專利名稱：口蹄疫全病毒基因工程疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及醫療衛生技術領域，具體地說是應用T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統創制的口蹄疫基因工程疫苗及其制備方法。
背景技術：
口蹄疫是危害偶蹄獸及人類的重大傳染病，國際獸醫局及我國農業部列為A類烈性傳染病，我國《動物防疫法》規定為第一類危害嚴重的傳染病，疫苗免疫是防治口蹄疫的根本技術措施。目前，口蹄疫預防疫苗弱毒苗一般已停止生產(因恐弱毒株突變返回強毒株散布疫情)，各地用滅活全病毒疫苗，但因口蹄疫不同血清型病毒株變異性甚大(口蹄疫病毒株有7種血清型，70～80種次亞型之多)，一種某地毒株滅活苗難以覆蓋預防不同疫區偶蹄動物不同亞型毒株感染。亞單位基因工程苗(如復旦大學研制)僅用O型毒株表面抗原表位的VP1(213個氨基酸)的局部小片段排列重組。目前世界科學家公認能預防口蹄疫強毒株攻擊的理想疫苗應由全病毒顆粒表面蛋白的VP1、VP2、VP3所有片段共同參與形成免疫性立體空間結構，基因工程苗也需考慮到全病毒空間結構的原貌，否則，亞單位基因工程苗即使能產生免疫檢測反應性，也難產生強毒攻擊的保護性，結果，形成世界性口蹄疫分子生物學研究的實際格局只有研究價值，難有實際應用價值。
T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統，是分子免疫學、微生物學、人和動物傳染病及蛋白質相互作用研究方面新的有力工具，已發表于1996年國際知名學術雜志Protein Science上。在人和動物傳染病、免疫學領域，使用該系統可以創造出基因工程疫苗及快速診斷試劑盒。關于T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統有關技術本發明人已經申請了中國發明專利。

發明內容
本發明的目的是利用T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統，把O，A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3等七個血清型口蹄疫毒株免疫抗原蛋白保持其免疫所需空間結構、克隆表達在T4噬菌體顆粒表面，提供一種對偶蹄動物豬，牛、羊對各型口蹄疫強毒感染有保護作用的實用基因工程疫苗。
本發明的另一目的是提供上述口蹄疫血清型毒株基因工程疫苗的制備方法。
本發明人幾年來從口蹄疫功能蛋白轉到其基因結構及篩選，進行了大量的深入研究，實現了注射及口服口蹄疫全病毒基因工程疫苗技術的關鍵突破。
本發明的口蹄疫基因工程疫苗的結構表達式為全病毒基因工程疫苗phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；亞單位基因工程疫苗phageT4-Soc-Hoc-FMDV-F3。其中F3是口蹄疫病毒FMDV的主要抗原表位。
本發明的口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗的制備方法為(以O血清型口蹄疫疫苗為例，其他六種血清A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3型口蹄疫疫苗工序完全與此相同)1.取O血清型口蹄疫病毒毒株，使用進口Promega公司TRIZOIL試劑盒抽提其總基因組RNA。
2.從已發表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA測序信息，設計、合成以下兩個DNA核酸探針，使位于并覆蓋口蹄疫病毒粒子表面全部結構蛋白基因的起始，終止位點5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3.再用RT-PCR試劑盒，以抽得的口蹄疫基因組總RNA為底物，用以上探針為引物，進行RT-PCR鏈式DNA基因片斷擴增反應，獲得口蹄疫病毒粒子全部外殼結構蛋白完整P1基因；4.將基因P1與T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統的質粒pRH-Soc/Hoc進行基因重組，得到T4噬菌體整合質粒pRH-Soc/Hoc-P1(T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統由大腸菌整合表達質粒pSoc，pHoc系列及T4噬菌體展示載體phage T4-ΔSoc & ΔHoc組成)；5.