專利名稱：水稻細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳學(xué)和基因工程領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和PMI選擇標(biāo)記來制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
背景技術(shù)：
水稻(Oryza sativa)是全世界一半以上的人口，尤其是亞洲國家人口的主糧。隨著人口膨脹和耕地減少，水稻產(chǎn)量越來越難以滿足需要。到2050年，世界人口將從現(xiàn)在67 億人增加到92億人(聯(lián)合國，2007)，這就要求到2050年糧食供應(yīng)還需增加50%。隨著半矮稈品種和雜交稻的推廣，轉(zhuǎn)基因手段被認(rèn)為可望成為水稻增產(chǎn)的另一個突破點。2002年水稻全基因組測序完成后，可讀框的功能注釋和具有農(nóng)學(xué)意義的基因的應(yīng)用成為了水稻科研人員的主要研究目標(biāo)。實現(xiàn)這一目的的前提條件是必須開發(fā)出高效率的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 這樣的系統(tǒng)必須具有“多、快、好(可重復(fù)性高、基于成熟胚)、省”的特征，即能夠以更低的成本在更短的時間內(nèi)產(chǎn)生出更多的可育植株。隨著第一批轉(zhuǎn)基因水稻問世以來(Zhang and Wu 1988 ；Toriyama et al. 1988 ； Zhang et al. 1988)，已經(jīng)通過不同的轉(zhuǎn)化方法，包括花粉管途徑(Luo and Wu 1988)、微粒轟擊(Christou et al. 1991)、離子束(Yang et al. 1994)等進行了大量的水稻轉(zhuǎn)化研究。目前最常用的轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。該方法由Hiei等人(Hiei et al. 1994)建立。在此基礎(chǔ)上，已經(jīng)在粳稻(Chen et al. 1998 ；Enriquez-Obregon et al. 1999 ；Toki et al. 2006)、辛山稻(Lin and Zhang 2005 ；Hiei and Kumar 2006)和爪唾稻(Dong et al. 1996 ；Diah and Anzai 2006)中建立了分別使用來源于成熟胚的愈傷組織或未成熟胚作為外植體的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。但這些轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中都需要用到抗生素或除草劑等有毒物質(zhì)進行選擇，對環(huán)境有潛在的影響。作為替代，已經(jīng)有人開發(fā)了以磷酸甘露糖異構(gòu)酶(Pmi)基因作為選擇標(biāo)記，用無毒物質(zhì)甘露糖作為正選擇劑的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Joersbo and 0kkelsl996)。PMI是首先由Miles和Guest從大腸桿菌中分離出來并測序(Miles and Guest, 1984)。植物利用PMI能夠?qū)⒋蟛糠种参餆o法代謝的6-磷酸甘露糖形式的甘露糖轉(zhuǎn)化為大多數(shù)植物能夠代謝的6-磷酸果糖。這樣表達(dá)pmi基因的植物能夠以甘露糖為唯一碳源生長。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中使用pmi標(biāo)記基因時，用甘露糖進行正選擇。與殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的負(fù)選擇不同，在正選擇中未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞保持休眠，而經(jīng)過轉(zhuǎn)化的表達(dá)pmi 基因的細(xì)胞可以利用甘露糖作為碳源正常生長。這樣，在培養(yǎng)過程中不會發(fā)生未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的壞死。由此，再加上碳元素是細(xì)胞骨架的重要成分，使得pmi基因在轉(zhuǎn)化中的效率較高。此外，甘露糖在自然界中常見，能夠被豆科植物如大豆(Lee and Metheson, 1984)所代謝，因此對植物組織沒有不良作用。考慮到這些原因，人們已經(jīng)在不同科的植物中嘗試了使用pmi作為選擇標(biāo)記，例如禾本科的玉米(Negrotto et al. 2000)、珍珠稷(0，Kennedy et al. 2004)、剪股穎(Fu et al. 2005)、高粱(Gurel et al.，2009)、小麥(Wright et al. 2001)、和甘蔗(Jain et al. 2005)；十字花科的擬南芥(Todd and Tague，2001)和卷心菜(Ku et al. 2006)、薔薇科的蘋果(Degenhardt et al. 2006)、番木瓜(Zhu et al. 2005)和杏(Ramesh et al. 2006)；大戟科的木薯(Zhang et al. 2000)、茄科的西紅柿(Sigareva et al. 2004)；藜科的甜菜(Joersbo et al. 1998)；百合科的洋蔥(Aswath et al. 2006)； 和葫蘆科的黃瓜(He et al. 2006) 0由此可見pmi作為選擇標(biāo)記基因在糧食作物新品種的選育中有很大的發(fā)展?jié)摿Α?009年歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)了使用PMI選擇系統(tǒng)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因玉米的進口和加工作為食品和飼料的用途。在水稻轉(zhuǎn)化研究中也已有人使用過pmi選擇系統(tǒng) (Lucca et al. 2001 ；He et al. 2004 ；Ding et al. 2006)，但其報道的轉(zhuǎn)化效率都很低(僅 6%左右)，不適于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域?qū)τ谝訮MI作為選擇標(biāo)記的高效、簡便的水稻轉(zhuǎn)化方法存在需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化效率高、適用于工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的向水稻細(xì)胞導(dǎo)入外源基因的方法，適用于實施該方法的轉(zhuǎn)化體系，利用該方法制備轉(zhuǎn)基因水稻植株的方法，以及利用上述方法獲得的轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞、植株部分和植株。