專利名稱：檢測甲型h1n1流感病毒抗藥性突變的引物和探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探 針及其應(yīng)用，以及檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的方法。
背景技術(shù)：
流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的一種人、禽、畜共患的急性傳染病，其發(fā) 病率、死亡率和造成的經(jīng)濟損失位居各傳染病之首。奧司他韋(商品名達菲)被廣泛用來 作為流感的預(yù)防和治療，但流感病毒由于神經(jīng)氨酸酶274位的組氨酸突變?yōu)槔野彼岫霈F(xiàn) 了顯著的奧司他韋耐藥性。目前建立了多種利用分子生物學(xué)方法檢測具有奧司他韋耐藥性 基因型流感病毒的方法，如單核苷酸多態(tài)性分析、滾環(huán)擴增技術(shù)以及Sanger測序等，但這 些方法不僅費時、費力、比較昂貴，而且還會由于實驗室、工作人員、操作方法和標本的不同 而影響其敏感性和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一組檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和 熒光探針及其應(yīng)用，以及檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針，所述特 異性擴增引物序列如下PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’PN1H274Y-R :5，-AAGACACCCACGGTCGATTC-3，該引物與甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶274位點編碼序列兩端互補，其擴增片段的長 度為168bp ；所述熒光探針序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3，PN1H274Y-Pb2 5，-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3探針的5’端標記熒光基團HEX或FAM，3’端標記MGB，NFQ為熒光淬滅基團，突變 位點位于探針的中部?；驍U增產(chǎn)物以臨床呼吸道分泌物總RNA為模板，通過實時逆轉(zhuǎn)錄 PCR進行擴增。所述的特異性擴增引物和熒光探針可用于制備檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突 變的熒光PCR檢測試劑盒。所述試劑盒主要包括PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、脫氧 三磷酸核苷混合物、特異性擴增弓I物和熒光探針。所述試劑盒中還包括R0X 均一化參比染料。本發(fā)明還涉及一種檢測檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的方法，所述方法包 括(1)提取樣品 RNA;
(2)熒光PCR擴增檢測取PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、脫氧三磷酸核苷混 合物、ROX均一化參比染料、特異性擴增引物和熒光探針配成反應(yīng)液，加入樣品RNA為模板 進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為42°C逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性2min ；95°C,5s變性，55°C復(fù)性 與延伸40s，收集FAM和HEX熒光，共40個循環(huán)；所述特異性擴增引物序列如下PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’PN1H274Y-R :5，-AAGACACCCACGGTCGATTC-3，所述熒光探針序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3，PN1H274Y-Pb2 5， -FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3，；(3)結(jié)果分析如果僅有HEX熒光積累而沒有FAM熒光積累，則表示樣品中存在 H274基因型的甲型Hmi流感病毒，且未發(fā)生H274Y突變，為對奧司他韋敏感的病毒；如果 有FAM熒光積累，則表示樣品中存在甲型Hmi流感病毒，且已發(fā)生H274Y突變，為對奧司他 韋不敏感的病毒；如果沒有熒光出現(xiàn)，則表示樣品中不存在甲型Hmi流感病毒。所述步驟(2)中PCR反應(yīng)液(以TaKaRa —步法熒光定量RT-PCR試劑盒為例)每 25 μ L組成如下2X One Step RT-PCR Buffer引物 PN1H274Y-F引物 PN1H274Y-R探針PN1H274-Pbl探針PN1H274Y-Pb2R0X 均一化參比染料TaKaRa Ex Taq HSPrimeScript RT Enzyme Mix樣品RNADEPC 水補足至 25 μ L。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在采用本發(fā)明方法，操作方法簡單，結(jié)果直觀明了 ； 引物和探針敏感性強，特異性好；在流感檢測與監(jiān)測中可快速的對是否是抗藥株作出鑒定， 大大減少了人力、物力的耗費。


圖1為雙重實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR方法的特異性檢測結(jié)果；曲線A代表274Υ，曲線B 代表274Η，曲線C代表274Η和274Υ的混合液。圖2為雙重實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR方法的敏感性檢測結(jié)果；用10倍倍比稀釋的Hmi 病毒RNA作為模板。A =WHO設(shè)計的實時方法檢測A型流感；B 內(nèi)部設(shè)計的2009流行性Hmi 檢測方法；C :WH0設(shè)計的2009流行性Hmi檢測方法；D 本發(fā)明雙重實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR方 法檢測2009流行性Hmi中H274Y的突變。圖3為H274Y檢測的模型圖；1_丨274H陽性樣本(HEX熒光)；▲ :274H和274Y雙
