本發明屬分子生物學領域，具體涉及大豆類枯草桿菌蛋白酶基因（Gmsbt1.6-3）及應用。

背景技術：

絲氨酸蛋白酶(Serine protease)是一類功能域以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，通過對蛋白酶原的激活或抑制起調節因子的作用。絲氨酸蛋白酶是重要的蛋白水解酶，約有30個家族，分屬于六大類：糜蛋白酶、類枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶Ｃ、丙氨酸蛋白酶、阻遏蛋白LexA、三磷酸腺苷依賴型絲氨酸蛋白酶。其中，類枯草桿菌蛋白酶家族，是絲氨酸蛋白酶中最大的家族之一。

類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)廣泛存在于細菌、真菌和寄生蟲等生物中。這類蛋白酶在結構上具有典型的 Asp/Ser/His 催化結構域，具有廣泛的生理學功能。研究表明，類枯草桿菌蛋白酶與病原性細菌、真菌的致病性相關，在真菌孢子形成過程中的蛋白質充分降解及細胞自噬過程等方面起非常重要的作用。木麻黃中的cg12基因在根瘤形成早期受弗蘭克氏菌（Frankia）誘導表達，參與粗枝木麻黃和弗蘭克氏菌的共生過程。番茄P69B和P69C在丁香假單胞菌（Pseudomonas syrin-gae）感染和水楊酸（Salicylic acid）誘導下表達，P69E和P69F也參與對病原入侵的抵御。鐘云等以黃龍病（HLB）侵染的紅橘根系為材料，通過轉錄組測序發現一個類枯草桿菌蛋白酶基因（CICLE-v10027863mg, CcSubtilisin）的表達上調達5.53倍，通過iTRAQ分析發現該基因編碼的蛋白水平上調3.9倍，研究表明該基因及其蛋白受 HLB侵染誘導，可能在柑橘宿主與黃龍病菌的互作中起重要作用。但關于大豆中類枯草桿菌蛋白酶基因的功能研究及與疫霉根腐病相互關系方面的研究目前還未有報道。

本研究通過基因工程技術，從大豆中分離克隆了大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并構建該基因的植物過表達載體和RNAi表達載體，通過對大豆植株的轉化，驗證新基因Gmsbt1.6-3的功能，為該基因的利用奠定了基礎，為抗大豆疫霉根腐病新品種的培育提供基因資源和基礎材料。

技術實現要素：

本發明的目的是為提高植物的抗病性，而提供一種大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3。

大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；

它來源于大豆根系突變體材料M18；

大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3在培育抗疫霉根腐病植物品種的應用；

所述的疫霉根腐病為大豆疫霉根腐病；

本發明提供了大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它是從大豆根系突變體材料M18中分離克隆的大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并構建該基因的植物過表達載體和RNAi表達載體，通過對大豆植株的轉化，轉化植株具有抗疫霉根腐病的功能，為抗大豆疫霉根腐病新品種的培育提供基因資源和基礎材料。

附圖說明

圖 1 Gmsbt1.6-3基因核心片段的 PCR 擴增電泳圖； M: DNA 標準分子量； 1：PCR 產物；

圖2 Gmsbt1.6-3蛋白三維結構模擬；

圖3 Gmsbt1.6-3蛋白系統進化樹；

圖4 植物過表達載體的構建；A.植物表達載體pCAMBIA3301的雙酶切；B. 目標片段的PCR擴增；

圖5 植物過表達載體的構建及驗證，A.雙酶切驗證；B. PCR驗證；

圖6 植物過表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的T-DNA區結構；

圖7 植物干擾表達載體的構建；A. 植物表達載體pCAMBIA3301的雙酶切；B. 目標片段的PCR擴增；

圖8 植物干擾表達載體的構建及驗證；A. 雙酶切驗證；B. PCR驗證；

圖9 植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的T-DNA區結構；

圖 10 農桿菌介導的大豆遺傳轉化；A：萌發階段； B：浸染后共培養階段；C：浸染后篩選培養階段；D：伸長培養階段；E：生根培養階段；F-G：移栽培養階段；

圖11 T0代轉化植株的PCR檢測；A.篩選標記基因bar；B. 35S啟動子；C. NOS終止子；

圖12 T1代轉化植株的PCR檢測；A.篩選標記基因bar；B. 35S啟動子；C. NOS終止子

M：DNA分子量標準；P：質粒陽性對照；N：水陰性對照；CK：未轉基因植株(陰性對照）；1-3：轉基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖13 T2代轉化植株的PCR檢測；A.篩選標記基因bar；B. 35S啟動子；C. NOS終止子

