專利名稱：豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，涉及豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產(chǎn)方 法。
背景技術：
豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征，是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。2006年 夏秋季，我國南方部分省份發(fā)生豬“高熱病”疫情，農(nóng)業(yè)部積極組織科研人員聯(lián)合攻關，確定 豬藍耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴 峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍耳病的治療，免疫接種是防 制該病的最有效方法，目前商品化的藍耳病疫苗主要是由經(jīng)典株制備的弱毒苗和由變異株 制備的滅活苗。而這兩種疫苗生產(chǎn)的關鍵點就是作為抗原的病毒的生產(chǎn)。病毒株生長的培 養(yǎng)條件對于獲得該株系的所希望的高產(chǎn)量來說具有重大意義。為了最大化所想要的病毒的產(chǎn)量，系統(tǒng)和培養(yǎng)條件都必須特定地適合于提供對于 產(chǎn)生所想要的病毒來說有利的環(huán)境。中國專利CN101307304A公開了利用Marc_145細胞生產(chǎn)藍耳病病毒JXAl-R株的 方法，其采用的方法是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝。現(xiàn)有的藍耳病病毒大規(guī)模生產(chǎn)采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn) 的傳統(tǒng)培養(yǎng)模式，有如下缺點(1)作坊式生產(chǎn)，勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細 胞生長的表面積小；(2)細胞生長密度低，產(chǎn)量低；(3)收獲病毒液后，后續(xù)混合，存在批間 差，均一性不好；(4)培養(yǎng)時各項監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。上述缺點造成了藍耳病 病毒滴度不高，限制了產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量的提高和生產(chǎn)成本的降低。因此，本領域中仍迫切 需要能夠進一步改善生產(chǎn)藍耳病病毒疫苗的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是提供一種藍耳病病毒及疫苗的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)微載體生物反應器中，加入1.5X107 4. 5X107Cells/g微載體的傳代細胞及 細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結(jié)合后，啟動細胞培養(yǎng)程序，培 養(yǎng)傳代細胞；2)上述傳代細胞培養(yǎng)至6. 0X109cells/L 2. 6X101Qcells/L時換用細胞維持 液，按照感染復數(shù)為Μ. 0. I. = 0. 0001 1. 5接種豬藍耳病病毒，啟動病毒吸附程序，使病 毒與微載體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養(yǎng)程序，擴增豬藍耳病病毒；3)生物反應器中收獲豬藍耳病病毒液；4)收獲的病毒液加入滅活劑，滅活后加入佐劑、乳化劑，制得豬藍耳病滅活疫苗； 收獲的病毒液加入凍干保護劑進行凍干，制得豬藍耳病活疫苗。、優(yōu)選地，本發(fā)明所述的生物反應器為微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的生物反應器為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器。優(yōu)選地，所述微載體為片狀、球形或網(wǎng)狀。
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優(yōu)選地，所述的微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。更優(yōu)選地，所述的微載體為網(wǎng)狀的聚酯纖維，優(yōu)選地，所述的微載體的添加量為40 75g/L。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的生物反應器為潮汐式生物反應器的程序載體上下運行頻 率為0 lOmm/s，培養(yǎng)液面在載體瓶中上下端點停留時間為O 2min。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的步驟3)中所述的豬藍耳病病毒液的體積為2. 5L 1000L。優(yōu)選地，本發(fā)明所述制苗用細胞為CL2621細胞、MA104細胞、Marc_145細胞或其他 傳代細胞株。