專利名稱：麝香水溶性提取物提高神經干細胞電穿孔轉染效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法，特別是利用麝香提取物來提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法。
背景技術：
電穿孔法是分子生物學中用于研究基因功能的技術之一，其原理是被轉染的細胞受到短暫的電脈沖，導致細胞膜上形成短暫的孔，使外源DNA或大分子進入細胞內。提高電穿孔轉染的效率是技術的關鍵。
麝香來源于麝科動物林麝(Moschus berezovskii Flerov)、馬麝(Moschus sifanicusPrzewalski)或原麝(Moschus mischieferus Linnaeus)成熟雄體臍下腺囊中的分泌物，是名貴的中藥材。性溫味辛，歸心脾經，具有開竅醒神、活血通經、消腫止痛之功效。七十年代中期，中外學者開始對麝香化學成分進行了系統的研究，目前已證實的化學成分有麝香酮、麝香吡啶、蛋白質和多肽、脂肪酸、酯和蠟、膽甾醇等。對麝香功能的研究表明，它具有抗炎、免疫調節、強心等作用，還能引藥透達全身、穿透病所的廣譜作用。在研究麝香水溶性提取物對大鼠神經干細胞生長分化的影響過程中還發現低濃度麝香水溶性提取物對細胞的生長無明顯影響，但可以顯著地提高大鼠神經干細胞的電轉染效率，因此有望利用麝香水溶性提取物開發增強細胞電轉染的試劑。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用麝香提取物來提高神經干細胞電轉染率的方法。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案本發明的一種麝香水溶性提取物提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法，其特征在于，該方法的具體步驟為a.配制麝香提取物的水溶液；b.帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒pEGFP-C1的DNA抽提；c.大鼠神經干細胞的分離和培養，采用的基礎培養液的組成為DMEM/F12的體積比為1∶1，100U/mL的青霉素和鏈霉素，2％的B27；原代培養液為基礎培養液分別加20ng/mL的EGF和bFGF，得到待轉染的培養細胞；d.電轉染方法，具體步驟如下
(a)、在步驟c中得到的待轉染的培養細胞中加入步驟a中配制的麝香水溶性提取物，使待轉染的培養細胞中麝香的終濃度達到0.1-0.5‰，培養2-10小時；(b)、將步驟(a)得到的培養細胞離心分離，轉速為1000轉/分，時間為3分鐘，沉淀細胞重懸于電轉化緩沖液中，制成密度為1×107個/mL的細胞懸液；所用的電轉化緩沖液為KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH 7.2；(c)、將步驟b抽提的質粒DNA加入到細胞懸液中，使細胞懸液中質粒DNA的總濃度為5-20μg/mL，混勻；(d)、將步驟(c)中的細胞懸液移入冰上預冷的100μL電轉化杯中，用電轉化儀在室溫下電擊一次，電壓為200-250伏特，時間為80-120微秒，電擊完畢后，將轉化杯置于冰上10分鐘；(e)、將電轉化杯中的培養細胞轉到細胞培養皿中，用基礎培養液將被轉染的細胞稀釋10倍，置于培養箱中，在37℃，5％CO2下培養，觀察細胞形態并傳代培養。
上述的帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒DNA的抽提方法為將轉化有pEGFP-C1質粒的細菌DH5α，在液體培養基中培養16小時，用標準的質粒抽提方法得到質粒DNA，用雙蒸水溶解，保存于-20℃備用。