M：DNA分子量標準；P：質粒陽性對照；N：水陰性對照；CK：未轉基因植株(陰性對照）；1-3：轉基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖14 T2代Southern blot檢測；M：DNA分子量標準；P:陽性對照;CK:陰性對照(未經轉化的大豆植株);1-3：轉基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖15 Gmsbt1.6-3基因在轉植物過表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的植株中的相對表達量；

圖16 Gmsbt1.6-3基因在轉植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的植株中的相對表達量。

具體實施方式

實施例1基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

大豆（Glycine max）品種吉農18，大豆根系突變體材料M18，由吉林農業大學植物生物技術中心提供。

基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

使用TAKARA公司生產的RNAiso試劑盒從大豆M18苗期根系組織提取總RNA，以反轉錄的cDNA為模板，根據RNA-seq測序結果序列，設計特異引物sbt，采用RT-PCR方法擴增目的片段并測序，試驗所需PCR擴增引物見表1。

表1 PCR引物序列

根據前期篩選得到的Gmsbt1.6-3序列片段設計擴增長度為764bp 的特異引物sbt，經PCR 擴增后，得到一條與預期大小相同的核酸條帶（圖1），將 PCR 產物克隆至 PMD18-T 載體后進行測序。測序結果與 NCBI中數據進行比對，未找到與目的基因相一致的已知序列，初步判斷克隆得到的基因為未知的新基因。通過比對發現，目標基因與序列號為XM_003553760.3的序列相比同源性最高，在98%覆蓋度水平上的一致性達到 98%，且與其他的Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6基因序列比對相似性較高，推測目標基因是Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6家族的成員之一，因此為該目標基因命名為Gmsbt1.6-3。

實施例2Gmsbt1.6-3基因的生物信息學分析及系統進化樹的構建

將Gmsbt1.6-3基因全序列連入克隆載體pMD18-T Vector，對重組載體進行測序后進行生物信息學分析，測序由北京三博遠志生物技術有限公司完成。

利用在線分析程序ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對新基因序列進行可能的開放閱讀框分析，通過 DNAMAN 軟件將新基因ORF翻譯成氨基酸序列；利用ProtParam軟件(http//www. web. expasy. org / protparam/ ) 預測蛋白質序列理論參數；利用SWISS-MODEL在線軟件構建Gmsbt1.6-3基因的蛋白質立體結構；利用Protscale軟件( http: / /web. expasy. org / /protscale /預測蛋白的親疏水性。

在 NCBI 網站中下載所有已知sbt基因序列，通過 DNAMAN 軟件對蛋白質進行多重比對，分析同源性，構建系統進化樹。

通過在線分析程序 ORF FINDER對新基因Gmsbt1.6-3的核酸序列進行分析，并預測理論上的編碼區的位置。分析結果表明，Gmsbt1.6-3基因理論上的開放閱讀框為591可編碼197個氨基酸殘基。

ProtParam軟件分析其相對分子量為19731.98，理論等電點(PI) 為4.64，正電荷氨基酸殘基總數(Arg+Lys) 為11，負電荷氨基酸殘基總數(Asp+Glu)為17，分子式為C₈₅₉H₁₃₂₆N₂₃₄O₂₈₀S₁₀。氨基酸組分析表明: 甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）含量較高分別占14.3%、12.2%、11.2%。總平均疏水指數Grand average of hydropathicity (GRAVY)為0.002。