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟2)中所述細胞生長液，配方為MEM培養(yǎng)基加3% 5%的牛血 清，培養(yǎng)條件為溫度36. 5°C 37. 5°C，pH值調(diào)節(jié)7. O 8. O，溶氧調(diào)節(jié)10% 80%，二氧化 碳濃度為0% 10%。。優(yōu)選地，步驟3)中所述細胞維持液使用MEM培養(yǎng)基加0. 5% 1. 5%的牛血清配 制而成，其培養(yǎng)條件為控制在36. 5°C 37. 5°C，pH調(diào)節(jié)7. 2 7. 5，溶氧調(diào)節(jié)25% 80%， 二氧化碳濃度為1% 5%。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟3)中所述的收獲病毒液為分批培養(yǎng)收獲。本發(fā)明的另一方面為由上述方法制備的豬藍耳病病毒。本發(fā)明的又一方面為由上述方法制備豬藍耳病病毒在疫苗生產(chǎn)中的應用。本發(fā)明采用把Marc-145細胞接種到生物反應器中，待其長到一定密度后，接種豬 藍耳病病毒液，在生產(chǎn)過程中調(diào)節(jié)各種控制參數(shù)，如PH值、DO值、灌流速度、優(yōu)化接種病毒 的感染復數(shù)(Μ. 0. I.)，同時，還要掌握好接種病毒時細胞的密度和接毒時間等，使病毒在高 密度的生物反應器中高效繁殖，分批培養(yǎng)收獲病毒，并能進一步提高病毒的滴度。技術效果與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的豬藍耳病病毒及疫苗的生產(chǎn)方法，具有以下有益效 果(1)毒價高運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術高密度培養(yǎng)生產(chǎn)的病毒效價比傳統(tǒng) 的轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)的豬藍耳病病毒效價要高出傳統(tǒng)方法10倍以上。(2)生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高目前國內(nèi)采用攪拌式懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)動物細 胞，單臺生物反應器最大規(guī)模不超過IOOL ；而本發(fā)明采用新的技術參數(shù)，運用潮汐式微載 體懸浮培養(yǎng)技術培養(yǎng)動物細胞，單臺生物反應器規(guī)模達500L，最大可達1000L，單臺規(guī)模提 高5 10倍。(3)分批封閉式培養(yǎng)、收獲病毒本發(fā)明的方法可以全封閉生產(chǎn)，自動換液，連續(xù) 收獲方式收集病毒液，減少了污染的機率，產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定，批間差異小。本發(fā)明方法制 備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗 的免疫能力。本發(fā)明方法解決了傳統(tǒng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異大、批間 差異大的問題。本發(fā)明方法，可直接線性放大用于生產(chǎn)。(4)生產(chǎn)成本相對較低、產(chǎn)品質(zhì)量高且穩(wěn)定傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的豬藍耳病 病毒效價僅為108 5TCID5(l/ml，每ml的生產(chǎn)成本為3元，而本發(fā)明工藝生產(chǎn)的豬藍耳病病毒 效價可達109_5TCID5cZml，每ml的生產(chǎn)成本為0. 5元，產(chǎn)品成本下降6倍，質(zhì)量提高提高10 倍(以毒價計)。
(5)操作方便、操作空間小本發(fā)明方法中采用的載體為網(wǎng)狀的聚酯纖維，具有親 水性和生物無害性，Ig載體可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內(nèi)極大的增大了細胞 的貼壁面積，增加了細胞生長的密度，細胞數(shù)可達到1.0X109cells/g微載體以上，其效能 為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的數(shù)十倍，可以節(jié)省許多成本及人力。本發(fā)明500L工作體積僅需20m2 的操作區(qū)域，僅需2人就可完成全部操作，而傳統(tǒng)工藝需要2000個大方瓶或轉(zhuǎn)瓶，最少需要 600m2的操作區(qū)域，最少需要100人才能完成。采用本發(fā)明方法，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)時單 批產(chǎn)量不高、批間差異大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、勞動強度大、生產(chǎn)成本高等問題。