本發(fā)明提供了下列技術(shù)方案來實現(xiàn)該目的。在一個方面，本發(fā)明提供一種將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的方法，包括下述步驟(1)將水稻谷粒去殼、滅菌后將胚分離出來；(2)取步驟(1)所得的分離的胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在30°C左右暗培養(yǎng)約 2周，以產(chǎn)生次生愈傷組織；(3)將步驟O)中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因和磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸20分鐘左右；(4)將步驟(3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，于約23°C培養(yǎng)約48小時；(5)將步驟的愈傷組織置于恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天左右；(6)將步驟(5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有蔗糖和甘露糖的選擇培養(yǎng)基上，在約30°C 暗培養(yǎng)3周左右以獲得出芽的愈傷組織；(7)將出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；和任選地(8)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3周的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。在一個實施方案中，所述步驟(1)中的谷粒是成熟谷粒。在一個實施方案中，所述步驟O)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NB培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述步驟(3)中的與農(nóng)桿菌接觸是將所述愈傷組織浸泡在所述農(nóng)桿菌的懸液中。在一個實施方案中，所述步驟中的共培養(yǎng)基是說明書表1所列出的固體共培養(yǎng)基或液體共培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述步驟(5)中的恢復(fù)培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NBREC
培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述步驟(6)中的選擇培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NBPMI
培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述步驟(7)中的再生培養(yǎng)基不含有甘露糖。在一個實施方案中，其中所述步驟(7)中的再生培養(yǎng)基是選自包含如說明書表1所述成分的NBKN、NBKA, NBIZ或NBIK培養(yǎng)基中的任一種，優(yōu)選NBKN或NBKA培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述任選步驟(8)中的生根培養(yǎng)基是說明書表1所列出的 1/2MB培養(yǎng)基。在一個實施方案中，農(nóng)桿菌的懸液是在侵染當(dāng)天將農(nóng)桿菌以O(shè)D66tl約0. 05-0. 25懸浮包含如說明書表1所示成分的液體濾紙培養(yǎng)基中而制備的。在上述各實施方案的進一步優(yōu)選的實施方案中，所述選擇培養(yǎng)基中含有約 5-12. 5g/L的蔗糖和約5-25g/L的甘露糖，優(yōu)選含有約5g/L的蔗糖和約12. 5g/L的甘露糖。 更優(yōu)選地，其中所述選擇培養(yǎng)基中不含抗生素或除草劑。在上述各實施方案的進一步優(yōu)選的實施方案中，所述農(nóng)桿菌是根瘤農(nóng)桿菌EHA105 菌株。在上述各實施方案的進一步優(yōu)選的實施方案中，其中所述水稻是粳稻。優(yōu)選地，水稻是日本晴(Nipponbare)品種；或者，優(yōu)選地，所述水稻是皖粳97 (Wanjing 97)品種。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供一種將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的方法，包括下述步驟(1)將水稻谷粒去殼、滅菌后將胚分離出來；(2)取步驟(1)所得的分離的胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在約30°C暗培養(yǎng)約2 周以產(chǎn)生次生愈傷組織；(3)將步驟O)中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因和磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸20分鐘左右；(4)將步驟(3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，約23°C培養(yǎng)約48小時；(5)將步驟的愈傷組織置于恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天左右；(6)將步驟(5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有蔗糖和甘露糖的選擇培養(yǎng)基上，在約30°C 暗培養(yǎng)3周以獲得出芽的愈傷組織；(7)將出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；和(8)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3周的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；其中所述步驟(1)中的谷粒是成熟谷粒，所述步驟O)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NB培養(yǎng)基，所述步驟C3)中的與農(nóng)桿菌接觸是將所述愈傷組織浸泡在所述農(nóng)桿菌的懸液中，所述步驟中的共培養(yǎng)基是說明書表1所列出的固體共培養(yǎng)基或液體共培養(yǎng)基，所述步驟(5)中的恢復(fù)培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NBREC培養(yǎng)基，所述步驟(6) 中的選擇培養(yǎng)基是說明書表1所列出的NBPMI培養(yǎng)基，其中含有約5g/L的蔗糖和約12. 