專利名稱：一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒制備方法，特別涉及一 種使用免疫印跡試驗檢測駑巴貝斯蟲病(Babesia caballi)血清抗體的方法及其診斷試劑 盒的制備方法，屬于馬屬動物血液原蟲病檢測領域。
背景技術：
駑巴貝斯蟲病(Babesia caballi)是由駑巴貝斯蟲寄生于馬屬動物的紅細胞內所 引起的血液原蟲病，臨床表現為高熱、貧血、黃疸、水腫等癥狀。最急性病例比較少見，到發 現時病馬已死亡或瀕死。該病在世界分布廣泛，在歐洲，法國、意大利及俄羅斯南部和東部 大部分地區，直至北緯58度地區，都有駑巴貝斯蟲病流行的報道。法國南部駑巴貝斯蟲病 血清學調查流行率為11. 3%，在南美洲、拉丁美洲、非洲、亞洲都有駑巴貝斯蟲病的報道。巴 西駑巴貝斯蟲流行高達59. 4%至65.5% ，特立尼達島也有駑巴貝斯蟲病流行的報道。尼 加拉瓜駑巴貝斯蟲陽性率為41%，南非駑巴貝斯蟲病血清學調查陽性率高達61. 9%，蒙古駑 巴貝斯蟲病分布廣泛，血清學調查陽性動物達40. 1%。我國駑巴貝斯蟲病主要流行于東北、 內蒙古東部及青海等地，在我國有14個省區都曾有該病散發或地方性流行的報道。甘肅、 黑龍江、吉林、新疆也是駑巴貝斯蟲病流行地區。馬匹耐過駑巴貝斯蟲病后，帶蟲免疫可持續達4年。疫區的馬匹由于經常遭受蜱 的叮咬，反復感染，因此一般不發病或只表現輕微癥狀而耐過，但由外地進入疫區的新馬及 新生的幼駒由于沒有這種免疫性，容易發病。在沒有疫情但有蜱類活動的地區，對外來馬匹 要嚴格進行駑巴貝斯蟲病的檢疫，防止帶蟲馬進入。由于該病在世界范圍內分布廣泛，為嚴重傳播性疾病，難以根除，因此各國均把該 病列為重要監測的馬病之一，因此病對國際貿易產生重要影響，世界動物衛生組織(OIE)將 該病列為對國際貿易產生重要影響的疾病，我國農業部將其列為二類動物傳染病。在國際 貿易中，大多數國家簽署的雙邊檢疫協定中，將該病列為法檢項目。由于該病感染動物后，常不表現為明顯的臨床癥狀，因此很難從癥狀上診斷。此類 疾病主要是通過實驗室檢驗方法進行確診。病原鑒定主要通過血液涂片和PCR，實驗室檢 驗方法常采用血清學檢測方法，主要有間接熒光抗體試驗、補體結合試驗、酶聯免疫吸附試 驗(世界動物衛生組織(OIE).陸生動物診斷和疫苗手冊[M]，2008 1-2.)。血液涂片法只 有動物處于急性感染期才是可行的診斷方法，PCR目前雖已建立但仍需發展和完善，且PCR 因受制于病原核酸的提取，其試驗的敏感性和特異性還有待提高。間接熒光抗體試驗敏感 性不強，且容易受操作者主觀因素影響結果判斷。補體結合試驗現為許多國家推薦的檢驗 方法，但此法會受到抗補體因素的影響而不能判斷樣品的實驗結果，酶聯免疫吸附試驗雖 然操作簡便，敏感性較強，但易發生交叉反應，出現假陽性結果。探討研究新的檢測方法是 科學技術發展的必由之路，也是疾病檢測技術發展的要求。免疫印跡法是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方 法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋 白分析的一種常規技術，但多用于鑒定某種蛋白，將其用于疫病檢測方面的研究并不多。國內用免疫印跡法檢測動物疫病的研究很少，沒有關于駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢 測方法的研究報道。

發明內容
本發明人進行了大量的實驗工作，終于建立了一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試 劑盒的制備方法。本發明采集健康小型馬紅細胞體外培養駑巴貝斯蟲，經過擴大培養，將獲 得的培養物制成免疫印跡診斷抗原，并經實驗室感染馬匹獲得駑巴貝斯蟲抗體陽性對照血 清。同時，在獲得診斷抗原和陽性對照血清的基礎上建立了駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方 法。本發明目的是提供一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒及其制備方法，本發明 目的通過以下技術方案實現
(1)制備蟲體培養用紅細胞
無菌采集健康馬血，離心處理后用VYM’ S緩沖液洗滌、懸浮得到； 離心條件:4°C _8°C，低速，30士5 min ；
(2)建立及擴大駑巴貝斯蟲體外培養
無菌采集感染駑巴貝斯蟲病馬的抗凝血，經離心處理，用3x VYM’ s緩沖液洗滌、懸浮 獲得染蟲紅細胞后，采用HL-I組織培養液培養，當染蟲率達到1. 5%- 時即進行分代培養； 之后每當染蟲率達到m或以上時即擴大培養；
