專利名稱：運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法
技術領域：
本發明屬于微生物基因工程領域。具體地涉及一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳 操作方法。
背景技術：
當前突出的全球性能源危機和環境污染問題，使得利用生物技術和可再生資源 (生物質)進行燃料乙醇的工業化生產，成為包括美國、巴西、中國等在內的許多國家的重 大研發項目之一。這些國家都在嘗試開發新的可用于更直接、更全面高效利用生物質資源 的燃料乙醇生產菌種和工藝。而運動發酵單胞菌乙醇發酵速度快、乙醇產率高(為理論值 的97 %，而酵母為理論值的90-92 % )，能耐受高糖濃度和高醇濃度，是目前所知產醇能力 最強的細菌之一，成為極具開發潛力的乙醇生產菌種；運動發酵單胞菌還能高產果聚糖、葡 萄糖酸、山梨醇等生物化工產品，極具工業利用價值。但運動發酵單胞菌所能利用的碳源范圍太窄，僅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。擴 展它底物范圍的改造工作已取得很大進展，2006年10月Dupont杜邦公司和Broin公司 聯合宣布了基于運動發酵單胞菌木糖利用工程菌株的農作物秸稈產醇的工藝，并先后建 立了生物質乙醇生產示范廠和中試工廠。菌株ZM4( = ATCC31821)和NCIMB11163的全 基因組序列也分別于2005年、2009年發表公布(Seo JS, Chong H, Park HS, et al. The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4. Nature Biotechnology. 2005 ；23 :63-68. Vassili N. Kouvelis, Elizabeth Saunders, Thomas S.Brettin, et al. Complete Genome Sequence of the Ethanol Producer Zymomonas mobilis NCIMB 11163. Journal of Bacteriology, 2009,191 (22) :7140-7141.)。然而，運 動發酵單胞菌的基礎科學研究和遺傳改造手段現狀還遠遠不能滿足應用研究的需要。運動 發酵單胞菌遺傳背景知識的相對缺乏、嚴格的限制修飾系統、廣泛而多樣的內源性質粒、廣 泛的抗性譜等等因素，使得對它的遺傳操作手段至今仍然有限而不成熟。目前導入外源基因和進行基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)是通過接合轉移 和轉化(化學法、電穿孔法)進行的。接合轉移工作早在二十世紀八十年代就開展了，但接 合轉移效率因菌株和質粒差別很大，總體上是低的。化學法轉化報道很少，因效率低和難以 重復而極少使用。電穿孔方法則方便、簡單、相對穩定，因而使用相對廣泛。一些寬宿主質粒 載體和人為構建的大腸桿菌-運動發酵單胞菌穿梭質粒載體被電穿孔轉化到不同的運動 發酵單胞菌菌株中，并能穩定復制存在。這些不帶目的基因的質粒載體的電穿孔轉化效率 與宿主菌株、質粒類型和具體的操作條件、方法均直接相關，報道的轉化效率從IO1個/μ g DNA到IO6個/ μ g DNA不等，而分析其操作條件、手法，則彼此差別又很大。一般來說，質粒越大，轉化效率越低。帶有目的基因的可復制質粒的轉化，較前述 不帶目的基因的可復制質粒的轉化，要困難得多，所公開的信息也少得多，目前僅有個別 的轉化效率的數據報道。對運動發酵單胞菌進行基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)時常規采用的基于宿主自身recA系統、通過長同源臂的同源重組定點整合方式，或者是通過轉座子元件進行 的隨機轉座方式，均首先需將相關質粒或DNA分子，經過電穿孔和(或)接合轉移的方式， 從胞外轉移至胞內；而質粒或DNA分子進入細胞后的整合、轉座過程，均屬于稀有事件，因 此基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)，客觀上更需要有高效、穩定、重復性好的電穿孔轉 化方法。而目前這方面的信息更是十分有限的。綜上所述，目前的電穿孔轉化方法，都是針對特定菌株和特定質粒的特殊應用，難 以推廣到其它菌株和質粒，相對缺乏通用性和穩定性、重復性，難以滿足運動發酵單胞菌分 子生物學研究和進一步的改造應用研究的需要，本領域需要建立更加通用、高效、穩定的電 穿孔方法。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種快速優化、適應面廣、穩定的、高 效的運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法。本發明的技術方案概述如下一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，包括下述步驟將待轉化DNA通過 電穿孔轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞中或用運動發酵單胞菌無細胞提取液與待轉 化DNA共同孵育，通過電穿孔將孵育后的DNA轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞中；所 述運動發酵單胞菌的感受態細胞是將運動發酵單胞菌培養至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420的 菌液濃縮100倍而制成；電穿孔操作的參數為2mm電擊杯中感受態細胞體積為80 μ 1 160 μ 1 ；電場強度為11. 0 14. OkV/cm ；復蘇時間為3h 24h。