5g/ L的甘露糖，并且不含抗生素或除草劑，所述步驟(7)中的再生培養(yǎng)基是選自包含如說明書表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培養(yǎng)基中的任一種，所述步驟(8)中的生根培養(yǎng)基是說明書表1所列出的1/2MB培養(yǎng)基。在一個優(yōu)選的實施方案中，其中所述農(nóng)桿菌是根瘤農(nóng)桿菌EHA105菌株。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所用的PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列選自(I)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)編碼SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所用的PMI標(biāo)記基因序列如SEQ ID N0:1所示。 在本方面的優(yōu)選實施方案中，所述水稻是粳稻，更優(yōu)選地，所述水稻是日本晴品種。或者更優(yōu)選地，其中所述水稻是皖粳97品種。在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于轉(zhuǎn)化水稻的培養(yǎng)基套組，包括如下所述的組分(1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2)固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基或液體濾紙共培養(yǎng)培養(yǎng)基；(3)恢復(fù)培養(yǎng)基；(4)選擇培養(yǎng)基；(5)再生培養(yǎng)基；和任選地(6)生根培養(yǎng)基；其中所述(1)-(3)，(5)，(6)分別包含如本說明書表1所示的成分，所述(3)包含選自說明書表1所示的NBKN、NBKA, NBIZ或NBIK培養(yǎng)基中的任一種的成分。本方面還涉及這樣的培養(yǎng)基套組用于將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的程序的用途。所述的水稻優(yōu)選粳稻，包括但不限于日本晴、皖粳97等品種。在一個方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的方法的任一實施方案獲得的攜帶外源基因的水稻細(xì)胞。在一個方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括使用前述的任一方法將外源基因?qū)胨炯?xì)胞，并從獲得的水稻細(xì)胞培育出水稻植株。通過本發(fā)明，可以實現(xiàn)對水稻尤其是粳稻的高轉(zhuǎn)化頻率、高重復(fù)性的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；另一方面，通過本發(fā)明無需使用抗生素或除草劑選擇，只需要進行一輪甘露糖選擇就能夠獲得轉(zhuǎn)化植株，與常規(guī)的使用抗生素或除草劑選擇相比選擇過程可以縮短近3周的時間，不但能夠大大縮短選擇過程的耗時，還降低了其環(huán)境壓力，為開發(fā)工業(yè)規(guī)模的、環(huán)境友好的轉(zhuǎn)基因水稻制備工藝提供了可能。


圖1是本發(fā)明的示例性實施方案中農(nóng)桿菌EHA105株的T-DNA區(qū)的示意圖。35S 35S啟動子。pat 草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。Ubi 玉米遍在蛋白啟動子。gfp 綠色熒光蛋白基因。Actl 水稻肌動蛋白1啟動子。LB 左邊界。RB 右邊界。圖2是在NB培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)的情況。A，在NB上培養(yǎng)7天后的皖粳97 種子(比例線，Imm) ；B，在NB上培養(yǎng)7日后的皖粳97胚(比例線，Imm) ；C:來自在NB上培養(yǎng)15日后的日本晴成熟胚的次級愈傷組織(比例線，2mm)。它們都適于侵染前的預(yù)培養(yǎng)。圖3是經(jīng)侵染的日本晴愈傷組織在恢復(fù)培養(yǎng)后的GFP測定情況。A，光照下的愈傷組織；B，熒光下的同一愈傷組織(比例線，2mm)。圖4是用8種不同比例的蔗糖-甘露糖組合作為碳源選擇日本晴和皖粳97的選擇率。每個處理包括70-100個愈傷組織，且重復(fù)3次。圖5是再生培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果。每個處理包括70-100個愈傷組織，且重復(fù)3次。圖6是甘露糖抗性日本晴愈傷組織在不同的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后的結(jié)果。A， NBIZ ；B, NBKN ；C, NBKA ；D, NBIK。圖7是再生的水稻幼苗的GFP測定情況。A，光照下的日本晴幼苗；B，熒光下的同一水稻幼苗。比例線，2cm。
圖8是推定的轉(zhuǎn)基因事件的PCR擴增結(jié)果。M，DNA標(biāo)記DL 2000 ；P 質(zhì)粒；N 未轉(zhuǎn)化植物；1-15 獨立轉(zhuǎn)基因事件。圖9是PMI試紙條測定的結(jié)果。N 未轉(zhuǎn)化植物；1_5 獨立轉(zhuǎn)基因事件。圖10是甘露糖抗性實驗結(jié)果。A 在不含抗生素的NB甘露糖選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后的轉(zhuǎn)基因日本晴系Tl種子；B 在不含抗生素的NB甘露糖選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后的非轉(zhuǎn)基因日本晴系Tl種子圖11顯示移栽到溫室的轉(zhuǎn)基因水稻植株。A，溫室中正常授粉的轉(zhuǎn)基因植株；B，攜帶GOI的轉(zhuǎn)基因日本晴植株顯示了預(yù)期的表型，紅色線指示非轉(zhuǎn)基因植株黃色線指示獨立的轉(zhuǎn)基因事件。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施方式來進一步說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解這里描述的具體實施方式