利用ProMod version 3.70 軟件構建Gmsbt1.6-3蛋白3D 立體結構圖，其中含有類枯草桿菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化結構域（圖2）。

搜索NCBI網站上植物已知的全部大豆sbt基因的氨基酸序列，利用DNAMAN軟件建立Gmsbt1.6-3蛋白系統進化樹（見圖2）。使用 Neighbor-Joining 統計法，根據各Gmsbt1.6-3蛋白的序列同源性將進化分析結果分為三組，蛋白Gmsbt1.6-3與大豆Gmsbt1.6-1、Gmsbt1.6-2的同源性最高，遺傳距離最近，推測Gmsbt1.6-3有可能是大豆Gmsbt1.6基因家族中還未發現的新基因成員。

實施例3植物表達載體的構建及遺傳轉化

利用限制性內切酶BglII和PmlI對植物表達載體pCAMBIA3301進行雙酶切，利用Seamless Assembly Clonng Kit試劑盒，將克隆得到的Gmsbt1.6-3全長基因替換3301上原有的GUS基因。構建以Bar為篩選標記，CaMV35S啟動子啟動目標基因Gmsbt1.6-3的pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3植物過表達載體。

利用BglII和PmlI限制性內切酶對植物表達載體pCAMBIA3301進行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbt-over對克隆載體Pmd18-T- Gmsbt1.6-3進行PCR擴增，得到大小591bp的Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段（圖4），利用T4連接酶將Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段連入植物表達載體pCAMBIA3301。

對構建成功的植物過表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3進行PCR和雙酶切鑒定，均得到與預期大小相符的Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段591bp（圖5），對其進行測序，測序結果正確，說明植物過表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3構建成功（圖6）。

采用同樣方法，將3301上原有的GUS基因替換為Gmsbt1.6-3正義+內含子+Gmsbt1.6-3反義片段，構建pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植物干擾表達載體。

利用BglII和PmlI限制性內切酶對植物表達載體pCAMBIA3301進行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbtZ、SSR、sbtF分別對克隆載體Pmd18-T-Gmsbt1.6-3和Pmd18-T-SSR進行PCR擴增，得到大小為591bp的目的基因正義片段、205bp的SSR內含子片段、和591bp的目的基因反義片段（圖7），利用無縫克隆連接酶將Gmsbt1.6-3正義片段、內含子SSR和Gmsbt1.6-3反義片段同時連入植物表達載體pCAMBIA3301，得到植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi。

對構建成功的植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi進行雙酶切和PCR鑒定。用BglII和PmlI雙酶切該質粒，得到一條大小約為1387bp的sbtZ-SSR-sbtF干擾片段；分別對Gmsbt1.6-3正義片段、反義片段、SSR內含子、進行特異性擴增，得到的擴增條帶都與預期大小相符，得到大小為591bp的Gmsbt1.6-3正義片段、205bp的SSR內含子片段、591bp的Gmsbt1.6-3反義片段（圖8）。對其進行測序，測序結果正確，說明植物干擾表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi構建成功（圖9）。

將構建好的植物過表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3和植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi，采用農桿菌介導的方法轉化大豆材料M18。

實施例4轉化植株的分子檢測

采用改良的CTAB法，從大豆葉片中提取基因組DNA，將其作為模板，以載體質粒為陽性對照，以未轉化植株為陰性對照，分別以篩選標記基因bar、35S啟動子和NOS終止子的特異性引物（表1）進行PCR擴增。

對PCR檢測為陽性的轉基因植株，進行Southern雜交檢測。以純化的篩選標記基因bar為模板制備探針，采用隨機引物標記法進行標記，雜交及檢測的其他步驟均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII試劑盒的說明書操作。

以大豆突變體材料M18作為受體，將構建好的植物過表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3和植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi采用農桿菌介導的方法轉化大豆子葉節，經萌發培養、恢復培養、共培養、選擇培養、伸長培養、生根、煉苗、移栽培養，獲得抗性轉化植株，并在溫室內進行培養和加代。

