專利名稱：一種用于轉基因大豆檢測的五基因標準質粒分子及其構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物學技術領域的質粒分子，具體來說，涉及一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法。
背景技術：
自1996年以來，全球轉基因作物種植面積以年均10%以上的速率增長，2009年全球批準種植的轉基因作物達1.34億公頃，其中轉基因大豆種植面積達到6900萬公頃，占大豆總種植面積的77%。隨著轉基因作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視。歐盟于1998年在世界上簽署第一個法案，要求對轉基因產品進行標簽說明；1999年要求出口到歐盟的非轉基因產品不得含有的轉基因產品污染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到0.9%。隨之，日本、澳大利亞、韓國等國家對轉基因成分的最低含量做了不同的規定，閾值從1-5%不等。我國于2001年5月23日發布了《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。標識制度的實施依賴于轉基因產品檢測技術。目前主要有兩類技術一類是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一類是基于蛋白質方法，如ELISA、試紙條等，其中PCR方法應用最廣。針對插入的外源DNA序列，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選檢測、 基因特異性檢測、構建特異性檢測和品系特異性檢測。通用元件篩選PCR檢測主要是以轉基因通用元件CaMV35S啟動子和NOS終止子為目的基因片段；基因特異性PCR檢測是以插入外源基因的特異性DNA片段作為目的檢測片段；品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由于每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，并且連接區序列是單拷貝，所以品系特異性檢測方法具有較高的特異性和準確性。品系特異性檢測已經成為目前轉基因檢測研究的重點， 并逐步地為國際各檢測實驗室所采用。在進行PCR檢測時，需要設置陽性對照以確保檢測過程的有效性和檢測結果的可靠性，特別是在定量PCR檢測中需要用含量準確的轉基因作物陽性標準品(CRMs)來制作標準曲線。然而，由于轉基因作物存在生物安全性和和現有技術的限制，轉基因作物陽性標準品很難獲得，這種現狀已成為檢測方法和應用的瓶頸。因此亟需研制能夠替代轉基因作物標準物質的新型陽性對照材料，以滿足不斷發展的轉基因檢測需求。標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉基因檢測目的外源基因和/或內標準基因的特異性片段的線性化重組質粒分子，研究表明質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準物質替代物。近年來，國內外眾多學者報道了一些用于轉基因產品檢測的標準質粒分子。標準質粒分子的容量也有一個大的提升，從最初的單一目標基因的質粒分子到多目標基因的質粒分子，這些質粒分子可同時涉及不同物種的轉基因作物的多個基因。目前，利用融合PCR技術可以實現多個基因片段的拼接，這樣利用一個標準質粒分子就可以實現對多個轉基因作物的檢測。

發明內容
本發明的目的在于提供一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法，使其可以代替陽性標準物質用于轉基因大豆的定性和定量PCR檢測。利用融合PCR技術的原理設計了大豆Lectin基因、35S啟動子、NOS終止子、PAT基因、EPSPS基因的PCR融合弓丨物，經過融合PCR擴增獲得了五基因的融合大片段。利用分子克隆技術將融合大片段插入到pMD 19-T Simple載體中，獲得了重組質粒分子pTLE5。本發明構建的標準質粒分子pTLE5可以作為檢測過程中的陽性對照，為解決轉基因作物檢測中標準物質缺乏的難題提供一條有效途徑并能有效地保障檢測工作的進行。本發明所述標準質粒分子含有大豆內參基因LeCtin、35S啟動子、NOS終止子、PAT 基因、EPSPS基因的一段序列，可以替代轉基因大豆品系GTS40-3-2和轉PAT基因大豆，用于定性和定量PCR檢測。本發明所述的一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法，包括以下步驟(1)利用GenBank數據庫查找并獲得大豆內參基因LeCtin、35S啟動子、NOS終止子、EPSPS基因、PAT基因；(2)利用I^rimer Premier 5. 