只是作為示例來幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在沒有其他具體說明的情況下，下述具體實施方式
中的實驗方法和操作均采用本領(lǐng)域通用的常規(guī)操作來進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地從現(xiàn)有技術(shù)中獲得關(guān)于這樣的常規(guī)操作的教導(dǎo)，例如可以參照教科書Sambrook and David Russell,Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , Vols 1, 2 ；Charles Neal Stewart, Alisher Touraev, Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira, Plant Transformation Technologies 等。本文中所述的“約”或“左右”，除非另有特別說明或與上下文明顯沖突，表示其所指的參數(shù)可以取在所述的具體數(shù)值的基礎(chǔ)上在一定范圍內(nèi)，例如在所述具體數(shù)值的基礎(chǔ)上士5%的值，只要能保證能夠獲得預(yù)期的結(jié)果即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員在實施本發(fā)明的方法時，結(jié)合本說明書的教導(dǎo)，很容易在這里給出的具體實施方式
中所用的具體參數(shù)數(shù)值的基礎(chǔ)上，對參數(shù)數(shù)值加以適當(dāng)調(diào)整以適應(yīng)具體的實驗條件和材料，而不偏離本發(fā)明的范圍。1.材料和方法1. 1.植物材料、外植體制備和生長條件選取水稻品種日本晴(Nipponbare)和皖粳97 (Wanjing97)(來自中國安徽省)的飽滿、外觀正常的谷粒(種子)，去殼、滅菌后，在30°C的雙蒸水中黑暗浸泡過夜。用刮刀沿糊粉層分離盾片，朝上放置在NB培養(yǎng)基(成分如下所述)上30°C暗培養(yǎng)以誘導(dǎo)愈傷組織。 兩周后出現(xiàn)球形、粗糙、淺黃色的次級愈傷組織，可以用作經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體來進行下面的侵染。生長條件為愈傷組織誘導(dǎo)、預(yù)培養(yǎng)、恢復(fù)和選擇均在30°C左右的黑暗中進行；共培養(yǎng)在約23°C的黑暗中進行；再生和生根在約30°C光照下進行，光強度為約60001x，光周期為約16h日/8h夜。1. 2.試劑和培養(yǎng)基除非另有說明，本文所述具體實施方式
中使用的化學(xué)品購自Sigma(美國Saint Louis)。使用的各種培養(yǎng)基的組成如表1所示。除非另有說明，培養(yǎng)基的PH值為5.8。表 1本研究中使用的培養(yǎng)基的示例性配方
權(quán)利要求
1.一種將外源基因?qū)胨就罹?7品種的細(xì)胞的方法，包括下述步驟(1)將成熟水稻谷粒去殼、滅菌后將胚分離出來；(2)取步驟(1)所得的分離的胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在30°C暗培養(yǎng)2周以產(chǎn)生次生愈傷組織；(3)將步驟O)中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因和磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸20分鐘；(4)將步驟(3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，23°C培養(yǎng)48小時；(5)將步驟的愈傷組織置于恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天；(6)將步驟(5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有蔗糖和甘露糖的選擇培養(yǎng)基上，在30°C暗培養(yǎng) 3周以獲得出芽的愈傷組織；和(7)將出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括步驟(8)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟3所述的與農(nóng)桿菌接觸是將所述愈傷組織浸泡在所述農(nóng)桿菌的懸液中，所述農(nóng)桿菌的懸液是在侵染當(dāng)天將農(nóng)桿菌以O(shè)D66tl約0. 05-0. 25懸浮包含如說明書表1所示成分的液體濾紙培養(yǎng)基中而制備的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述農(nóng)桿菌是根瘤農(nóng)桿菌EHA105菌株。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述選擇培養(yǎng)基中含有5g/L的蔗糖和12.5g/L的甘露糖。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述選擇培養(yǎng)基中不含抗生素或除草劑。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列選自(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)編碼SEQID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻皖粳97品種的方法，包括1)通過1-7中任一權(quán)利要求的方法將外源基因?qū)胨就罹?7品種的細(xì)胞；和2)從步驟1)獲得的細(xì)胞培育水稻皖粳97品種的植株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用PMI選擇標(biāo)記高效率地將外源基因?qū)胨炯?xì)胞的方法、所用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、以及利用該方法制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
文檔編號A01H4/00GK102337293SQ20111030311
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者李 浩, 段永波, 章旺根, 翟晨光 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所