將pRH-Soc/Hoc-P1與T4噬菌體展示系統的展示載體phage T4-ΔSoc& ΔHoc進行同源重組，轉化進入大腸桿菌E.coli.CR63宿主菌體中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表達展示在T4噬菌體表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；口蹄疫基因工程疫苗的生產運用制備方法是在LB培養液中大量擴增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌體phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1，在中速離心機上進行6000RPM-20000RPM的差速離心，去除宿主細胞碎片沉淀，分離純化T4噬菌體顆粒，就制備成了O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌體疫苗株。(待國家獸醫生物制品檢定所及農業部藥證部門質量、安全性等檢定、批準后成為正式生產應用疫苗)本發明的口蹄疫疫苗包括T4噬菌體構建的全病毒疫苗及T4噬菌體構建的口蹄疫亞單位疫苗。
免疫效果檢測實驗室檢測分別在免疫原蛋白的質粒表達層次及T4噬菌體表達層次用豬、牛、羊的口蹄疫抗體血清，分別用Western Blotting免疫雜交及Dot-ELISA免疫學方法檢驗T4噬菌體phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1表面展示的P1抗原條帶，呈強陽性反應。
動物試驗這種新型口蹄疫基因工程疫苗，分別在三達生物技術公司及保山疫苗廠進行了多批次分組實驗動物小白鼠口蹄疫強病毒攻擊保護試驗，結果在100多頭實驗動物中顯示了100％免疫保護作用。(具體數據見附表)攻毒保護試驗結果見下表



注全病毒T4-FMDV-P1T4噬菌體口蹄疫O型血清型全病毒表達疫苗株亞單位T4-FMDV-F3T4噬菌體口蹄疫O型FMDV國際株O1K亞單位基因工程疫苗達株。F3是口蹄疫病毒FMDV的主要抗原表位。空白對照為同齡未免疫小白鼠組。T4噬菌體本底對照注射不表達口蹄疫抗原的T4噬菌體載體本身。
本發明使用T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統，在國內外首次克隆表達了口蹄疫全病毒外殼基因P1長度的模擬口蹄疫天然全病毒基因工程實驗疫苗，在O血清型口蹄疫病毒強毒攻擊保護效果試驗中，結果數據顯示對小動物有100％免疫保護作用。以國家的野外動物強毒攻毒保護效果超過60％即為考慮有效作參考，本發明的全病毒及亞單位兩類T4-基因工程苗，都具潛在的大動物免疫保護及實用疫苗開發價值。
本發明涉及生命科學和生物技術前沿性研究的重大專項，此項T4噬菌體表面展示口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗是T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統與口蹄疫病毒相結合的產物。
本發明在中國經多年努力，成功創制出一種嶄新的T4噬菌體表面展示口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗。與滅活全病毒疫苗相比，因在基因水平去除了口蹄疫病毒感染宿主細胞必須的結構位點，不需滅活，保持全病毒抗原性但不具傳染性。該項目全病毒抗原基因工程疫苗開發的成功，將告別費力、費時、麻煩、盲目的亞單位基因工程苗研制階段。這種新型基因工程疫苗既可注射，也可口服。既無現在廣泛使用的病毒滅活疫苗的萬一滅活不徹底、導致疫情擴散的潛在危險性，而且比滅活苗的造價低得多，成本只有目前普遍使用的滅活苗的1/5至1/10，免疫效果不比目前使用的滅活苗差。
本發明可針對亞洲、歐洲及非洲曾流行世界許多地區的口蹄疫血清型O型、A型、Asia-I型、C型、SAT-1、SAT-2、SAT-3共七種亞型口蹄疫主要病毒株構建基因工程疫苗，把創產值數億元的現行滅活全病毒苗推到另一個更適用、價廉的產品平臺。對偶蹄動物豬，牛、羊有強毒感染保護作用，且成本價格低廉。發展傾向將逐步替代現廣泛使用的口蹄疫滅活全病毒疫苗，市場將覆蓋中國，亞洲，歐洲，非洲及世界其他國家。