培養環境為93%N2，2. 0%02, 5%C02 ；一個培養周期為24小時；
(3)制備駑巴貝斯蟲病免疫印跡雜交診斷抗原
當步驟(2)培養物的染蟲率超過3%時，收集培養物，經離心、洗滌，最后以PI buffer+l%NP40 溶解至清亮，再力口入 LDSsample buffer (4x) 、ample Reducing Agent (10x)，充分混勻。煮沸，迅速冷卻，得駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷抗原。(4)制備陽性對照血清通
將25mL用等量10%常規異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的駑巴貝斯蟲紅細胞培養物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝 在一個布袋中，放置在小型馬上。13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養6天，第6天將蜱 放到實驗用小型馬匹上8天，兩個星期后采集血清，補體結合試驗可檢測到駑巴貝斯蟲抗 體，即獲得陽性對照血清。取(1)駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷抗原、(2)辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊 抗馬結合物、(3)陽性對照血清、陰性對照血清、(4)底物(peroxide solution+Luminol enhancer solution)、(5)蛋白分子量標準標記物(Marker)、(6)4 -12 % Bis-Tris 膠、(7) 硝酸纖維膜、(8)M0PS SDS Running Buffer (20x)、(9)NuPAGE Antioxidant、(10)轉印緩 沖液、(11)磷酸鹽緩沖液(pH7. 3)、(12)封閉液、(13)洗液、(14)感光膠片、(15)使用說明 書置紙質盒中，得到駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測試劑盒。本技術方案的優點和特點是
抗原制備用蟲體的染蟲率只需超過3 %即可用于免疫印跡診斷用抗原，且抗原制備周期更短，大大縮短了生產試劑盒的周期。本發明的另一個目的是提供一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法，本方法是以辣 根過氧化物酶標記的羊抗馬二抗結合物、化學發光底物在獲得診斷抗原和陽性對照血清的
基礎上建立的。本發明目的通過以下技術方案實現
(1)取4-12 % Bis-1Tris膠板，洗滌干凈；
(2)以SDSRunning Buffer和NuPAGE Antioxidant為溶劑，采用電泳法分離抗原蛋 白得到含有抗原蛋白的膠板；
(3)用冷藏的轉印緩沖液將抗原蛋白轉移至纖維膜；
(4)血清與抗原孵育
將轉印有抗原蛋白的膜置于封閉液中在搖床上孵育；之后將膜取出再置于以封閉液按 1:100 1:500稀釋的血清樣品中，振蕩感作；
(5)酶結合物孵育
將膜轉置于以封閉液按1:5000 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗馬二抗 結合物，振蕩感作；
(6)底物孵育將膜移置于底物中，避光感作；得含底物孵育物的膜；
(7)曝光，顯影:
吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，置暗夾中，紅燈下，取感光膠片放在膜上，扣上暗 夾，曝光；在紅燈下取出膠片，放入顯影機中顯影；得顯影感光膠片；
(8)結果判斷:
當陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現一個條帶，位置約在33kDa處時，陽性對照 成立；當陰性血清對照無條帶出現時，陰性對照成立；這時可進行檢測樣品的判定當在 25kDa和37kDa間出現一個條帶，條帶位置與陽性對照相同時，判定為陽性樣品；當在25kDa 和37kDa間無條帶出現時，判定為陰性樣品。所述底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution。為了獲得更好的效果，抗原蛋白的工作濃度優選1:1000。本技術方案的優點和特點是 1、試劑用量少、成本低
本發明所用的二抗工作濃度為1:5000 1:10000，二抗的用量少，節省了試劑的消耗， 節約了成本。2、操作更快捷
本發明方法靈敏、快速，且無毒無害、特異性高。3、試驗所需的條件低、試驗結果易判定和長期保存.