12. 5μ L 0. 4μΜ 0. 4μΜ 0. 2μΜ 0. 2μΜ 0. 5μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 5 μ L
5陽性的樣本(FAM和HEX熒光)陰性對照。 具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 引物和探針的設(shè)計比對GenBank登錄的流感NA基因序列并據(jù)此設(shè)計引物和探針。其中引物序列為PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’ ；PN1H274Y-R 5’ -AAGACACCCACGGTCGATTC-3 ’，分別位于823 825突變位點的兩側(cè)，擴增片段長度為168bp。探針序列為PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3'；PN1H274Y-Pb2 :5， -FAM-AATGCCCCTAATTAIIACTA-MGBNFQ-3，。分別與823 825位點及兩端序列互補，其中熒光基團位于探針的5’端，MGB位 于3’端。 實施例2 人工合成包含274野生型或突變型編碼序列的RNA用PmH274Y-F和PmH274Y_R引物從臨床分離樣本中擴增274H野生型DNA片段， 用PmH274Y-F和包含突變位點的274Rm(GCATTCCTCATAGTAATAATTAGGG)引物，包含突變位 點的 274Y-Fm(CCCTAATTATTACTATGAGGAATGC)和 PN1H274Y-R 分別擴增突變位點的 5，禾口 3， 端片段，然后將純化回收的片段混合作為模板，以PN1H274Y-F和PN1H274Y-R為引物進行擴 增，獲得含有274Y突變的片段。將突變型和野生型的片段克隆到pGEM-Teasy (Promega公 司)載體中(pGEM-Teasy-274Y、pGEM-Teasy-274H)進行測序。將MS2噬菌體的assembly protein和coat protein的基因片段用引物 CTAGATCTCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT 和 TTGGATCCGAGTTGAACTTCTTTGTTGTCTTC 擴增后用 BglII和BamHI酶切，酶切片段克隆到載體pET28a的BamHI位點中并測序鑒定方向，選取 BamHI位點臨近T7ter序列的pET28a_MS2作為進一步克隆的載體。用BamHI和HindIII 從測序正確的pGEM-Teasy-274H和pGEM_Teasy-274Y質(zhì)粒中切出目的片段并分別克隆到 pET28a-MS2載體中構(gòu)建pET28a_MS2_274H和pET28a_MS2_274Y質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)中進行IPTG誘導(dǎo)表達，然后抽提RNase和DNase處理的菌液上清中的RNA。實施例3 該方法的特異性檢測以季節(jié)性流感HlNl、H3N2及B型流感，人源高致病性禽流感H5W和禽源的H9N2 病毒RNA為模板，及IO4倍稀釋的H274Y野生型和突變型RNA混合物作為模板進行特異性 檢測。PCR反應(yīng)液組成如下(采用TaKaRa —步法熒光定量RT-PCR試劑盒，ABI 7500熒 光定量PCR儀)2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5μ LPN1H274Y-F0. 4 μ MPN1H274Y-R0. 4 μ MPN1H274-Pbl0. 2 μ M
6
PN1H274Y-Pb20. 2 μ MR0X 均一化參比染料0. 5 μ LTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L樣品RNA5μ LDEPC處理水補足至25 μ L，混勻；反應(yīng)程序為42°C逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性2min ；95°C，5s變性，55°C復(fù)性與延伸 40s，收集FAM (FAM通道)和HEX (VIC通道)熒光，共40個循環(huán)。結(jié)果如圖1所示，該方法可以特異的檢測H274Y突變，與所檢測的流感病毒沒有交 叉反應(yīng)發(fā)生。季節(jié)性流感HlNl、H3N2和B型流感，人禽流感病毒H5W以及禽源的H9N2病 毒用來評價該方法是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，結(jié)果均未擴增。實施例4 該方法的敏感性檢測將本發(fā)明方法(圖2D)與WHO推薦的A型流感(圖2A)及2009新型流 感的檢測方法(CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A (HlNl), http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/CDCR ealtimeRTPCR_ SwineHlAssay-2009_20090430. pdf.)(圖2C) ,2009新型流感的檢測試劑盒(上海超世生物 技術(shù)公司)(圖2B)進行比較。用等量的Hmi病毒RNA為模板進行PCR反應(yīng)。結(jié)果如圖2 所示，證明該方法與WHO推薦的檢測甲型流感的方法敏感性相同，明顯優(yōu)于WHO推薦的2009 新型流感的檢測方法。實施例5 對臨床樣本的檢測對收集的715份Hmi陽性臨床樣本，以RNA作為模板進行雙重實時熒光定量 RT-PCR反應(yīng)，對臨床樣本中是否存在H274Y基因型的病毒進行檢測。所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進行，如采用Qiagen RNeasy Mini Kit或其它試 劑盒所提取。本發(fā)明中，所述樣品RNA的提取步驟可為1)離心管中加入500 μ 1 RLT禾口 6 μ L β -巰基乙醇；2)向上述溶液中加入200 μ L樣本(包括含漱液、咽拭子、呼吸道吸出物等)，振蕩 混勻Imin ；3)加入等體積的70 %乙醇混勻；4)取700 μ 1混合液加入收集管內(nèi)的離心柱中，12000rpm離心15s ；5)重復(fù)步驟4 一次；6)加入700 μ 1 Rffl緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15s ；7)加入500 μ 1 RPE緩沖液于離心柱中，12000rpm離心15s ；8)重復(fù)步驟7 —次；9)倒盡收集管中液體，空離一次；10)加入適量無RNA酶的水溶解RNA并離心收集，置于_70°C保存。所述雙重實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)試劑組成(以TaKaRa —步法熒光定量RT-PCR 試劑盒為例)和反應(yīng)程序(以ABI 7500熒光定量PCR儀為例)為2XOne Step RT-PCR Buffer12. 5μ 1