(6)工藝參數(shù)控制精確本發(fā)明運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術生產(chǎn)時可控參數(shù) 有溫度、PH值、溶氧量、二氧化碳濃度、載體濃度，可實現(xiàn)在線監(jiān)測的參數(shù)有葡萄糖、乳酸和 銨離子濃度，批次質(zhì)量穩(wěn)定，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異 大。(7)本發(fā)明利用生物反應器，解決抗原濃度低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大的問題，而 且能連續(xù)培養(yǎng)、占地小、生產(chǎn)規(guī)模大、無攪拌式懸浮培養(yǎng)時對細胞形成的剪切力、無氣泡產(chǎn) 生、對細胞傷害小。綜上所述，本發(fā)明通過優(yōu)化的方法使用微載體懸浮生物反應器系統(tǒng)培養(yǎng)的藍耳病 病毒數(shù)量和滴度顯著高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)10 100倍，因此在制備疫苗的后工藝中，不但提高了 疫苗產(chǎn)量，也可大量減少殘余細胞宿主蛋白、殘余細胞DNA、殘余牛血清等異源物質(zhì)的含量， 進一步提高了疫苗接種的安全性。


圖1為細胞接種1天時微載體上的顯微照片；圖2為細胞培養(yǎng)5天時微載體上的顯微照片；圖3為病毒接種3天時微載體上的顯微照片；圖4為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器結(jié)構示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中使用了潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器，其他類型的微載體懸 浮培養(yǎng)生物反應器，如攪拌式、旋轉(zhuǎn)式或灌注式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器，均可以使用 本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒或疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明使用潮汐式微載體懸浮培 養(yǎng)生物反應器，可以提高培養(yǎng)時的培養(yǎng)基和溶解氧的供應，無氣泡并且剪切力小，對細胞傷害小。本發(fā)明實施例中采用的生物反應器為潮汐式生物反應器。結(jié)構示意圖如圖4所 示。其中，各個標記分別為恒溫攪拌系統(tǒng)1，培養(yǎng)基恒溫備料槽體2，自動饋料系統(tǒng)3，恒溫 培養(yǎng)箱4，載體瓶5，微載體6，DO檢測器及pH控制器7，收集器8。培養(yǎng)系統(tǒng)分為兩部份； 一個是載體瓶5，另一個是培養(yǎng)基攪拌袋(槽)。細胞固定在載體瓶，培養(yǎng)基流動于載體瓶 與攪拌槽之間，造成間歇性的暴露與淹沒載體。本發(fā)明試驗了載體瓶5體積為0. 5L、2. 5L、 51^、1(^、2(^、5(^、10(^，均能對溫度4!1值、溶解氧、二氧化碳濃度自動控制。本發(fā)明的實施 例中載體瓶體積為20L。本發(fā)明試驗了如下豬藍耳病病毒株及疫苗的制備方法豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl株(保藏號No. 1964保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)、豬藍耳病病病 毒弱毒株NVDC-JXAl-R株(保藏號No. 2467保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)、 ATCCVR-2332株、CH-IR株(保藏號No. 1883保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)及 HBR株(保藏號No. 2657保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)。優(yōu)選地，本發(fā)明實施 例中使用了豬藍耳病病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl株。本發(fā)明實施例中，傳代細胞使用了非洲綠猴腎細胞(Marc-145)，其他本領域常用 的傳代細胞如CL2621細胞、MA104細胞，也可用于本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒 或疫苗。本發(fā)明所述方法中，在細胞吸附微載體階段與細胞培養(yǎng)階段，啟動了細胞吸附程 序與細胞培養(yǎng)程序，本發(fā)明實施例中優(yōu)化了反應器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不僅限于實 施例中的參數(shù)，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術啟示，根據(jù)不同的生物反應器， 調(diào)整相應的參數(shù)，達到微載體與細胞充分結(jié)合后，大量擴增細胞的目的。