),該基因的克隆為進一步解析胚特異基因在水稻生長及種子發育過程中的作用提供了良好的材料。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，亞洲近3/4的人口以日常食用稻米為主。而研究調控種胚發育的特異基因是開展稻米品質分子改良工作的基礎。對水稻種胚特異性基因的分離及功能研究與鑒定，將有利于揭示水稻種子發育調控機理，最終通過控制胚特異基因的表達影響種子的發育，對水稻的生長發育進行設計育種，為培養高品質的水稻品種、開展水稻品質分子改良提供了重要手段。而且對水稻種胚特異基因的研究對指導農作物生產、改造農作物的品質和抗逆性以及農產品的貯存和運輸都具有重要的指導作用
發明內容
本發明提供了一種在水稻種胚中特異表達的基因，命名為OsESGl，并通過分子生物學研究它在水稻種子胚發育過程中的功能。本發明的技術方案是一種在水稻種胚中特異表達的基因OsESGl，它是具有SEQIDN0. I中所示核苷酸序列的基因片段。本發明以水稻基因組DNA為模板，該基因組DNA可使用常規手段獲得，以通過基因序列設計的帶有酶切位點Kpnl、BamH I的序列為引物，經過PCR獲得基因OsESGl ;所述引物序列為OsESGl-F(SEQ ID NO. 2) :5’ -GGGGTACCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’ ；OsESGl-R(SEQ ID NO. 3) :5’ -CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ ；PCR 反應體系=Taq 酶緩沖液(含有 Mg2+) 5u I, dNTP (2. 5mM)3u I, OsESGl-F 引物(IOuM)Iu I, OsESGl-R 引物(10iiM)liiljjagDNA4ia，Taq 酶 0. 5 yl，加滅菌雙蒸水至50ul ；PCR 反應程序98 0C IOmin, 94 °C Imin, 56 °C 30s, 72 °C 2. 5min，35 個循環，720C IOmin。本發明以水稻為材料，通過RT-PCR的方法驗證了基因OsESGl在水稻各組織中的表達情況，結果顯示，基因OsESGl僅在水稻種胚中表達，而在其他組織中不表達；同時對基因OsESGl在種子發育各階段種胚中表達強度分析發現，該基因隨著種子的成熟在種胚中表達量逐漸升高。本發明以商業化的載體pCambial301為骨架，經EcoR I、KpnI雙酶切后，與經EcoR
I、KpnI雙酶切的CaMV 35S啟動子片段連接，改造后的載體命名為pCambial301P。本發明還提供了含有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的基因OsESGl正義、反義表達載體，其中基因OsESGl以5’到3’方向構建入表達載體pCambial301P獲得正義表達載體，命名為為pCambial301P: :0sESGl、基因OsESGl以3’到5’方向構建入表達載體pCambial301P 獲得反義表達載體，命名為 pCambial301P: :A0sESGl。本發明以水稻為材料，克隆得到水稻種胚特異表達基因OsESGl，將該基因與載體pCambial301P連接構建正反義植物表達載體，轉化水稻并獲得轉基因植株，經潮霉素抗性篩選結合分子鑒定，獲得陽性轉基因植株。本發明對獲得的轉基因植株進行表型分析，結果顯示=OsESGl正義表達載體的轉基因植株命名為OsESGl，其種子在萌發時，其胚芽及胚根的萌出及生長均晚于野生型對照的種子，且在進一步生長的過程中，子葉及根的長度均短于對照，且主根上幾乎沒有側根伸出，顯示OsESGl在調控水稻生長及種胚發育中具有作用；本發明進一步對根部延伸區進行切片觀察顯示，轉基因植株的側根原基較對照的有所減少，且相同部位的轉基因水稻幼苗的根部細胞雖然排列比較規則，但細胞列數比對照多，且細胞體積較小，顯示基因可參與胚中細胞分裂過程，通過影響細胞的體積及大小，進而影響植物組織器官發生、發育。而OsESGl反義表達載體的轉基因植株命名為AOsESGl，其種子在萌發時，其胚芽及胚根的萌出早于野生型對照的種子，且后期根及子葉生長發育好于野生型對照，植株整體發育良好。該方面的功能可進一步應用于水稻或其它植物生長及發育調控的相關研究。本發明的有益效果是本發明分離并克隆了一水稻種胚特異性基因OsESGl。該基因位于水稻一號染色體上。同時通過研究發現基因OsESGl僅在水稻種胚中表達，且該基因隨著種子的成熟在種胚中表達量逐漸升高。本發明對獲得的OsESGl正義及反義表達載體的轉基因植株進行表型分析，結果顯示該基因可參與胚中細胞分裂過程，通過影響細胞的體積及大小，進而影響植物組織器官發生、發育。該方面的功能可進一步應用于水稻或其它植物胚發生及根部發育調控相關研究。不僅有助于闡明植物形態、發育、代謝途徑等基礎理論，而且該基因可應用于調控種子根部發育，對改變種子生長特性及品質具有一定的應用價值。