所述運動發酵單胞菌無細胞提取液是用下述方法制成培養運動發酵單胞菌至 OD600 = 0 . 6 1. 0的培養液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min離心收集菌體，用等體積 的冰浴預冷的提取物緩沖液HND洗滌，用培養液體積的1/20到1/10體積的冰浴預冷的提 取物緩沖液HND重懸，冰上超聲破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin離心，收集上清液， 所述提取物緩沖液HND為pH = 7. 0的200mM HEPES (N-(2-羥乙基)哌嗪-N，-2磺酸)， 20mM Na2EDTA, 5mM DTT ( 二硫蘇糖醇)。所述用運動發酵單胞菌無細胞提取液與待轉化DNA共同孵育為選100 μ 1反應體 系，包括 IOOmM HEPES，pH= 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT,5mM MgCl2, ΙμΜ SAM(S_ 腺苷甲 硫氨酸)，2 10 μ g待轉化DNA，50 μ 1運動發酵單胞菌無細胞提取液，在37°C、反應2 3 小時，純化，無菌水溶解。所述運動發酵單胞菌為ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。所述2mm電擊杯中感受態細胞體積為120 μ 1。所述電場強度為11. 75 13. 25kV/cm。本發明的有益效果在于1、利用運動發酵單胞菌菌株無細胞培養液處理待轉化DNA，使其獲得修飾，從而減 少電穿孔轉化時的宿主限制修飾系統的限制，提高轉化效率；2、根據不同的遺傳操作類型和目的選擇質粒載體，選擇轉化效率更高的質粒為出 發材料構建重組質粒；3、利用本發明的優化了的關鍵電穿孔物理參數對不同的宿主和DNA進行電穿孔，提高了運動發酵單胞菌電穿孔遺傳操作的轉化效率及穩定性，適應了所有通過電穿孔轉化 進行的、不同構建目的的遺傳操作，從而又具有通用性。通過本發明的方法可進行外源基因轉化和基因組DNA修飾，從而可廣泛用于運動 發酵單胞菌包括基因功能、表達調控研究在內的基礎研究和相關的應用研究。


圖1.圖中1-1為穿梭載體擬B21 (5930bp)，l_2為穿梭載體 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)，1-3 為寬宿主載體 pBBRlMCS-2 (5144bp)，1-4 為定點整合載體 PBR328-ldhR-cml-ldhL(7447bp)的物理圖譜。其中，Ec ori即大腸桿菌質粒復制子，來自 質粒pBR3^ ；Zm ori即運動發酵單胞菌質粒復制子，來自質粒pZM2 ；tet即四環素抗性基 因，cml即氯霉素抗性基因，amp即氨芐青霉素抗性基因，Plac為大腸桿菌Iac基因的啟動 子，IacZ為β -半乳糖苷酶基因，kan即卡拉霉素抗性基因，mob質粒遷移相關基因，rep質 粒復制相關基因，MCS為多克隆位點，Idh為乳酸脫氫酶基因，IdhR和IdhL分別用作同源重 組的同源臂。圖 2.質粒 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP (6880bp)的構建示意圖。圖3.不同細胞濃縮倍數下電穿孔轉化pBBRlMCS_2(5144bp)到運動發酵單胞菌菌 株ZM4圖4.不同細胞濃縮倍數下電穿孔轉化pZB21 (5930bp)到運動發酵單胞菌菌株CP4圖5.電擊杯中不同感受態細胞體積下電穿孔轉化pBBRlMCS_2(5144bp)到運動發 酵單胞菌菌株ZM4圖6.不同電場強度下電穿孔轉化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP(6880bp)到 ZM4圖7.不同電場強度下電穿孔轉化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP4圖8.不同復蘇時間下電穿孔轉化pBBRlMCS(5144bp)、p^21 (5930bp)到ZM4圖9.不同復蘇時間下電穿孔轉化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP具體實施例方式一般來說，影響電穿孔轉化效率的三大制約因素即質粒特性、宿主自身限制修飾 系統和電穿孔物理參數。針對這些制約因素，本發明分別采取了相應的解決措施，具體地 是1、在電穿孔前用運動發酵單胞菌無細胞提取液處理待轉化DNA，使待轉化DNA獲得宿主 的限制修飾系統的修飾，克服宿主對異源DNA進入宿主以后的限制及降解作用；2、選擇轉 化效率更高的質粒為出發材料構建重組質粒，再進行轉化；3、選擇關鍵的電穿孔物理參數 進行優化，對不同的宿主和DNA，選擇不同的參數優化水平的組合；這些關鍵的電穿孔物 理參數包括用于制備電穿孔感受態細胞的菌液的生長階段和制備的感受態細胞的密度， 電擊杯里感受態細胞體積，DNA濃度，電場強度，加入復蘇液后的復蘇時間。由于本發明對 這些措施的綜合運用，因此提供了一種快速優化的、通用的、穩定的、高效的轉化方法。應當理解的是，由于用于電穿孔轉化的DNA類型多樣，其彼此差異極大(主要指大小、有無復制子，復制類型，選擇標記類型，等等)，加上其所涉及的細胞內生物過程類型不 同，電穿孔的最佳操作條件一般是需要摸索和優化的，本發明的技術提供了針對新的菌株 和新的DNA類型時的一種快速優化操作條件的方法，因而也同時具有了通用性、穩定性。應當理解的是，由于同上的原因，針對不同菌株和不同DNA類型的電穿孔操作，其 轉化效率是千差萬別的，本發明所述的高效，不是簡單的轉化效率數值的高低，而是相對于 特定菌株和特定DNA類型(相應地有特定的細胞內生物過程)的通常的轉化效率來說的； 本發明所述的高效，對于那些本身效率很低、很難實現的轉化而言，也可以理解為在快速優 化的基礎上實現了轉化，即得到了目的轉化子。