本發明方法所需時間更短，整個試驗在4 h內完成。整個試驗在常溫下即可完成。且 是將反應條帶曝光于膠片上，結果易判定且可長期保存，不存在褪色的問題。4、本發明方法不僅能夠對駑巴貝斯蟲病血清抗體進行檢測，更能夠對其他血清學 方法如IFA、CFT、ELISA檢測為陽性的結果進行確證，特異性比ELISA更強。5、用本發明檢測方法檢測馬群血清，檢測結果均未發現假陽性和假陰性的結果。


圖駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法的陰性和陽性對照 M:蛋白質分子量標準；1. 1:駑巴貝斯蟲陽性對照血清； 1.2:駑巴貝斯蟲病陽性對照血清；2.1:駑巴貝斯蟲病陰性對照血清； 2.2:駑巴貝斯蟲病陰性對照血清。
具體實施例方式為了理解本發明，下面以實施例進一步說明本發明，但并不限制本發明,實施例1 制備駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒
配制試劑Ulx VYM' s緩沖液CaCl2. 2H200.016 gKCl0.400 gKH2PO41.415 gMgSO4. 7H200. 154 gNa2HPO40.077 gNaCl7.077 gGlucose20.500 g(MH2O1 L攪拌溶解后，加入Adenine
0.0423 g、Guanosine 0. 0708 g，調 pH 值至 7. 0-7. 2，真 空抽濾(0.22 Mm)，4°C保存備用。
2、HL-I組織培養液
HL-I培養基400 mL
馬血清100 mL
Hepes0.238 g
2 mmol L-glutamine500M-L
Antibiotic-antimycotic(IOOx) 1 mL 磁力攪拌5 !^11，調？!1至7.2，真空抽濾(0.22 Mm)，4°C保存備用 3、 PI buffer Tris3. 03 g
去離子水 500mL 磁力攪拌器攪拌lh，調pH 8. 0，加
EDTA (SIGMA)0. 93g
IODAOACETAMIDE(C2H4INO) (SIGMA) 0. 46g 磁力攪拌過夜，力口
TLCK (C14H22C12N2O3S)18.45 mg
制備診斷用抗原 (1)制備蟲體培養用紅細胞
無菌采集600 mL健康馬血至已滅菌的裝有玻璃珠的真空三角瓶中，旋轉三角瓶直至出現白色凝塊。在超凈臺內，將馬血倒入離心管中，4°C 800 xg離心30 min，吸棄血漿層和白 細胞層。用VYM’s緩沖液洗三次，每次盡可能將血漿層和白細胞層吸棄。之后加入2倍體 積的VYM’ s緩沖液，用移液器輕輕懸浮紅細胞泥，4°C 800 xg離心30 min。吸棄血漿層和 白細胞層后再加入2倍體積的VYM’ s緩沖液至紅細胞泥中，用移液器輕輕懸浮，得蟲體培養 用紅細胞，置聚丙烯管中，4 °C保存，備用。(2)建立駑巴貝斯蟲體外培養
采集感染駑巴貝斯蟲病馬的抗凝血，4°C 800 xg離心30 min，用移液器吸棄血漿層和 白細胞層。用3x VYM’ s緩沖液洗三次，每次盡可能吸棄上清液和白細胞層，之后4°C 800 xg離心30 min，得染蟲紅細胞。將1 mLHL-1組織培養液加入至M孔細胞組織培養板內，吸取50μ 染蟲紅細胞至 細胞孔內，再吸取所得蟲體培養用紅細胞150 μ 。將細胞組織培養板置37 °C培養箱中培 養，培養環境為93%隊，2. 0%02, 5%C02。每天換1次培養液，方法是不攪動細胞層吸棄約ImL培養液，再加入ImL新的 HL-I培養液。將板重新置前述培養箱中繼續培養。當染蟲率達到1.5%- 時，進行分代培養。方法是將板取出，吸棄ImL培養液， 再加入ImL新的HL-I培養液，用移液器輕輕懸浮培養物，得第一代培養物。在新的細胞孔 內加入600 μ HL-I培養液，并取600 μ 第一代培養物至新的細胞孔內，輕輕混勻。另取 600 μ HL-I培養液加入至舊的細胞孔內。在新、舊細胞孔內各加入100 μ 蟲體培養用紅 細胞。將板置前述培養箱繼續培養至染蟲率超過洲。(3)駑巴貝斯蟲體外擴大培養