本發(fā)明所述方法中，在病毒吸附微載體上的細胞階段與病毒培養(yǎng)階段，啟動了病 毒吸附程序與病毒培養(yǎng)程序，本發(fā)明實施例中優(yōu)化了反應器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不 僅限于實施例中的參數(shù)，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術啟示，根據(jù)不同的生 物反應器，調(diào)整相應的參數(shù)，達到病毒與細胞及微載體充分結(jié)合后，大量擴增病毒的目的。本發(fā)明試驗了微載體密度為40 75g/L，加入1.5X IO7 3. 5X IO7Cells/ g微載體的傳代細胞，更優(yōu)地，本發(fā)明實施例中使用的微載體密度為65g/L，細胞密度為 2. 0X107cells/g 微載體。本發(fā)明試驗了當傳代細胞的密度達到6. 0X109cells/L 2. 6X101Qcells/L時， 即密度達到初始密度的10 20倍時，換用細胞維持液，起始病毒吸附與培養(yǎng)程序。優(yōu)選 地，本發(fā)明實施例中當細胞密度達到2.0X101(lcellS/L時，換用細胞維持液，啟動病毒吸附
與培養(yǎng)程序。本發(fā)明試驗了按照感染復數(shù)為Μ. 0. I. = 0. 0001 1. 5接種豬藍耳病病毒，收獲 的豬藍耳病病毒毒價最高，優(yōu)選地，本發(fā)明實施例中使用了 Μ. 0. I. = 0. 001接種病毒，啟動 病毒吸附程序與病毒培養(yǎng)程序，擴增豬藍耳病病毒。本發(fā)明收獲培養(yǎng)液，制備豬藍耳病病毒液，采用分批培養(yǎng)收獲病毒液，即將培養(yǎng)物 和培養(yǎng)液一次性裝入反應器內(nèi)，進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間反應后，將整個反應系取出。本發(fā)明實施例中疫苗的制備方法為加入甲醛滅活劑，滅活后加入油性佐劑、乳化 劑，制得豬藍耳病病毒滅活苗疫苗。其他常用的滅活方法或滅活劑，如丙內(nèi)脂，也可用 于制備本發(fā)明所述疫苗。本領域其他常用的疫苗制備的佐劑和乳化劑，如異丙肌苷，也可用 于制備本發(fā)明所述疫苗。本發(fā)明實施例中疫苗的制備方法為加入蔗糖、牛奶等保護劑，凍干 后，制得豬藍耳病病毒活疫苗。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1潮汐式微載體懸浮生物反應器大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒及活疫苗本實施例中所用的微載體為聚酯纖維，用于制備藍耳病病毒抗原的病毒株為 NVDC-JXAl-R毒株(保藏號No. 2467保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)，以對藍耳病病毒具有良好敏感性的細胞系非洲綠猴腎細胞(Marc-145細胞)，作為制苗用細胞系，選 用20L載體瓶潮汐式生物反應器。1).細胞的接種與培養(yǎng)先使用細胞生長液為(含5%牛血清MEM培養(yǎng)基，pH值為7. 25)利用轉(zhuǎn)瓶擴增培 養(yǎng)Marc-145細胞。20L生物反應器中，加入無菌載體濃度1300g，把轉(zhuǎn)瓶細胞消化分散后以 細胞密度為2.0X107cells/g微載體接入20L生物反應器中，使之與載體結(jié)合，微載體和細 胞結(jié)合的電子顯微鏡圖如圖1、2、3所示。圖1為細胞接種1天時微載體上的顯微照片；此 時Marc-145細胞培養(yǎng)于載體之上基本貼附完全，細胞形態(tài)正常，但細胞密度較小。圖2為 細胞培養(yǎng)5天時微載體上的顯微照片；培養(yǎng)至第6天Marc-145細胞密度較高，緊密貼附于 載體之上，且載體縫隙中也附著有大量細胞。圖3為病毒接種3天時微載體上的顯微照片； 接毒后隨著病毒的增殖細胞病變逐漸加重，先后出現(xiàn)變圓、破碎并從載體上脫落的現(xiàn)象，接 種后第3天細胞大量脫落，破碎附著在微載體上。生物反應器與裝有生長液的37°C恒溫攪拌系統(tǒng)1(容量500L)連接，培養(yǎng)條件為吸 附程序培養(yǎng)液的液面上升速度5mm/s，下降速度3mm/s，液面在反應器上下端點停滯時間 為60s/10s。培養(yǎng)溫度37. 0°C，pH值調(diào)節(jié)7. 3，溶氧調(diào)節(jié)65%，二氧化碳濃度調(diào)節(jié)10%。自運行吸附程序計時，3h后啟動培養(yǎng)程序培養(yǎng)液的液面升降速度均為4mm/s，液 面在反應器上下端點停滯時間為50s/50s。灌注培養(yǎng)5天，培養(yǎng)濕度37. 0°C;采用7.5% (W/ V)NaHCO3自動調(diào)節(jié)pH值，使值控制在7. 2左右，溶氧為50%，二氧化碳濃度為5%。細胞接 種后按每24h的時間點取載體樣和培養(yǎng)基樣，控制培養(yǎng)液中葡萄糖濃度1000 4500mg/L。2)病毒的接種與培養(yǎng)在20L潮汐式懸浮培養(yǎng)生物反應器中，細胞培養(yǎng)至第5天，Marc-145細胞在生物 反應器內(nèi)的密度達2. OX 101(lcellS/L，把培養(yǎng)基恒溫備料槽體2中的培養(yǎng)液換成維持液含 有1 %牛血清的標準MEM培養(yǎng)基)，按Μ. 0. I.為0. 