圖I :PCR獲得片段OsESGl電泳圖，其中M :分子量，泳道I是OsESGl片段，泳道2是陰性對照。圖2 RT-基因OsESGl在水稻各組織的表達特性研究圖示。其中I :根；2 :莖；3 葉；4 :胚乳；5 :胚。圖3 =RT-PCR對基因OsESGl在種子發育各階段種胚中表達強度分析圖。其中I :乳熟期；2 :蠟熟期；3 :完熟期；4 :枯熟期。圖4 :植物表達載體 pCambial301P: :OsESGl 和 pCambial301P: :AOsESGl 的構建過程不意圖。圖5 :通過PCR分子檢測法，對OsESGl正義、反義轉基因水稻的鑒定結果圖。其中M :分子量；1-3 =T0代OsESGl植株；4-5 =T0代AOsESGl植株；6 :陽性對照；7 :陰性對照。圖6 :對獲得的T1代水稻種子進行40ug/ml潮霉素抗性篩選，以野生型水稻種子為對照。其中I :對照種子經40ug/ml潮霉素處理；2 :未經處理的對照種子；3 :經40ug/ml潮霉素處理的OsESGl的T1代種子(株系I) ；4 :經40ug/ml潮霉素處理的AOsESGl的T1代種子(株系2)。圖7 :對OsESGIT1代種子萌發性試驗顯示，轉基因種子胚芽及胚根的萌出及生長均晚于野生型對照的種子，且在萌發后生長4-6天后，轉基因種子子葉及根的長度均短于對照，且轉基因種子主根上幾乎沒有側根伸出。圖8 :根部延伸區進行切片觀察，OsESGl植株的側根原基較對照的有所減少。I :對照；2 :轉基因材料。箭頭所示為側根原基。圖9 :相同部位的OsESGl水稻幼苗的根部細胞雖然排列比較規則，但細胞列數比對照多，且細胞體積較小。I :對照；2 =OsESGl植株。圖10 JtAOsESGl植株T1代種子萌發性試驗顯示，轉基因種子胚芽及胚根的萌出早于野生型對照及OsESGl種子。圖11 :萌發后生長4天后，AOsESGl種子子葉及根的生長均好于對照及OsESGl種子。圖12 :萌發后生長6天后，AOsESGl種子子葉及根的生長均好于對照及OsESGl種
子。 圖13 :相同部位的AOsESGl水稻幼苗的根部細胞雖然排列比較規則，但細胞體積較大。I :對照；2 =AOsESGI材料。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步闡述，以下實驗步驟及涉及的培養基均為本領域常規技術，試劑均為市售產品。實施例I :水稻一號染色體上特異表達的基因序列OsESGl的克隆。通過水稻數據庫結合相關基因信息，檢索到水稻一號染色體上基因序列，命名為OsESGl0以水稻“中花11”為材料，提取基因組DNA，以此為模板，利用特異性引物通過PCR獲得 OsESGl。
I、水稻基因組DNA的提取(I)參照CTAB法，稱取0. 2g新鮮組織或_70°C保存的樣品，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。(2)將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C )的含有600 U I CTAB提取液的EP管中，在65°C中保溫15分鐘，中間混勻2-3次。(3)取出離心管，冷至室溫，IOOOOrpm離心lOmin。(4)用剪好的槍頭吸取上清至一新的EP管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿甲醇=24 : I (V/V)，下同)，輕輕顛倒混勻，靜置lOmin，重復操作2_3次。(5)上清移入另一 EP管中，加入2/3體積異戊醇，輕輕顛倒混勻，IOOOOrpm離心IOmin,棄上清。(6) 75%乙醇洗滌沉淀2-3次，干燥后溶于50_100uldd H2O02、以水稻中提取的基因組DNA為模板，通過基因的序列設計帶有合適酶切位點(KpnU BamH I)的引物0sESGl_F、OsESGl-R，通過PCR獲得用于構建正義載體的基因5’至3’方向的片段，命名為OsESGl。同時設計帶有合適酶切位點(KpnUBamH I)的引物AOsESGl-F、AOsESGl-R，通過PCR獲得用于構建反義載體的基因3’至5’方向的片段，命名為 AOsESGl。