0軟件設計PCR特異性引物并進行blast驗證；(3)分別擴增上述五個基因；(4)采用融合PCR方法將五個基因拼接成大片段；第一輪反應以轉基因大豆品系GTS40-3-2、轉基因大豆品系A2704-12基因組DNA 為模板，以權利要求3中對應引物進行PCR擴增；反應體系為總體積為50 μ 1，其中10倍 Taq 緩沖液 5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 4μ 1，模板(IOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1。反應程序為95°C5min ;30 個循環(94 °C 30sec，56. 8-59. 5 °C 30sec，72°C 30sec-60sec) ；72°C IOmin ；4°C保存；產物標記為 PLeel、P35s、Pnqs、Ppat、Peps ；第二輪反應，分兩步進行擴增第一步取第一輪反應產物各70ng，10倍Taq緩沖液5 μ 1，dNIPs (IOmM) 4 μ 1，用 ddH20補足至50 μ 1 ；其中P—與P35s相連接，Pnos與Ppat相連接；反應程序15個循環(94°C 20sec，58. 8-60°C 85sec)，4°C保存；第二步向第一步反應液中分別加入引物Lec-Pl和35S-P2各1 μ 1，引物Nos-Pl 禾口 ΡΑΤ-Ρ2 各 1 μ 1 ；反應程序94°C3minJ8 個循環(94°C 15sec，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合PCR產物割膠純化后標記為P^_35S、 1 NOS-PAT ο第三輪反應將產物PLeel_35S、 1 NOS-PAT 和Peps進行融合PCR反應。取第一輪反應產物Peps與第二輪中的產物P^hp Pnos_pat各2 μ 1作為模板，引物為Lec-Pl和Eps_P2擴增；反應體系為總體積50 μ 1，其中10倍Taq緩沖液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1 ；反應程序94°C30sec, 28 個循環(94°C 15sec,60°C lmin, 72°C 2min)，4°C保存；將I3Lecl-ms、Pnos-PAT 和Peps連接產物標記為 1 LE5°(5)回收純化PlE5，連接于pMD 19-T Simple載體，轉入大腸桿菌T0P10篩選得到標準質粒分子pTLE5。(6)標準質粒分子PTLE5的定性PCR檢測方法驗證。(7)標準質粒分子PTLE5的定量PCR檢測方法驗證。所述的定性PCR驗證，是指用定性PCR方法分析構建的標準質粒分子PTLE5中能擴增出與轉基因大豆品系GTS-40-3-2和A2704-12相同的大豆內源基因Lectin 1以及 35S、N0S, EPSPS和PAT基因的特異性序列，且對pTLE5中特異性基因的檢測靈敏度能滿足定性PCR檢測的要求。所述的定量PCR驗證，是指用定量PCR方法分析構建的標準質粒分子pTLE5中大豆內源基因Lectin 1和轉基因大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特異性序列的檢測極限、定量極限以及重復性和重演性等特性，以鑒定該標準質粒分子代替陽性標準物質的能力，以及實際應用于定量PCR檢測轉基因大豆品系GTS-40-3-2測定有效性。本發明公開的有效制備轉基因作物檢測標準分子對照物Lectin 1+35S+N0S+PAT+EPSPS方法所具有的有益結果在于，利用融合PCR首次構建了含有五個基因的標準質粒分子PTLE5。此標準質粒分子可以代替陽性標準物質用于轉基因大豆的定量 PCR檢測，從而解決了檢測過程中陽性標注物質缺乏的問題，在檢測過程中無需提供多種陽性基因組DNA作為陽性對照；將該標準質粒分子轉入大腸桿菌，可長期穩定保存；此外， 也可以在原有標準質粒分子的基礎上加入新的外源基因片段，以滿足日益增多的轉基因作物材料檢測的需要。此標準質粒分子PTLE5在實際檢測中具有特異性好、靈敏度高等優點， 應用該標準質粒分子進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的允許范圍內。因此，本發明中構建的標準質粒分子PTLE5完全適用于對轉基因大豆及其加工產品中的轉基因成分含量的定量分析。


圖1五基因及各融合片段PCR產物的凝膠電泳圖Ml =DNA marker II ；M2 :DNA marker III ；1 =Lecl ；2 :35S ；3 :N0S ；4 :PAT ；5 EPSPS ；6 :Lecl+35S ；7 :N0S+PAT ；8 :LE5圖2五基因標準質粒分子PTLE5的構建示意圖及測序結果斜體加粗的為融合PCR引物所在位置，方框內為定量引物和探針所在位置。在八基因之間引入了四個限制性內切酶Not I , Sal I , EcoR I和Xba I。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，下面提供轉基因大豆標準分子對照物的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋而不是限制分發明的范圍。下列實施例中未標明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件操作。實施例1 標準質粒分子的構建一、實驗材料轉基因大豆品系GTS40-3-2和A2704-12 ；非轉基因大豆品種；轉基因棉花品種。
