專利名稱：一種表達(dá)生物素化抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)生物素化抗原的方法，用于抗原的體內(nèi)生物素化標(biāo)記。
背景技術(shù)：
目前，現(xiàn)行市售的的抗體試劑盒中，間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定)是主流檢 測(cè)技術(shù)。但是，間接法所測(cè)定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標(biāo)二抗 所決定的。因而影響了抗體測(cè)定的靈敏度。目前，為提高抗體測(cè)定的靈敏度，間接法ELISA 試劑盒正逐步地向雙抗原夾心法轉(zhuǎn)變。但由于一些抗原的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)較為特殊，如丙肝病 毒HCV核心抗原含有較多的堿性氨基酸，化學(xué)標(biāo)記后容易喪失抗原活性。因此，目前市場(chǎng)上 并沒有HCV抗體的雙抗原夾心法檢測(cè)試劑盒出售。近年新出現(xiàn)的一種抗原標(biāo)記技術(shù)是將生物素連接酶(BirA酶)底物肽(BSP)序列 與抗原蛋白融合。然后BSP序列可在BirA酶的作用下生物素化。這種方法較溫和不影響 抗原活性。同時(shí)，由于酶促反應(yīng)的高度特異性，僅標(biāo)記特定的識(shí)別序列而不標(biāo)記其它蛋白。 因此，即使在后續(xù)的蛋白純化過程中，即使殘留有少量雜質(zhì)蛋白也不會(huì)對(duì)測(cè)定造成干擾，提 高了試劑盒的特異性。但BirA酶在大腸桿菌中的天然活性很低。這種方法需要將表達(dá)抗 原純化后使用重組的BirA酶進(jìn)行體外標(biāo)記，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，現(xiàn)有技術(shù)有待于完善和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在于提供一種表達(dá)生物素化抗原的方法，可直接進(jìn)行抗原 的體內(nèi)標(biāo)記。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種表達(dá)生物素化抗原的方法，其中使用一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體攜帶兩個(gè)串 聯(lián)的開放閱讀框，每個(gè)開放閱讀框都有自己獨(dú)立的啟動(dòng)子，前面一個(gè)開放閱讀框具有日本 血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)，其C端具有多克隆位點(diǎn)MCS，用于插入外源基因序 列，表達(dá)出與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因融合的融合蛋白，后面一個(gè)開放閱讀框則在第一個(gè) 開放閱讀框表達(dá)的同時(shí)，表達(dá)大腸桿菌生物素連接酶；當(dāng)插入的外源基因序列融合有大腸 桿菌生物素連接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AMATC GAA TGG CAC GAA時(shí)，表達(dá)的外源蛋白通過大腸桿菌體內(nèi)的代謝反應(yīng)被生物素化。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其中，所述第一個(gè)開放閱讀框?yàn)閜Tac啟動(dòng)子。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其中，所述后面一個(gè)開放閱讀框?yàn)門7啟動(dòng)子。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其中，所述兩個(gè)串聯(lián)的開放閱讀框之間通過以 下間隔堿基序列隔開ATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其中，所述表達(dá)載體圖譜如附圖1所示。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其中，所述外源基因序列為丙肝病毒HCV核心抗原N端1-130片段。所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，包括以下步驟步驟1:設(shè)計(jì)引物HCV-I:5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3HCV-2 :5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3HCV-3 :5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3HCV-4 :5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-3 ；步驟2 以HCV核心抗原基因?yàn)槟０澹砸颒CV-I和HCV-2為引物進(jìn)行第一次PCR 擴(kuò)增；步驟3 以步驟2的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-I和HCV-3為引物進(jìn)行第二次PCR 擴(kuò)增；步驟4 以步驟3的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-1和HCV-4為引物進(jìn)行第三次PCR 擴(kuò)增，得到融合了大腸桿菌生物素連接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基 因序列；步驟5 使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1_130片 段基因序列和生物素化表達(dá)載體，取酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ；步驟6 鑒定出正確的克隆，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)plysS。采用上述方案，本發(fā)明不但在抗原蛋白序列上融合一段BSP序列，并且使抗原蛋 白同時(shí)與大腸桿菌生物素連接酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使重組抗原在大腸桿菌內(nèi)部表達(dá) 時(shí)，就可以通過同時(shí)表達(dá)的大腸桿菌生物素連接酶，被特異性的生物素化，并且保留其生物 和免疫活性。


圖1為本發(fā)明的空白體表達(dá)載體圖譜；圖2是本發(fā)明插入HCV C130抗原基因后的表達(dá)載體圖譜；圖3是本發(fā)明的HCV核心抗原N端l_130aa片段的生物素化表達(dá)圖譜；圖4是本發(fā)明的HCV核心抗原N端l_130aa片段的生物素化表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的重組質(zhì)粒表達(dá)載體上具有兩個(gè)開放閱讀框，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)不同的蛋 白(抗原蛋白和大腸桿菌生物素連接酶)。表達(dá)后通過SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)可以檢測(cè)到兩個(gè)蛋白的表達(dá)，將 SDS-PAGE后的電泳蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上可以檢測(cè)抗原的抗原活性和被生物素化與否。下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建方法1、設(shè)計(jì)引物如下Pl :5-CCA TCT TAG TAT ATT AGT TM GTA TM GAA GGA GATATA CM TGA AGG ΑΤΑ ACA CCG TGC C-3