(I)引物序列為0sESGl-F(SEQ ID NO. 2) 5，-GGGGTACCGCAATGATACTCMCGTGATC-3’(下劃線Kpn I 識別序列)；0sESGl-R(SEQ ID NO. 3) 5，-CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ (下劃線BamH I 識別序列)。AOsESGl-F (SEQ ID NO. 4) 5，-GGGGATCCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’(下劃線BamH I 識別序列)；A0sESGl_R(SEQ ID NO. 5) :5，-CGGGTACCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’(下劃線Kpnl 識別序列)。(2) PCR 反應體系:Taq 酶緩沖液(含有 Mg2+)5iil，dNTP (2. 5mM)3u I, OsESGl-F/AOsESGl-F 引物(IOiiM)Iii I、0sESGl-R/A0sESGl-R 引物(10 y M) I y 1，水稻 DNA 4u I, Taq酶(博大泰克公司產)0. 5 iil，加滅菌雙蒸水至50iU。(3) PCR 反應程序98 °C I Omin, 94 °C lmin，56°C 30s, 72 °C 2. 5min，35 個循環，72 °C 10min，4°C保存。取5 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果，有一 2200bp左右的條帶，結果如圖I所示。3、PCR擴增基因片段的回收。電泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收PCR產物片段，步驟如下
(I)將凝膠放在紫外燈下用干凈的刀片將條帶切下，裝入滅菌的離心管中，稱取膠的重量,每個管中膠的重量不能超過300mg。(2)按IOOmg膠加700 U I溶膠液的比例，室溫溶膠(或55°C溶膠)，其間偶爾搖動；裝柱，9000rpm,離心30s ;去掉廢液。(3) 500 V- I漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm離心30s。重復漂洗一次。倒掉廢液以后，再于12000rpm離心2min ；(4)將柱子放入一個新的I. 5ml離心管中，在柱子膜中央加入合適體積的洗脫緩 沖液(Eloution buffer,通常用 30 u 1-50 U I),室溫放置 2_5min, 12000rpm離心 Imin,離心管中的液體即為回收的DNA片段。實施例2 :基因OsESGl在水稻不同組織的表達模式分析及在種子不同發育時期的表達模式分析。一、基因OsESGl在水稻不同組織的表達模式分析I、植物中RNA的提取(I)參照CTAB-LiCl法，稱取0. 2g新鮮組織或_70°C保存的樣品，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。(2)將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C )的含有600 U I CTAB提取液的EP管中，立即劇烈渦旋振蕩30s，使其混勻。(3) 65°C水浴2-5min，期間劇烈渦旋振蕩3_5次。(4)稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩lmin，混勻，4°C，12000rpm離心 15min。(5)將上清轉移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。(6)在加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩Imin，混勻，4 °C，12，OOOrpm離心15min。(7)將上清轉移到另一新的EP管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M，4 °C過夜沉淀。(8) 4°C, 12000rpm 離心 20min,棄上清。(9)分別用70%乙醇，無水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50微升DEPC-H2O,溶解沉淀。2、單鏈cDNA的獲得及表達模式分析以水稻的根、莖、葉、胚乳、胚的RNA為材料,利用PrimeScript 1st Strand cDNASynthesis Kit (TaKaRa)試劑盒反轉錄成單鏈cDNA,用于之后的RT-PCR。