上述的大鼠神經干細胞的分離和培養的方法為無菌條件下取胎齡14天的SD大鼠紋狀體，機械法將組織吹打成單細胞懸液，細胞種植在原代培養液中，濃度為3×105個/mL，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養，該細胞為原代培養細胞；原代培養細胞培養一周后，收集細胞團，用槍頭吹打成單細胞懸液，再用移液器將細胞懸液收集到離心管中離心分離，轉速為1000轉/分，時間為3分鐘，棄上清液，然后加入基礎培養基，將沉淀細胞懸浮，并轉移到無菌的培養瓶內培養。
本發明方法采用低濃度的麝香來提高大鼠神經干細胞電轉化效率，可以達到不影響培養細胞生長而提高電轉染效率的目的。
具體實施例方式實施例一1.麝香水溶性提取物的制備將0.15g麝香溶解于2g無菌水中，震蕩使其充分溶解，離心3分鐘(3000轉/分，4℃)，取上清液過濾除菌，即為麝香水溶性提取物原液，以麝香對水的重量百分比計，其濃度為7.5％〔(0.15÷2)×100％＝7.5％〕，置于4℃冰箱中保存。使用時根據終濃度用培養基稀釋。2、帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒DNA抽提將轉化有pEGFP-C1質粒的細菌(DH5α)，在液體培養基中培養16小時，用標準的質粒抽提方法得到質粒DNA，用雙蒸水溶解，保存于-20℃備用。
3、大鼠神經干細胞的分離和培養無菌條件下取胎齡14天的SD大鼠紋狀體，機械法將組織吹打成單細胞懸液，細胞種植在原代培養液中，濃度為3×105個/mL，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養，該細胞為原代培養細胞。原代培養細胞培養一周后，收集細胞團，用槍頭吹打成單細胞懸液，再用移液器將細胞懸液收集到50mL的離心管中離心(1500轉/分，5分鐘)，棄上清，然后加入基礎培養基，將沉淀細胞懸浮，并轉移到無菌的培養瓶內，得到待轉染的培養細胞。(基礎培養液的組成為DMEM/F12(1∶1，V∶V)，100U/mL的青霉素和鏈霉素，2％的B27；原代培養液為基礎培養液分別加20ng/mL的EGF和bFGF)。
4、電轉染方法a、在待轉染的培養細胞中加入麝香水溶性提取物原液，使待轉染的培養細胞中麝香的終濃度為0.3‰，對照加基礎培養液，培養2小時；b、將a培養細胞收集于離心管中離心(1500轉/分，5分鐘)，沉淀的細胞重懸于電轉化緩沖液中(KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH 7.2)，制成密度為1×107個/mL的細胞懸液；c、將步驟2中得到的質粒加入到細胞懸液中，使細胞懸液中質粒的濃度為5μg/mL，混勻。
d、將步驟c中的細胞懸液移入冰上預冷的100μL電轉化杯中，在室溫下將電轉化杯放入電轉化裝置的杯架上，以200伏特，80微秒電擊一次；f、電擊完畢后，將轉化杯置于冰上10分鐘；g、將電轉化杯中的培養細胞轉到細胞培養皿中，用基礎培養液將被轉染的細胞稀釋10倍，置于培養箱中培養(37℃，5％CO2)，觀察細胞形態并傳代培養。
實施例二不同麝香濃度對電轉染率的影響控制待轉染的培養細胞中麝香的濃度為0.3‰、1.0‰、3.0‰，以觀察不同濃度的麝香對電轉染率的影響，結果見表1，表1麝香對電轉染效率的影響

電轉染率計算方法為電穿孔后48小時，在倒置顯微鏡下觀察計數。在可見光下先固定1個視野，計總細胞數，然后轉換熒光光源，計綠色熒光的細胞數，共取5個視野以計算平均值。電轉染率＝(綠色熒光的細胞數/可見光下總細胞數)×100％。
根據表1的結果，可以得出實驗組(加麝香)比對照組的電轉染率提高2倍以上。但麝香濃度由0.3‰提高10倍達到3.0‰時，電轉染率增加不顯著。
實施例三麝香對培養細胞生長的影響采用不同濃度的麝香(0.3‰、1.0‰、3.0‰)對培養的大鼠神經干細胞進行觀察，其結果為0.3‰實驗組細胞培養24小時形態無明顯變化，而1‰實驗組僅10小時細胞形態開始出現變化，3‰實驗組3小時即開始變化，且細胞形態的變化呈現多樣性，主要表現為大量分叉、突起的出現，貼壁細胞數量增加，細胞團大量減少，胞體增大，向不同方向伸出突起，并出現部分兩極突起的梭形細胞，周圍出現折光性良好的小顆粒，高濃度長時間會造成部分細胞死亡。