4
P2 :5-CATGC CTCGAG TTA TTTTTCTGCACTACGCAGGG-3P3 :5-ATA CGA CTC ACT ATA GGG GM TTG TGA GCG GAT MCMT TCC CCA TCT TAG TAT ATT AGT-3P4 :5-CAG AM GTA ATC GTA TTG TAC ACG GCC GCA TAA TCGAM TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3P5 :5-CAT GTC GAC AAG CTT GCG GCC GCA TAA TGC TTA AGTCGAACA GAAAGTAAT CGTATT G-32、接種大腸桿菌DH5a，在37°C下振搖培養(yǎng)至生長(zhǎng)飽和；3、以Pl，P2為引物，加入大腸桿菌DH5a菌液Iul為模板，使用高保真Taq酶PCR 擴(kuò)增BirA基因；4、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，PCR產(chǎn)物A ；5、使用PCR產(chǎn)物A為模板，P2，P3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，PCR產(chǎn)物B ；7、使用PCR產(chǎn)物B為模板，P2，P4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；8、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，PCR產(chǎn)物C ；9、使用PCR產(chǎn)物C為模板，P2，P5為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；10、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，PCR產(chǎn)物D ；11、使用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I對(duì)PCR產(chǎn)物D進(jìn)行酶切，同時(shí)使用相同的限 制性內(nèi)切酶酶切載體質(zhì)粒PTac-GST并去磷酸化，酶切結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳回收；12、取酶切回收產(chǎn)物，做DNA連接反應(yīng)；13、制做大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)化；14、將轉(zhuǎn)化平板取出，挑取單個(gè)克隆至LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒；15、將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖電泳，篩選出比原質(zhì)粒分子量增大的質(zhì)粒，然后進(jìn)行 DNA測(cè)序。確定插入片段的序列正確。獲得的表達(dá)載體圖譜如圖1所示。實(shí)施例2重組質(zhì)粒表達(dá)載體的生物素化表達(dá)以HCV核心抗原N端l_130aa片段的生物素化表達(dá)為例，將HCVC130抗原基因插 入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)。HCV核心抗原N端1-130片段的生物素化表達(dá)方法1、設(shè)計(jì)引物HCV-I:5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3HCV-2 :5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3HCV-3 :5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3HCV-4:5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-32、以HCV核心抗原基因?yàn)槟０澹砸颒CV-I，HCV-2為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；3、以步驟2的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-I和HCV-3為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò) 增；4、以步驟3的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-I和HCV-4為引物進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)
5增；得到融合了大腸桿菌生物素連接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基因 序列；5、使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1-130片段基因 序列和生物素化表達(dá)載體，取酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ；6、鑒定出正確的克隆，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌R0Setta(DE3)plySS。表達(dá)載體圖譜如圖2所示，其中HCV C130 抗原基因與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathion S Transferase, GST)基 因融合在一起，其中GST基因在5’端，HCV C13tl抗原基因在3’端。在HCV C130抗原的3’ 端又融合有BirA酶底物序列(BirA Substrate Peptide,BSP)的基因序列。整個(gè)融合基因 位于Tac啟動(dòng)子的3’端，構(gòu)成第一個(gè)開放閱讀框；在第一個(gè)開放閱讀框的下游，有T7啟動(dòng)子和Lac操縱基因。然后是大腸桿菌生物 素連接酶(BirA)基因序列，構(gòu)成第二個(gè)開放閱讀框；表達(dá)菌株為 Roseta (DE3)plysS。表達(dá)步驟1、以1 2000的比例接種表達(dá)菌至含100 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉 素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)(200轉(zhuǎn)/分)；至0D600處的吸光度為0. 8-1 ；2、以1 100的比例將菌液轉(zhuǎn)接至含100 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉素 的LB培養(yǎng)基中，37 °C振搖培養(yǎng)(200轉(zhuǎn)/分)；至0D600處的吸光度為0. 6左右時(shí)加IPTG (異 丙基- β -D-硫代半乳糖苷)至終濃度0. ImM ；22°C誘導(dǎo)16h即可。表達(dá)圖譜如圖3所示，其中1號(hào)泳道表達(dá)菌為誘導(dǎo)前；2號(hào)泳道為表達(dá)菌誘導(dǎo)后；3號(hào)泳道為空白R(shí)oseta(DE3)plysS菌誘導(dǎo)后。