PN1H274Y-F0. 4 μ MPN1H274Y-R0. 4 μ MPN1H274-Pbl0. 2 μ MPN1H274Y-Pb20. 2 μ MROX 參比染料0.5yLTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L病毒 RNA5 μ LDEPC處理水補足至25 μ L，混勻；反應(yīng)程序為42°C逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性2min ；95°C，5s變性，55°C復(fù)性與延伸 40s，收集FAM (FAM通道)和HEX (VIC通道)熒光，共40個循環(huán)。結(jié)果證明715份樣本中，有一份出現(xiàn)了 HEX和FAM兩種熒光的累積，說明該份樣 本中的病毒為奧司他韋耐藥型與敏感型混合病毒，且從擴增曲線中的Ct值可以看出，耐藥 型病毒明顯多于敏感型病毒，通過設(shè)計一對引物擴增NA基因的0RF，并克隆到pGEM-Teasy 載體進行藍白斑篩選，隨機挑取100個分離良好的白色菌落培養(yǎng)并測序，結(jié)果證明NA確為 Y274與H274基因型的混合物，且其比例約為3. 5 1。該H274Y突變的神經(jīng)氨酸酶基因序 列已經(jīng)登錄美國GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為HM145748。
權(quán)利要求
一種檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針，其特征在于所述特異性擴增引物序列如下PN1H274Y F5’ AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA 3’PN1H274Y R5’ AAGACACCCACGGTCGATTC 3’所述熒光探針序列如下PN1H274 Pb15’ HEX ATGCCCCTAATTATCACTA MGBNFQ 3’PN1H274Y Pb25’ FAM AATGCCCCTAATTATTACTA MGBNFQ 3’。
2.如權(quán)利要求1所述的特異性擴增引物和熒光探針在制備檢測甲型Hmi流感病毒抗 藥性突變的熒光PCR檢測試劑盒中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述試劑盒主要包括PCR緩沖液、DNA聚合 酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、特異性擴增引物和熒光探針。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述試劑盒中還包括R0X 均一化參比染料。
5.一種檢測檢測甲型Hmi流感病毒抗藥性突變的方法，所述方法包括(1)提取樣品RNA；(2)熒光PCR擴增檢測取PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、 ROX均一化參比染料、特異性擴增引物和熒光探針配成PCR反應(yīng)液，加入樣品RNA為模板進 行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為42°C逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性2min ；95°C,5s變性，55°C復(fù)性與 延伸40s，收集FAM和HEX熒光，共40個循環(huán)；所述特異性擴增引物序列如下 PN1H274Y-F :5’ -AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’ PN1H274Y-R :5’ -AAGACACCCACGGTCGATTC-3’ 所述熒光探針序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3， PN1H274Y-Pb2 :5’ -FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’ ；(3)結(jié)果分析如果僅有HEX熒光積累，則表示樣品中存在H274基因型的甲型Hmi流 感病毒，且未發(fā)生H274Y突變，為對奧司他韋敏感的病毒；如果有FAM熒光積累，則表示樣品 中存在甲型Hmi流感病毒，且已發(fā)生H274Y突變，為對奧司他韋不敏感的病毒；如果沒有熒 光出現(xiàn)，則表示樣品中不存在甲型Hmi流感病毒。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR反應(yīng)液每25μ L組成如下2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5μ L引物 PN1H274Y-F0. 4 μ M引物 PN1H274Y-R0. 4 μ M探針 PN1H274-Pbl0. 2 μ M探針 PN1H274Y-Pb20. 2 μ MR0X 均一化參比染料0.5yLTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L樣品RNA5μ LDEPC水補足至25 μ L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針及其應(yīng)用，以及檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的方法。采用本發(fā)明方法，操作方法簡單，結(jié)果直觀明了；引物和探針敏感性強，特異性好；在流感檢測與監(jiān)測中可快速的對是否是抗藥株作出鑒定，大大減少了人力、物力的耗費。
文檔編號C12N15/11GK101928787SQ201010258889
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者盧亦愚, 周敏, 張嚴峻, 茅海燕, 陳寅 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心