本發明所選用的用于運動發酵單胞菌外源基因轉化的質粒類型有1、可復制穿梭質粒，包括l)p^21 (5930bp)，pZB21的圖譜見附圖1，pZB21的 構建參見文獻(鄒少蘭，高衛華，劉成等.運動發酵單胞菌和大腸桿菌間穿梭載體的構 建·南開大學學報(自然科學版)，2006，39(3) 23-28) ；2)pZB21-Plac-lacZ(6375bp), pZB21-Plac-lacZ的圖譜見附圖1，pZB21-Plac_lacZ的構建參見文獻(張一婷，Zmobilis 中同源重組方法及誘導表達體系的研究，天津大學碩士學位論文，2007. 6)；等等；2、可復制寬宿主質粒，包括l)pBBRlMCS(5144bp)，其圖譜見附圖1(文獻來源 Kovach, ME. , Phillips, Rff. , Elzer, PH. , et al. pBBRlMCS :a broad-host-range cloning vector,BioTechniques,1994,16(5) :800-802 ；Kovach ME,Elzer PH,Hi 11 DS,et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995 ； 166 :175-176.可求得)；2) pBBRlMCS-Pgap-FLP(6880bp)，其構建見圖2 ；所涉及的引物Pl到P4見表1。表1、構建用引物
權利要求
1.一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征是包括下述步驟將待轉化 DNA通過電穿孔轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞中或用運動發酵單胞菌無細胞提取液 與待轉化DNA共同孵育，通過電穿孔將孵育后的DNA轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞 中；所述運動發酵單胞菌的感受態細胞是將運動發酵單胞菌培養至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420 的菌液濃縮100倍而制成；電穿孔操作的參數為2mm電擊杯中感受態細胞體積為80 μ 1 160 μ 1 ；電場強度為11. 0 14. OkV/cm ；復蘇時間為3h 24h。
2.如權利要求1所述的一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征是所述運 動發酵單胞菌無細胞提取液是用下述方法制成培養運動發酵單胞菌至0D_ = 0. 6 1. 0 的培養液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min離心收集菌體，用等體積的冰浴預冷的提取 物緩沖液HND洗滌，用培養液體積的1/20到1/10體積的冰浴預冷的提取物緩沖液HND重 懸，冰上超聲破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin離心，收集上清液，所述提取物緩沖液 HND 為pH = 7. 0 的 200mM HEPES,20mM Na2EDTA, 5mM DTT。
3.如權利要求1所述的一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所 述用運動發酵單胞菌無細胞提取液與待轉化DNA共同孵育為選100 μ 1反應體系，包括 IOOmMHEPES, pH = 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT, 5mM MgCl2,1 μ M SAM, 2 10 μ g 待轉化 DNA, 50 μ 1運動發酵單胞菌無細胞提取液，在37°C、反應2 3小時，純化，無菌水溶解。
4 如權利要求1、2或3的一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所 述運動發酵單胞菌為 ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。
5.如權利要求1所述的一種運動單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所述2mm 電擊杯中感受態細胞體積為120 μ 1。
6.如權利要求1所述的一種運動單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所述電場 強度為 11. 75 13. 25kV/cm。
全文摘要
本發明公開了一種運動發酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，包括下述步驟將待轉化DNA通過電穿孔轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞中或用運動發酵單胞菌無細胞提取液與待轉化DNA共同孵育，通過電穿孔將孵育后的DNA轉化到運動發酵單胞菌的感受態細胞中；本發明利用運動發酵單胞菌菌株無細胞培養液處理待轉化DNA，使其獲得修飾，提高轉化效率；利用本發明的方法優化了的關鍵電穿孔物理參數對不同的宿主和DNA進行電穿孔，提高了運動發酵單胞菌電穿孔遺傳操作的轉化效率及穩定性，適應了所有通過電穿孔轉化進行的、不同構建目的的遺傳操作，從而又具有通用性。
文檔編號C12N15/74GK102080097SQ201010241809
公開日2011年6月1日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者井欣, 張敏華, 張鯤, 洪解放, 鄒少蘭, 馬媛媛 申請人:天津大學