實驗表明低濃度時，麝香對培養細胞無明顯的損傷，而高濃度時會傷害細胞，影響細胞生長。
實施例四麝香損傷細胞的恢復實驗對實施例三中受損傷的培養細胞，重新轉到正常的基礎培養基中，7-15天已基本恢復到原來的神經干細胞形態。表明麝香對細胞的損傷是可逆的。
上述實施例結果表明，用低濃度的麝香可以達到不影響培養細胞生長而提高電轉染效率的目的。
權利要求
1.麝香水溶性提取物提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法，其特征在于，該方法的具體步驟為a.配制麝香提取物的水溶液；b.帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒pEGFP-C1的DNA抽提；c.大鼠神經干細胞的分離和培養，采用的基礎培養液的組成為DMEM/F12的體積比為1∶1，100U/mL的青霉素和鏈霉素，2％的B27；原代培養液為基礎培養液分別加20ng/mL的EGF和bFGF，得到待轉染的培養細胞；d.電轉染方法，具體步驟如下(a)、在步驟c中得到的待轉染的培養細胞中加入步驟a中配制的麝香水溶性提取物，使待轉染的培養細胞中麝香的終濃度達到0.1-0.5‰，培養2-10小時；(b)、將步驟(a)得到的培養細胞離心分離，轉速為1000轉/分，時間為3分鐘，沉淀細胞重懸于電轉化緩沖液中，制成密度為1×107個/mL的細胞懸液；所用的電轉化緩沖液為KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH7.2；(c)、將步驟b抽提的質粒DNA加入到細胞懸液中，使細胞懸液中質粒DNA的總濃度為5-20μg/mL，混勻；(d)、將步驟(c)中的細胞懸液移入冰上預冷的100μL電轉化杯中，用電轉化儀在室溫下電擊一次，電壓為200-250伏特，時間為80-120微秒，電擊完畢后，將轉化杯置于冰上10分鐘；(e)、將電轉化杯中的培養細胞轉到細胞培養皿中，用基礎培養液將被轉染的細胞稀釋10倍，置于培養箱中，在37℃，5％CO2下培養，觀察細胞形態并傳代培養。
2.根據權利要求1所述的麝香水溶性提取物提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法，其特征在于帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒DNA的抽提方法為將轉化有pEGFP-C1質粒的細菌DH5α，在液體培養基中培養16小時，用標準的質粒抽提方法得到質粒DNA，用雙蒸水溶解，保存于-20℃備用。
3.根據權利要求1所述的麝香水溶性提取物提高神經干細胞電穿孔轉染率的方法，其特征在于大鼠神經干細胞的分離和培養的方法為無菌條件下取胎齡14天的SD大鼠紋狀體，機械法將組織吹打成單細胞懸液，細胞種植在原代培養液中，濃度為3×105個/mL，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養，該細胞為原代培養細胞；原代培養細胞培養一周后，收集細胞團，用槍頭吹打成單細胞懸液，再用移液器將細胞懸液收集到離心管中離心分離，轉速為1000轉/分，時間為3分鐘，棄上清液，然后加入基礎培養基，將沉淀細胞懸浮，并轉移到無菌的培養瓶內培養。
全文摘要
本發明涉及一種利用麝香水溶性提取物來提高神經干細胞電轉染率的方法。本發明方法包括配制麝香水溶液性提取物、帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質粒DNA抽提、大鼠神經干細胞的分離和培養、電轉染。本發明方法采用低濃度的麝香水溶物來提高大鼠神經干細胞電轉化效率，可以達到不影響培養細胞生長而提高電轉染效率的目的。
文檔編號C12N15/85GK1834234SQ20061002523
公開日2006年9月20日 申請日期2006年3月30日 優先權日2006年3月30日
發明者宋紅生, 郭志華, 沈崎, 陳付學, 文鐵橋, 李德祥 申請人:上海大學