實(shí)施例3表達(dá)產(chǎn)物的鑒定表達(dá)的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，在37 °C下封閉 2h(PBS緩沖液，3%脫脂奶粉，0. 05%吐溫20)。使用封閉液稀釋的抗HCV核心抗原單克隆 抗體(抗原性檢測(cè))或辣根過氧化物酶標(biāo)記親合素(生物素化檢測(cè))，在4°C下作用過夜， PBST (PBS緩沖液，0.05%吐溫20)洗四次。進(jìn)行抗原性檢測(cè)時(shí)，繼續(xù)使用封閉液稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，在37°C下作用2h。最后DAB( 二氨基聯(lián)苯胺)顯色，PBS終止反應(yīng)觀察 結(jié)果。結(jié)果如圖4所示，其中1號(hào)泳道表達(dá)菌為抗原性檢測(cè)；2號(hào)泳道為表達(dá)菌生物素化檢測(cè)。表達(dá)后通過SDS-PAGE可以檢測(cè)到兩個(gè)蛋白的表達(dá)，將SDS-PAGE后的電泳蛋白轉(zhuǎn) 到硝酸纖維素膜上可以檢測(cè)抗原的抗原活性和被生物素化與否。本發(fā)明不但在抗原蛋白序列上融合一段BSP序列，并且使抗原蛋白同時(shí)與大腸桿 菌生物素連接酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。使重組抗原在大腸桿菌內(nèi)部表達(dá)時(shí)，就可以通過 同時(shí)表達(dá)的大腸桿菌生物素連接酶，被特異性的生物素化，并且保留其生物和免疫活性。
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本發(fā)明的重組質(zhì)粒表達(dá)載體上具有兩個(gè)開放閱讀框，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白。此外，還可以進(jìn)一步引入表達(dá)的調(diào)控元件調(diào)控兩個(gè)開放閱讀框的表達(dá)。對(duì)BirA酶 序列進(jìn)行優(yōu)化，去掉不需要的序列。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于使用一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體攜帶兩個(gè)串聯(lián)的開放閱讀框，每個(gè)開放閱讀框都有自己獨(dú)立的啟動(dòng)子，第一個(gè)開放閱讀框具有日本血吸蟲谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶基因，其C端具有多克隆位點(diǎn)MCS，用于插入外源基因序列，表達(dá)出與谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶基因融合的融合蛋白，后面一個(gè)開放閱讀框則在第一個(gè)開放閱讀框表達(dá)的同時(shí)，表達(dá)大腸桿菌生物素連接酶；當(dāng)插入的外源基因序列融合有大腸桿菌生物素連接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA時(shí)，表達(dá)的外源蛋白通過大腸桿菌體內(nèi)的代謝反應(yīng)被生物素化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于，所述第一個(gè)開放閱 讀框具有PTac啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于，所述后面一個(gè)開放 閱讀框具有T7啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于，所述兩個(gè)串聯(lián)的開 放閱讀框之間通過以下間隔堿基序列隔開ATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACAC GGCCGCATAATCGAAAT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體圖譜 如附圖1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，其特征在于，所述外源基因序列 為丙肝病毒HCV核心抗原N端1-130片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)生物素化抗原的方法，包括以下步驟 步驟1:設(shè)計(jì)引物HCV-I :5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3 ； HCV-2 :5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3 ； HCV-3 :5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3 ； HCV-4 :5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-3 ；步驟2 以HCV核心抗原基因?yàn)槟０澹砸颒CV-I和HCV-2為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；步驟3 以步驟2的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-I和HCV-3為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；步驟4 以步驟3的PCR產(chǎn)物為模板，以引物HCV-I和HCV-4為引物進(jìn)行第三次PCR擴(kuò) 增，得到融合了大腸桿菌生物素連接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基因 序列；步驟5 使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1-130片段基 因序列和生物素化表達(dá)載體，取酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ； 步驟6 鑒定出正確的克隆，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)plysS。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)生物素化抗原的方法，其使用一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體攜帶兩個(gè)串聯(lián)的開放閱讀框，每個(gè)開放閱讀框都有自己獨(dú)立的啟動(dòng)子，前面一個(gè)開放閱讀框具有多克隆位點(diǎn)MCS，用于插入外源基因序列，表達(dá)出與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶C端基因融合的融合蛋白，后面一個(gè)開放閱讀框則在第一個(gè)開放閱讀框表達(dá)的同時(shí)，表達(dá)大腸桿菌生物素連接酶；當(dāng)插入的外源基因序列融合有大腸桿菌生物素連接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA時(shí)，表達(dá)的外源蛋白通過大腸桿菌體內(nèi)的代謝反應(yīng)被生物素化。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101955962SQ201010227999
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者買制鋼, 林楓, 陳少娟, 雷明軍 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)