001接種藍耳病病毒。運行接毒程序培 養(yǎng)液的液面上升速度4mm/s，下降速度2mm/s，液面在反應器頂部停留55s，底部停留10s，病 毒吸附3h。之后，運行病毒培養(yǎng)程序維持液的液面上升與下降速度均為4mm/s，液面在反 應器頂部停留50s，底部停留50s。培養(yǎng)溫度37. 5°C;采用7. 5% (W/V)NaHCO3自動調(diào)節(jié)pH， 使PH值維持在7. 2 ；溶氧為30%，二氧化碳濃度為3%。病毒吸附程序結(jié)束后，繼續(xù)運行細 胞培養(yǎng)程序，此時參數(shù)根據(jù)二氧化碳濃度利用7.5% (ff/V) NaHCO3自動調(diào)節(jié)pH值7. 3，溶氧 為45%，二氧化碳濃度為3%。3)病毒的收獲培養(yǎng)至接毒后第3天即收獲病毒液，先對載體瓶運行病毒液排除 程序，使之全部流入恒溫攪拌系統(tǒng)1中，對恒溫攪拌系統(tǒng)中的病毒液，采用50L的自動收集 桶按照5L/min的流速進行收集，-20°C保存。收獲病毒液500L，病毒滴度保持在IO9 5TCID5tl/ ml以上。Marc-145細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器時，細胞培養(yǎng)和病毒增殖情況 基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。4)制苗毒液的檢驗按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)檢驗 規(guī)程進行。5)配苗、分裝及凍干將檢驗合格的病毒液加入保護劑，充分混勻，定量分裝；分 裝后迅速進行冷凍真空干燥后即得成品。
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6)成品檢驗按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)檢驗規(guī)程進 行。實施例2潮汐式微載體懸浮生物反應器大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒及滅活疫苗藍耳病病毒液的制備方法同實施例1，毒株選用豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl 株。將制備的病毒液按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(JXA1株)檢驗規(guī)程進 行。經(jīng)檢驗合格的病毒液按0. 1% V/V比例加入甲醛，混勻，置于4°C滅活48h后，取滅活病 毒液94份(體積份)，加入6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份 (體積份)，加入6份(體積份)司本-80混合，隨加隨攪拌至透明為止，加熱到121°C、壓力 103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混合，混合之比為1 2—起以IOOOrpm乳化 8min，制備滅活油佐劑疫苗。按照實施例2高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(JXA1 株)檢驗規(guī)程進行檢驗，符合要求。實施例3懸浮培養(yǎng)工藝與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術比較1)在IOL轉(zhuǎn)瓶中生產(chǎn)豬藍耳病接入細胞密度lX105Cells/ml細胞懸液2L，37°C 培養(yǎng)至第2天以Μ. 0. I.為0. 001接毒，病毒吸附Ih后，補加維持液至3L，37°C培養(yǎng)96h收 獲液，-20°C凍存。2)在IOL生物反應器中生產(chǎn)豬藍耳病病毒，方法步驟同實施例1。3)實驗結(jié)果Marc-145細胞在IOL轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)2d后細胞數(shù)能增加3倍，達到 6 X IO8 (3 X 105cells/ml)；在IOL反應器中以65g/L微載體的密度培養(yǎng)時，培養(yǎng)6d后密度能 達到3. OX 101CI(3. OX 106cells/ml)，大規(guī)模潮汐式細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)與常用轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)系統(tǒng)相關生產(chǎn)性能指標進行對比結(jié)果如表1所示。表1不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖藍耳病病毒的相關比較
權利要求