二、實驗試劑pMD 19-T Simple Vector購自大連寶生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶Not I ,Sal
I、EcoR I , Xba I購自NEB北京有限公司；質?；蚪MDNA提取及純化采用北京天根生化科技有限公司研制的質粒小量提取試劑盒；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。三、實驗儀器TC-512型PCR擴增儀(英國TECHNE公司)；Geliance 200 DNA電泳凝膠成像儀 (美國PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白儀(美國Nano Drop公司)；離心機；恒溫水浴鍋；培養箱；天平等。四、試驗方法和過程1、植物基因組DNA提取-SDS法a、稱取0. Ig經粉碎機粉碎的大豆樣品，加入Iml 65°C預熱的2% SDS抽提液， 10 μ 1 RNase-A混勻，于65°C溫育30min，置于室溫后13000r離心lOmin。b、取上清加0. 6倍體積的KAc，冰浴20min后，13000r離心lOmin，取上清加2倍體積預冷無水乙醇，混勻。c、于-20°C靜置30min，13000r離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，短時間離心后棄上清，重復一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，-20°c保存。d、取2 μ 1提取的DNA樣品，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。利用核酸儀測定所提取的DNA濃度和純度。2、引物設計在GenBank中搜索大豆內源基因Lectin 1、轉基因大豆篩選序列35S和NOS、轉基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因序列，利用軟件I^rimer 5. 0設計5對定性PCR引物，分別用于擴增大豆內參基因特異性序列Lectin 1、轉基因大豆篩選序列35S和N0S、轉基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因特異性序列。具體的引物序列見表1。表1構建標準質粒分子的PCR弓丨物序列
H標方向引物序列產物大基因小(bp)Lectin 1Lec-PlATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTCLec-P2CAATGGAATCCGAGGAGT-CCCTTCGATCTGTCACATTT53035S35S-P1AAATGTGACAGATCGAAGG-GACTCCTCGGATTCCATTG35S-P2CCAAATGTTTGAACGATC-CCTCTCCAAATGAAATGAAC311NOSNos-PlGTTCATTTCATTTGGAGAGG-GATCGTTCAAACATTTGGNos-P2ACTCTTGTGGTGTTTGTGGC-GATCTAGTAACATAGATGA253PATPat-PlTCATCTATGTTACTAGATC-GCCACAAACACCACAAGAGTPat-P2GCGTCGACATGACGCACAATCCCACTATC-AACCAACATCATGCCATCCAC378Sad-P2GGAATTCGAGACCGCCGAACATGAA-CCTCAGCTTACCCACTTCAG335EPSPSEps-PlGGAATTCCTGAAGTGGGTAAGCTGAGG-TTCATGTTCGGCGGTCTCEps-P2GCTCTAGAATCATCGTGGCATCGTCC11993、五基因的獨立PCR擴增根據表1的引物，以轉基因大豆基因組DNA為模板，分別對大豆內源基因Lectin1、轉基因大豆的35S啟動子和NOS終止子、轉基因大豆外源基因PAT和EPSPS基因進行PCR 擴增。按照常規PCR方法進行各目的片段的獨立擴增。擴增使用Taq DNA聚合酶，各片段擴增的反應條件及擴增產物長度如表2所示。擴增產物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測， 確定目的條帶，切膠Gel Extraction MiniKit回收。凝膠制備過程中減少EB的加入量，要求EB濃度一般低于0. 15 μ g/ml。表2待融合片段擴增的反應條件及擴增產物長度
權利要求
1.一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其特征在于，通過特異性PCR引物從轉基因大豆基因組DNA中擴增出大豆內源基因Lectin 1、篩選序列35S和N0S、外源基因PAT和 EPSPS基因，利用融合PCR將這五個基因融合成一個片段，并構建到質粒載體PMDTM19-T Simple中，獲得標準質粒分子PTLE5。