具體實施例方式
實施例1主要流行于亞洲的O血清型口蹄疫基因工程疫苗，由以下制備方法獲得1.取O血清型口蹄疫病毒毒株，使用進口Promega公司TRIZOIL試劑盒抽提其總基因組RNA。
2.從已發表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA測序信息，設計、合成以下兩個DNA核酸探針，使位于并覆蓋口蹄疫病毒粒子表面全部結構蛋白基因的起始，終止位點5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3.再用RT-PCR試劑盒，以抽得的口蹄疫基因組總RNA為底物，用以上探針為引物，進行RT-PCR鏈式DNA基因片斷擴增反應，獲得口蹄疫病毒粒子全部外殼結構蛋白完整P1基因。
4.將基因P1與T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統的質粒pRH-Soc/Hoc進行基因重組，得到T4噬菌體整合質粒pRH-Soc/Hoc-P1；5.將pRH-Soc/Hoc-P1與T4噬菌體展示系統的展示載體phage T4-ΔSoc&ΔHoc進行同源重組，轉化進入大腸桿菌E.coli.CR63宿主菌體中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表達展示在T4噬菌體表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；6.口蹄疫基因工程疫苗的在生產運用中在LB培養液中大量擴增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌體phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1，在中速離心機上進行6000RPM-20000RPM的差速離心，去除宿主細胞碎片沉淀，分離純化T4噬菌體顆粒，就制備成了O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌體疫苗株。(待國家獸醫生物制品檢定所及農業部藥證部門質量、安全性等檢定、批準后成為正式生產應用疫苗)實施例2T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統表達口蹄疫基因工程疫苗株小動物試驗該口蹄疫基因工程苗，在我們使用實驗室免疫反應檢測陽性的基礎上(PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，Western Blotting免疫雜交，用豬及羊口蹄疫血清抗體，進行了免疫原生物活性檢測，均取得陽性結果)，然后，先后在三達生物技術公司及保山口蹄疫疫苗廠進行了豬源、牛源口蹄疫強毒在實驗小動物的攻擊保護效果試驗。試驗使用了我們上述的T4噬菌體口蹄疫基因工程疫苗的以下二個樣品
1)T4噬菌體口蹄疫O型血清型全病毒表達疫苗株T4-FMDV-P1；2)T4噬菌體口蹄疫O型FMDV國際株O1K亞單位基因工程疫苗亞單位表達株T4-FMDV-F3試驗動物小白鼠考核指標用T4噬菌體口蹄疫基因工程疫苗株口服及注射實驗動物后，1)用豬及牛源口蹄疫強病毒對實驗動物的攻擊保護性％測定，2)進行動物內臟剖檢，觀察病變。3)從內臟、血液、糞尿取樣，測定疫苗株T4噬菌體活顆粒分布及含量。
試驗方法1.先進行牛源口蹄疫強毒的小白鼠適應性傳代，傳了6代后用于本試驗；2.豬、牛源口蹄疫強毒對小白鼠半數致死量SM50LD測定；3.對免疫成年小白鼠用口蹄疫強毒進行接種攻毒，取2-3月齡小白鼠(公鼠)，每組5只，以T4噬菌體疫苗株免疫動物(華南農大免疫二次，保山疫苗廠免疫五次)，每次間隔時間半月，設傳統滅活疫苗陽性對照組及陰性空白對照組，末次免疫后10天，用血清型O型口蹄疫病毒豬/牛強毒株接種每只受試動物及對照動物，給予強毒攻毒。
4.接種乳鼠進行毒血癥檢測，攻毒后36小時取每受試動物外周血，稀釋20倍后，每頭成年鼠的外周血再注射接種5只乳鼠，從死亡或存活以判定是否產生毒血癥viremia，及判定噬菌體疫苗株是否產生了免疫保護作用.