以Actin 為體系內標，引物序列為LP1 :5' -GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3 ' (SEQID NO. 6) ;LP2:5' -ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3' (SEQ ID NO. 7)。用于OsESGl 半定量的引物為 OsESGI-RTF :5’ -TACTACTAGATGCAGAGITCTGC-3’ (SEQ ID NO. 8)、0sESGl-RTR :5’-AACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ (SEQ ID NO. 9) ;PCR 反應條件為94°C 4min ;之后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，共進行 35 個循環；最后 72°C lOmin,反應結束后，對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示=OsESGl僅在水稻的胚中表達，而在水稻的根、莖、葉、胚乳中沒有表達。(如圖2所示)。二、基因OsESGl在水稻種子不同發育時期的表達模式分析I、植物中RNA的提取
水稻種子成熟過程又分為乳熟期，蠟熟期，完熟期，枯熟期，分別取這四個時期的水稻種胚，按照與實施例2( — )相同的方法提取不同時期種胚的總RNA。2、表達模式分析以Actin為體系內標，分析OsESGl在種子成熟四個時期中的表達模式。用于OsESGl 進行RT-PCR 的引物同實施例 2 (—)2 中(SEQ ID N0.8 和 SEQ ID NO. 9)，RT-PCR 反應條件為94°C 4min、之后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，共進行 35 個循環；最后 72°C IOmin0反應結束后，對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果顯示基因OsESGl在各個時期的表達量逐步升高，在種子成熟的后期達到最高，推測該基因在種子成熟的過程中起重要作用。(如圖3所示)。 實施例3 =OsESGl正義、反義植物表達載體的構建(圖4)。l、EcoR I、KpnI 雙酶切商業化的載體 pCambial301,37°C酶切3h。雙酶切體系為
pCambial301 質粒 15|il EcoR I2|il
Kpn I2|il
IxK緩沖液5|il
加水至50 |il2、EcoR I、KpnI 雙酶切 CaMV 35S 啟動子片段，37°C酶切3h。雙酶切體系為
CaMV35S啟動子片段 15|il EcoR I2|il
Kpn I2|il
IxK緩沖液5|il
加水至50 |il3、經EcoR I、KpnI雙酶切的pCambial301載體片段與CaMV 35S啟動子片段用T4連接酶連接，構建表達載體pCambial301P。連接體系如下a、回收的 pCambial301 載體片段 I U Ib、CaMV 35S 啟動子片段7C、T4DNA 連接酶Iyld、T4DNA連接酶緩沖液I U I將上述a、b、C、d反應物混勻，16°C反應過夜，用于轉化大腸桿菌DH5 a。4、Kpn I、BamHI 雙酶切 pCambial301P 質粒。37°C酶切3h。雙酶切體系為
pCambial301P 質粒 15|il BamHl2|il
Kpn I2|il
IxK緩沖液5|il
加水至50 |il 5、Kpn I、BamH I分別酶切PCR獲得的基因5’至3’方向片段OsESGl及基因3’至5’方向片段AOsESGl，雙酶切體系同實施例3. I。6、將基因與載體的回收片段用T4連接酶連接，構建成OsESGl的正義表達載體pCambial301P: :0sESGl、反義表達載體 pCambial301P: :A0sESGl。連接體系如下a、回收的 OsESGl/AOsESGlDNA 片段 I U Ib、pCambial301P 載體片段IulC、T4DNA 連接酶Iyld、T4DNA連接酶緩沖液I U I將上述a、b、C、d反應物混勻，16°C反應過夜，用于轉化大腸桿菌DH5 a。7、大腸桿菌感受態細胞的制備。(I)挑取E. coil DH5 a單菌落接種到5ml的LB液體培養基，于37°C，250rpm震蕩培養過夜。(2)次日將此菌液以I %的接種量轉移至IOOml的液體培養基中，繼續培養至吸光度(OD)600 = 0 . 4_0. 6。