一種豬藍耳病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟1)微載體生物反應器中，加入1.5×107～4.5×107cells/g微載體的傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結(jié)合后，啟動細胞培養(yǎng)程序，培養(yǎng)傳代細胞；2)上述傳代細胞培養(yǎng)至6.0×109cells/L～2.6×1010cells/L時換用細胞維持液，按照感染復數(shù)為M.O.I.＝0.0001～1.5接種豬藍耳病病毒，啟動病毒吸附程序，使病毒與微載體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養(yǎng)程序，擴增豬藍耳病病毒；3)在生物反應器中收獲豬藍耳病病毒液。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反應器為微載體懸浮培養(yǎng)生物 反應器。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物反應器為潮汐式微載體懸浮培 養(yǎng)生物反應器。
4.根據(jù)權利要求3所述的豬藍耳病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述潮汐式 微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器的程序為載體上下運行頻率為0 lOmm/s，培養(yǎng)液面在載體瓶 中上下端點停留時間為O 2min。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體為片狀、球形或網(wǎng)狀。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體添加量為40 75g/L。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述豬藍耳病病毒是豬藍耳病病毒強毒 株、豬藍耳病病毒弱毒株或其他豬藍耳病病毒分離株。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述制苗用細胞為CL2621細胞、MA104細 胞、Marc-145細胞或其他傳代細胞株。
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述細胞生長液，配方為MEM 培養(yǎng)基加3% 5%的牛血清，培養(yǎng)條件為溫度36. 5°C 37. 5°C, pH值調(diào)節(jié)7. O 8. 0，溶 氧調(diào)節(jié)10 % 80 %，二氧化碳濃度為O % 10 %。。
11.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述細胞維持液使用MEM培 養(yǎng)基加0. 5% 1. 5%的牛血清配制而成，其培養(yǎng)條件為控制在36. 5°C 37. 5°C，pH調(diào)節(jié) 7. 2 7. 5，溶氧調(diào)節(jié)25 % 80 %，二氧化碳濃度為1 % 5 %。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)豬藍耳病病毒液的體積為 2. 5L 1000L。
13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中生物反應器收獲方式為分批培養(yǎng)收獲。
14.由權利要求1 13任意一項制備的豬藍耳病病毒。
15.一種豬藍耳病滅活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟由權利要 求1 13任意一項方法制備豬藍耳病病毒，收獲的病毒液加入滅活劑，滅活后加入佐劑、乳 化劑，制得豬藍耳病滅活疫苗。
16.由權利要求15所述的方法制備的豬藍耳病病毒滅活疫苗。
17.—種豬藍耳病活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟由權利要求 1 13任意一項方法制備豬藍耳病病毒，收獲的病毒液加入凍干保護劑進行凍干，制得豬藍耳病活疫苗。
18.由權利要求17所述的方法制備的豬藍耳病活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒的方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬藍耳病病毒，將制備病毒用宿主細胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細胞足夠的養(yǎng)分和適宜的氣體環(huán)境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的10～20倍；換用細胞維持培養(yǎng)液，將藍耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)2～3日后，收獲病毒液；經(jīng)檢驗合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化制備藍耳病滅活疫苗或加入凍干保護劑進行凍干制備藍耳病活疫苗。該方法生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對較低。
文檔編號C12N7/00GK101979514SQ20101029495
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權日2010年3月30日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司