2.權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其特征是，含有大豆內源基因特異性序列Lectin 1、篩選序列35S和N0S、轉基因大豆品系A2704-12轉化事件PAT基因特異性序列和轉基因大豆品系GTS40-3-2轉化事件EPSPS基因特異性序列，其先后順序為 Lectinl+35S+N0S+PAT+EPSPSo
3.根據權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其中 Lectinl+35S+N0S+PAT+EPSPS標準分子的引物序列如下
4. 一種如權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)利用生物學數據庫進行生物信息學分析，獲得大豆內源基因Lectin1、轉基因大豆篩選序列35S和N0S、轉基因大豆品系A2704-12外源基因PAT和轉基因大豆品系 GTS40-3-2外源基因EPSPS的特異性序列；(2)設計PCR特異性引物；(3)Lectin 1+35S+N0S+PAT+EPSPS 基因的融合 PCR 第一輪反應以轉基因大豆品系GTS40-3-2、轉基因大豆品系A2704-12基因組DNA為模板，以權利要求3中對應引物進行PCR擴增；反應體系為總體積為50 μ 1，其中10倍 Taq 緩沖液 5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 4μ 1，模板(IOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ I0反應程序為95°C 5min ；30 個循環(94 °C 30sec，56. 8 59. 5 °C 30sec，72°C 30 60sec) ；72°C IOmin ；4°C保存；產物標記為 PLecl、P35S、PNOS、PPAT、PEPS ；第二輪反應，分兩步進行擴增第一步取第一輪反應產物各70ng，10倍Taq緩沖液5μ l，dNIPs(10mM)4y 1，用ddH20 補足至50 μ 1 ；其中PLecl與P35S相連接，PNOS與PPAT相連接；反應程序15 個循環(94°C 20sec，58. 8 60°C 85sec)，4°C保存；第二步向第一步反應液中分別加入引物Lec-Pl和35S-P2各1 μ 1，引物Nos-Pl和PAT-P2 各 1 μ 1 ；反應程序94°C 3min,28 個循環(94°C 15sec，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合PCR產物割膠純化后標記為PLecl-35S、PNOS-PAT0第三輪反應將產物PLecl-35S、PNOS-PAT和PEPS進行融合PCR反應。 取第一輪反應產物PEPS與第二輪中的產物PLecl-35S、PNOS-PAT各2 μ 1作為模板， 引物為Lec-Pl和Eps_P2擴增；反應體系為總體積50 μ 1，其中10倍Taq緩沖液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1 ；反應程序94°C 30secJ8 個循環(94 °C 15sec,60°C lmin，72°C 2min)，4 °C 保存；將 PLecl-35S、PNOS-PAT 和 PEPS 連接產物標記為 PLE5。(4)回收純化PLE5，連接于pMDTM19-T Simple載體，獲得標準質粒分子pTLE5。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因作物檢測中必要的標準質粒分子及其構建方法。一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法，所述標準質粒分子包含大豆內源基因Lectin特異性片段、35S啟動子和NOS終止子特異性片段、轉基因大豆品系A2704-12中外源基因PAT特異性片段、轉基因大豆GTS40-3-2品系中外源基因EPSPS特異性片段。通過分析這五個基因的特異性序列，設計了特異性PCR引物擴增獲得了五個目的基因片段。通過融合PCR方法將這五個基因融合成一個長片段，克隆到質粒載體pMDTM19-T Simple上得到重組質粒分子pTLE5。本發明中構建的標準質粒分子完全可以代替陽性標準品，該標準質粒分子完全適用于對轉基因大豆品系GTS40-3-2和轉基因大豆品系A2704-12的篩選、結構基因特異性的定性和定量PCR分析和檢測。如有新的轉基因材料出現，可在原標準分子的基礎上加入新的外源基因片段，滿足日益增多的轉基因作物材料的檢測需要。
文檔編號C12Q1/68GK102409082SQ201010286899
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月20日 優先權日2010年9月20日
發明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 王秀敏 申請人:中國農業科學院飼料研究所