(3)將此菌液冰浴lOmin，在無菌條件下轉移至預先冰冷的50ml離心管中，4°C，5000rpm離心lOmin,收集菌體。(4)重懸于 IOml 預冷的 0. lmol/L 的 CaCl2 中，冰浴 lOmin, 4 °C, 5000rpm 離心IOmin,收集菌體。(5)重懸于2ml (含15%甘油)的預冷的0. lmol/L的CaCl2中，分裝成100 yl/管，-70°C保存備用。8、轉化。(I)從_70°C冰箱取出感受態細胞置于冰上溶解。(2)將OsESGl/AOsESGl與載體pCambial301P的連接產物5 U I加至感受態細胞中，充分混勻，冰上放置30min。(3) 42°C熱激90s，在此過程中不要晃動離心管。(4)熱激完畢后立即取出放于冰上2min。(5)加入 800 ill 的 LB 液體培養基，37 V，200rpm 孵育 Ih0(6)將菌液涂布在卡那(Kan)抗性的LB固體平板上，37°C培養12h。(7)將平板放入4°C保存。9、陽性克隆的菌液PCR檢測。(I)從轉化的平板上挑取白色菌落接種到LB液體培養基中，37°C，250rpm震蕩培養 3-4h。(2) PCR 反應體系=Taq 酶緩沖液(含有 Mg2+) 2. 5u I, dNTP (2. 5mM)lu I, OsESGl-F/AOsESGl-F 引物(IOuM)Iu l、0sESGl_R/A OsESGl-R 引物(IOuM)Iu 1，菌液2^1 I, Taq 酶(博大泰克公司產)0.3 iil，加滅菌雙蒸水至25iU。(3) PCR 反應程序98 °C I Omin, 94 °C lmin，56 °C 30s，72 °C 2. 5min，35 個循環，72 °C 10min，4°C保存。取5 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果，有一 2200bp左右的條帶。10、質粒的提取。(1)將菌液PCR陽性的菌液于37°C，250rpm震蕩培養過夜。(2)將菌液轉移到離心管中，室溫8000rpm離心2min，收集菌體。(3)倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，使殘余的液體流出。(4)加入IOOiU預冷的溶液I，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，其中所述溶液I配方為50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)、10mmol/L EDTA (pH8. O)。(5)加入200 u I新鮮配制的溶液II，快速顛倒混勻10次，冰浴5min，其中所述溶液II配方為0. 2mol/L NaOH, I % SDS (十二烷基硫酸鈉)。(6)加入150 V- I預冷的溶液III，溫和地顛倒10次,冰浴5min,4°C 12000rpm離心lOmin,其中所述溶液III配方為5mol/L乙酸鐘60ml、3mol/L冰乙酸11. 5ml、H20 28. 5ml、pH 5. 20(7)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比為 25 24 1)，反復混勻，4°C 12000rpm 離心 lOmin。(8)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為24 : I),反復混勻，4°C 12000rpm 離心 lOmin。(9)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積預冷(_20°C )的異丙醇，混勻后-20°C沉淀 lh, 4°C 12000rpm 離心 IOmin0(10)倒掉上清，加入500 U I 70%的乙醇洗滌沉淀兩次，空氣中干燥。(11)加入適當體積的TE溶液和2 U I RNaseA, 37°C消化0. 5h。ll、pCambial301P: :OsESGl、pCambial301P: :AOsESGl 雙元表達載體的酶切檢測。(I) KpnI、BamHI對質粒進行雙酶切檢測，反應體系如下
質粒3|il
BamHl0.5|il
Kpn I0.5|il
IxK緩沖液 1.5|il 加水至15 |il(2)37°C酶切2h，取IOiU進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條1500bp左右的條帶。
12、序列測定。