通過遺傳轉化，共獲得抗性苗10株，其中4株為轉植物過表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的轉化植株，對篩選標記Bar基因、35S啟動子、NOS終止子三個外源片段進行PCR檢測，均檢測為陽性的有3株，分別標號OEA1-OEA3（OEA，over expression- agrobacterium-mediated method）。6株轉植物干擾表達載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi的抗性植株中，均檢測為陽性的有4株，分別標號IEA1-IEA4（IEA，interference expression- agrobacterium-mediated method）（圖11）。

將檢測為陽性的植株在人工氣候室內培養至成熟，收獲籽粒，在溫室內進行加代，對T1代植株進行PCR檢測，Gmsbt1.6-3基因過表達植株OEA1-OEA3、干擾表達植株IEA1-IEA4的T1代植株均檢測到了篩選標記基因bar、35S啟動子和NOS終止子（圖12）。

將檢測為陽性的T1代植株在人工氣候室內培養至成熟，收獲籽粒，在溫室內進行加代，對T2代植株進行PCR檢測，Gmsbt1.6-3基因過表達植株OEA1-OEA3、干擾表達植株IEA1-IEA4的T2代植株均檢測到了篩選標記基因bar、35S啟動子和NOS終止子（圖13）。

對T2代轉基因陽性植株進行southern雜交檢測，選用HindⅢ限制性內切酶，對外源篩選標記基因bar進行Southern雜交分析，檢測外源基因在大豆M18的整合情況，進一步驗證轉化事件的準確性。雜交結果顯示PCR檢測為陽性的7株轉基因植株均有明顯的雜交信號，且雜交帶的大小、位置互不相同（圖14），說明外源基因bar已經整合到大豆的基因組中，且整合形式均為單拷貝。

實施例5接菌處理后對大豆Gmsbt1.6-3基因相對表達量的影響

采用“下胚軸侵染法”對轉化陽性材料進行疫霉根腐病的接菌處理，鑒定標準依據大豆種質資源數據質量標準進行。選擇生長初期的大豆植株，對生真葉長出至完全平展后，接種大豆疫霉根腐病病原菌，接種后對傷口進行保濕處理7天，溫度控制在20-25℃、濕度保持在90%以上。接種后5天，提取大豆的根部組織總 RNA，對目的基因Gmsbt1.6-3進行相對表達水平的檢測。

溫室內種植T2代轉基因陽性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4，幼苗期通過“下胚軸侵染法”接種大豆疫霉根腐病病菌。接菌后進行保濕處理，環境溫度控制在20-25℃，濕度保持在90%以上，接菌處理5天后，提取根部組織總RNA，對目的基因Gmsbt1.6-3進行Real-time PCR測定。采用2^-ΔΔCT法計算數據，分析目的基因的相對表達量。

在大豆根部中，設定對照植株M18未侵染疫霉根腐病菌的Gmsbt1.6-3表達量為1，其他轉化材料及其他處理的表達水平都對比于這個設定值。如圖15所示，未接菌條件下，轉植物過表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3的Gmsbt1.6-3基因相對表達量分別為2.56、3.0467、2.81，都明顯高于對照M18。接種大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相對表達量有顯著增加，Gmsbt1.6-3基因在對照M18植株中的相對表達量上升到了2.8867，在轉植物過表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3中，分別為5.2、6.123、5.243。說明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導表達。

未接菌條件下，與對照植株M18相比，轉植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的陽性植株Gmsbt1.6-3基因的相對表達量都受到了明顯的抑制，IEA1-IEA4植株中Gmsbt1.6-3基因分別被抑制了37.33%、57.67%、50.67%、33.67%。接種大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相對表達量有顯著增加，對照M18植株中該基因的相對表達量上升到了2.563，轉植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株的干擾效果受病原菌侵染影響有所下降，Gmsbt1.6-3基因在陽性植株IEA1-IEA4中分別被抑制了23%、37%、22.667%、16%，進一步說明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導表達（圖16）。