結果1.攻毒保護試驗結果見前已給出表。
2.內臟剖檢，觀察受試動物未見臟器明顯病理改變。
3.疫苗株T4噬菌體活顆粒分布及含量從糞、尿、腎、脾、血中都檢出展示口蹄疫病毒基因的T4噬菌體疫苗活顆粒，數量由多到少按糞、尿、腎、脾、血，順序排。
其它實施例如O血清型以外所有其他口蹄疫A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3共六個血清型口蹄疫毒株的全病毒及亞單位基因工程疫苗的制備均與
權利要求
1.一種口蹄疫基因工程疫苗，其特征在于其結構表達式為全病毒基因工程疫苗phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；亞單位基因工程疫苗phageT4-Soc-Hoc-FMDV-F3。
2.如權利要求1所述的口蹄疫基因工程疫苗的制備方法，其特征在于由以下的方法獲得1)取O血清型口蹄疫病毒毒株，用RNA抽提試劑盒抽提其總基因組RNA；2)從O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA測序信息設計、合成以下兩個DNA核酸探針，使位于并覆蓋口蹄疫病毒粒子表面全部結構蛋白基因的起、始位點為5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3)再用RT-PCR試劑盒，以抽得的口蹄疫基因組總RNA為底物，用以上探針為引物，進行RT-PCR鏈式DNA基因片斷擴增反應，獲得口蹄疫病毒粒子全部外殼結構蛋白完整的P1基因；4)將P1基因與T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統的質粒pRH-Soc進行基因重組，得到T4噬菌體整合質粒pRH-Soc-P1；5)將pRH-Soc-P1與T4噬菌體展示系統的展示載體phage T4-ΔSoc & ΔHoc進行同源重組，轉化進入大腸桿菌E.coli.CR63宿主菌體中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表達展示在T4噬菌體表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-FMDV-P1；
3.根據權利要求2所述的口蹄疫基因工程疫苗的制備方法，其特征在于口蹄疫基因工程疫苗的生產運用制備方法是在LB培養液中大量擴增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌體phage T4-Soc-FMDV-P1，在中速離心機上進行6000RPM-20000RPM的差速離心，去除宿主細胞碎片沉淀，分離純化T4噬菌體顆粒，制備成O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌體疫苗株產品。
4.根據權利要求2所述的口蹄疫基因工程疫苗的制備方法，其特征在于口蹄疫基因工程疫苗的制備方法包括T4噬菌體外源蛋白高效表達展示系統創制的O血清型以外所有其他口蹄疫A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3共六個血清型口蹄疫毒株的全病毒及亞單位基因工程疫苗。
全文摘要
本發明是一種口蹄疫基因工程疫苗及其制備方法。其結構表達式為全病毒基因工程疫苗phage T4－Soc－Hoc－FMDV－P1；亞單位基因工程疫苗phageT4－Soc－Hoc－FMDV－F3。制備方法是取O血清型口蹄疫病毒毒株，抽提總基因組RNA；從血清毒株的DNA測序合成兩個DNA核酸探針；用探針為引物，進行RT－PCR鏈式DNA擴增反應，獲得病毒粒子P1基因；將P1基因與T4噬菌體質粒pRH－Soc進行基因重組，得到T4噬菌體整合質粒pRH－Soc－P1；將pRH－Soc－P1與T4噬菌體載體phage T4－ΔSoc&ΔHoc進行同源重組，進入大腸桿菌E.coli.CR63宿主菌體中，就得到本發明的基因工程疫苗株phageT4－Soc－FMDV－P1。本發明與滅活全病毒疫苗相比，不需滅活，保持全病毒抗原性但不具傳染性。既可注射，也可口服，方便、快捷，免疫效果良好。
文檔編號A61K48/00GK1602962SQ200410040389
公開日2005年4月6日 申請日期2004年8月4日 優先權日2004年8月4日
發明者任兆鈞 申請人:任兆鈞, 大理三達生物科技有限公司