以上步驟中獲得的陽性克隆pCambial301P: :OsESGU pCambial301P: :AOsESGl 由山東省農科院聞新技術研究中心測序，序列如SEQ ID NO. I所不。實施例4 pCambial301P: :OsESGl、pCambial301P: :AOsESGl 植物表達載體轉化農桿菌。I、農桿菌感受態細胞的制備。(I)挑取單菌落(EHA105)接種到3ml的YEB液體培養基中，于28°C，220rpm震蕩培養至 OD6tltl = 0. 5。(2)吸取I. 5ml菌液于離心管中，冰浴lOmin。(3)5000rpm離心30S,棄去上清液。(4)沉淀用 I. 5ml 0. 5M NaCl 懸浮，冰浴 20min。(5)5000rpm離心30S,棄去上清液。(6)每管用100 ill 20mM CaCl2懸浮，用于轉化，_70°C保存備用。2、DNA直接轉化農桿菌。(I) 50 ill 農桿菌感受態細胞中加入 pCambial301P: : OsESGl/pCambial301P: : AOsESGl 表達載體質粒 DNA0. 1-1 u g (5-10 U I)，之后冰浴 30min。(2)放入液氮中5min(或lmin)然后立即放入37 °C水浴鍋中水浴5min。(3)取出離心管，加入0.5ml的YEB，于28°C，220rpm震蕩培養3至5小時。(4)取出菌液涂布于含有相應抗生素的YEB平板上，28°C下倒置培養2天左右菌落可見。3、陽性農桿菌鑒定。(I)挑取農桿菌單菌落，接種于含有相應抗生素的YEB液體培養基中，28°C震蕩培養過夜。(2)菌液PCR鑒定步驟同實施例3-6。實施例5 :農桿菌介導水稻遺傳轉化。一、以水稻成熟胚為材料誘導愈傷組織。I.消毒取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒I)將種子放入IOOml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒I分鐘；2)倒去酒精，加入IOOml 30%次氯酸鈉(NaClO)溶液，浸泡30分鐘；3)倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸懼水清洗種子4-5遍,最后一遍浸泡30分鐘。2.誘導與繼代培養(以下步驟需無菌操作)I)種子放在無菌濾紙上吸干，置成熟胚于誘導培養基(培養基成分見表I)中，每皿12-14顆；2)操作完畢用封口膜(Micropore Surgical Tape)封好培養皿,在30°C光照培養箱，培養4周；3)在超凈工作臺上打開培養皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養基(培養基成分見表2)中，在30°C光照培養箱，繼代培養1-2周。(沒有脫落的可在原培養基上繼續培養)。
二、農桿菌培養。挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌(EHA105)菌液100 于4ml YEP (含50mg/LSpec 和 50mg/L Str)培養液中，28 °C，250rpm 振蕩培養 20_36h 至菌液 OD6tltl 為
0.8—I. 0o三、感菌與共培養。I)取培養好的菌液Iml于I. 5ml離心管中,4°C, 5000rmp,離心lmin,去上清。用含200 u mo I/LAs的30ml AAM感菌液(培養基成分見表3)制成懸浮液。2)將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農桿菌懸浮液侵染5分鐘，愈傷量沒過50ml離心管錐形部位即可。3)將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30-40分鐘；4)將愈傷組織置于共培養基(培養基成分見表4)上(上面墊上一層9cm無菌濾紙)。250C (組培室)暗培養2. 5天。四、抗性愈傷組織的篩選。將愈傷組織取出，用無菌水清洗6次，其間需不停的振蕩。再用含500mg/l羧芐青霉素(Car)的無菌水浸泡lh。最后置于無菌濾紙上浙干2小時。第一輪篩選將晾干的愈傷轉入含250mg/L羧節青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的選擇培養基(培養基成分見表5)上進行第一輪選擇，30°C,光照培養箱中培養14天；將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到含250mg/l羧芐青霉素(Car)和50mg/ 了潮霉素的培養基(同培養基成分見表5)上進行第二輪選擇，30°C,光照培養箱中培養10天,然后轉移到組培室中培養4天。