實施例6轉化植株的抗病性鑒定

采用“下胚軸侵染法”對轉化陽性材料進行疫霉根腐病的接菌處理，鑒定標準依據大豆種質資源數據質量標準進行。選擇生長初期的大豆植株，對生真葉長出至完全平展后，接種大豆疫霉根腐病病原菌，接種后對傷口進行保濕處理7天，溫度控制在20-25℃、濕度保持在90%以上。接種后5天，調查轉基因株系和對照受體品種的死亡率。株系或品種有 70%或以上的植株死亡則為感病(susceptible，S)；70%或以上植株正常生長則為抗病(resistant，R)；31%-69%植株死亡的株系或品種為中抗 (moderately resistant，MR)。

使用假設測驗對 T2代轉基因陽性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4疫霉根腐病抗病性鑒定所得數據進行分析，統計死亡率鑒定結果表明，轉基因陽性株系OEA1-OEA3對疫霉菌 1 號生理小種抗性水平較受體對照品種顯著提高，其中OEA2株系的接種死亡率最低，為30%，達到了抗性水平；OEA1、OEA3株系的抗性水平同對照CK都一樣，都是中感水平，但接種死亡率分別為36.67%和40%，顯著低于對照，說明轉植物過表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3對大豆疫霉根腐病根腐病的抗性得到了顯著的提高（表2）。

相反的，轉基因陽性株系IEA1-IEA4對疫霉菌 1 號生理小種抗性水平較受體對照品種顯著降低，其中IEA3株系的接種死亡率最高，為76.67%，其次是IEA2為73.33%，都達到了感病水平；IEA1、IEA4株系的抗性水平同對照CK都一樣，都是中感水平，但接種死亡率分別為63.33%和66.67%，顯著高于對照，說明轉植物干擾表達載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株IEA1-IEA4對大豆疫霉根腐病根腐病的抗性受到了明顯的抑制。

本試驗采用RT-PCR的方法，從大豆苗期根系的cDNA中成功分離克隆了一個新的大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，該基因在結構上具有類枯草桿菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化結構。研究表明，類枯草桿菌蛋白酶在結構上雖然有相似性，但在其表達和功能上存在差異。在擬南芥中，SDD1在氣孔前體細胞中強烈表達，與調節氣孔密度的信號傳導有關；ALE1基因在種子萌發過程中特異表達，與擬南芥胚發育過程中的角質層形成和表皮分化時信號肽的產生有關；AIR3在側根形成過程中表達，參與調控側根原基數量；Ara12在角果、莖及葉片中表達，參與植株形態建成。在番茄中，P69A 在除根和花之外的所有植物器官中表達且與細胞延伸相關；P69D除不在根中表達外，在其他器官中都有表達，與細胞分裂、延伸相關。大豆中，SCS1在種皮中表達量最高，與厚壁組織的分化有關；SLP-1在處于發育期種子的種皮中表達，而SLP-2主要在發芽種子的子葉中表達，這兩個基因都參與種子萌發。粗枝木麻黃中，cg12在根瘤形成早期受弗蘭克氏菌（Frankia）誘導表達，參與粗枝木麻黃和弗蘭克氏菌的共生過程。

本研究通過在大豆植株中對Gmsbt1.6-3基因進行過量表達和干擾表達，鑒定新基因功能。接種大豆疫霉根腐病病原菌，進行熒光定量PCR分析結果表明，大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導表達，該基因在大豆抗病反應中的作用及調控機制有待于進一步研究與驗證。

<110> 吉林農業大學

<120> 大豆類枯草桿菌蛋白酶基因及應用

<160> 1

<210> 1

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

aagtggaagg gccactgcgt tgctgctaaa gactttcccc ccacctcctg caaccggaaa 60

ctcatcggag ctcgctactt ctgcgctggc tacgaagcca ccaacggcaa aatgaacgac 120

actttggagt cccgttcccc gagagactcc gacggtcacg gcacccacac ggcttccatc 180

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tactcttcct ctctttgctt ggaagattcg ttggatccct agtctgtgtc aaaaaagatt 720

aatgtttgtg gtcgaggcgt caattcaaga gcagccgctt aaaa 764