將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到含250mg/l羧芐青霉素(Car)和50mg/l潮霉素的培養基(同培養基成分見表5)上進行第三輪選擇，30°C，光照培養箱中培養21天。五、抗性愈傷組織的誘導分化和生根。挑取顏色鮮黃的抗性愈傷移入裝有分化培養基(培養基成分見表6)的培養皿或塑料廣口瓶中，用封口膜封好，放入恒溫培養室中，等待分化成苗(30天左右)。待苗長至Icm左右，放入生根培養基(培養基成分見表7)中壯苗。六、轉基因苗的鍛煉和移栽。轉基因苗從分化到移栽最短時間為兩至兩個半月。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出，打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水，煉苗3天至一周，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測。表I水稻成熟胚愈傷組織誘導培養基(每升含量)
權利要求
1.一種水稻種胚中特異表達的基因，它是具有SEQ ID NO. I中所示核苷酸序列的片段。
2.—種含有權利要求I的基因的表達載體。
3.一種含有權利要求I的基因的正義表達載體pCambial301P::0sESGl，其特征是，它是將基因OsESGl以5’到3’方向構建入表達載體pCambial301P ;所述pCambial301P的獲取方法為以載體pCambial301為骨架，經EcoR I、KpnI雙酶切后，與經EcoR I、KpnI雙酶切的CaMV 35S啟動子片段連接。
4.一種含有權利要求I的基因的反義表達載體pCambial301P: :A0sESGl，其特征是，它是將基因OsESGl以3’到5’方向構建入表達載體pCambial301P ;所述pCambial301P的獲取方法為以載體pCambial301為骨架，經EcoR I、KpnI雙酶切后，與經EcoR I、KpnI雙酶切的CaMV 35S啟動子片段連接。
5.—種轉基因植株的獲取方法，其特征是，將權利要求4的反義表達載體pCambial301P: :AOsESGI農桿菌介導水稻遺傳轉化，獲得轉基因植株。
6.權利要求I所述的基因的克隆方法，其特征是，以水稻基因組DNA為模板，以通過基因序列設計的帶有酶切位點Kpnl、BamH I的序列為引物，經過PCR獲得。
7.如權利要求6所述的基因的克隆方法，其特征是，所述引物序列為OsESGl-F :5’ -GGGGTACCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’ ；OsESGl-R :5’ -CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ ； PCR 反應體系含有 Mg2+ 的 Taq 酶緩沖液 5 yl，2. 5mM 的 dNTP3 u I, IOu M ^ OsESGl-F引物I yl、IOii M的OsESGl-R引物liil，水稻DNA 4u I, Taq酶0. 5 yl，加滅菌雙蒸水至50u I ；PCR 反應程序98°C 10min,94°C lmin,56°C 30s, 72°C 2. 5min，35 個循環，72°C IOmin0
8.權利要求I所述的基因在調控種子根部發育方面的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征是，通過參與胚中細胞分裂過程，通過影響細胞的體積及大小調控種子根部發育。
全文摘要
本發明公開了水稻種胚特異表達的基因OsESG1、克隆方法及應用，屬于基因工程技術領域。OsESG1基因位于水稻一號染色體上，序列如SEQ NO.1所述。本發明以水稻基因組DNA為模板，以通過基因序列設計的帶有酶切位點Kpn1、BamH 1的序列為引物，經過PCR獲得基因OsESG1。本發明進一步利用遺傳學、分子生物學的方法進一步對該基因序列進行深入、細致的分析，對其表達模式做進一步的驗證，對其功能研究顯示基因OsESG1僅在種胚中特異性表達，并調控水稻種子胚芽及胚根的發育，為利用基因工程開展水稻品質改良及分子育種提供重要手段。
文檔編號A01H5/00GK102628050SQ20121007899
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者侯蕾, 劉煒, 房孝良, 李臻, 王慶國 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心