首先將蟲體培養擴大至4個細胞孔。方法是在組織細胞培養板中，向新的細胞孔中加 入600 μ HL-I組織培養液，取100 μ 蟲體培養用紅細胞至新的細胞孔中；從舊的細胞孔 中吸棄約1.2 mL舊培養液，加入約1.2 mL新的培養液至舊的細胞孔內并吸取600 μ 培養 物至新的細胞孔內。置前述培養箱中培養M小時。制備血涂片，進行染蟲率檢測。當染蟲率超過洲時向三角瓶中擴大培養，方法是取滅菌的三角瓶Α，向其中加入 10 mL HL-I組織培養液、1 mL蟲體培養用紅細胞及3個細胞孔的培養物后，置前述培養箱 中培養M小時；之后，將三角瓶A取出，從中吸棄7 mL-10 mL舊培養液，用新的HL-I組織 培養液補足吸棄的量，繼續置前述培養箱中培養M小時。當染蟲率超過21時，再次擴大培養，方法是另取2個三角瓶，向其中各加入6 mL 新的培養液及1 mL蟲體培養用紅細胞；吸棄三角瓶A中的培養液并加入等量的新培養液， 輕輕混勻后，分別吸取7 mL至2個新的三角瓶中，將它們置前述培養箱中培養M小時。按 照此法，當染蟲率超過m時即擴大培養，從2個三角瓶至4個再至8個三角瓶。當8個三角瓶中的染蟲率超過3%時，染蟲紅細胞擴大培養完成。收集其中7個三角瓶中的培養物至2個50 mL離心管中，1500 rpm 4°C離心30 min ；吸棄上清液，獲得感染有駑巴貝斯蟲的紅細胞。再置1.5mL離心管中，3000 rpm 4 V 離心2 min;吸棄上清液，取750 PL細胞泥至新的離心管中，加入750 PL雙蒸水，渦旋振蕩 輕輕混勻，臺式離心機14000 rpm離心3 min。吸棄上清液，加入1. 0 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)，用移液器吹吸輕輕混勻，再14000 rpm離心3 min ；吸棄上清液，加入1. 0 mL雙蒸水， 仍用移液器吹吸輕輕混勻，再以14000 rpm離心5 min ；吸棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液，混勻，14000 rpm離心10 min，重復1次。吸棄上清液，加入200 μ PI buffer+l%NP40，重
新溶解至清亮。取溶解物200 μ 至1支新的離心管中，加入50 μ LDS sample buffer(4x)、25 PLsample Reducing Agent (10x)，充分混勻。煮沸10分鐘，迅速放入冰盒中冷卻，即得診 斷用抗原，-20°C保存，備用。制備診斷用陽性對照血清
經帶蟲蜱Boophilus microplus實驗室感染小型馬獲得陽性對照血清 將25mL用等量10%常規異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的駑巴貝斯蟲紅細胞培養物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝 在一個布袋中，放置在小型馬上。13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養6天，第6天將蜱 放到實驗用小型馬匹上8天，兩個星期后采集血清，補體結合試驗檢測到駑巴貝斯蟲抗體 時，即獲得駑巴貝斯蟲病免疫印跡雜交診斷陽性對照血清；-20°C保存，備用。取(1)封裝診斷用抗原、(2)辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗馬結合物；(3) 封裝陽性對照血清、陰性對照血清、(4)底物(peroxide solution+Luminol enhancer solution)、(5)蛋白分子量標準標記物(Marker)、(6) 4 -12 % Bis-Tris膠、(7)硝酸纖維 膜、(8) MOPS SDS Running Buffer (20x)、(9) NuPAGE Antioxidant、(10)轉印緩沖液、 (11)磷酸鹽緩沖液(pH7. 3)、(12)封閉液、(13)洗液、(14)感光膠片、(15)使用說明書置 紙質盒中，冷藏保存。實施例2 駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測 試劑配制
UlOx電泳緩沖液 Tris121. 1 g
570g 4L
甘氨酸 蒸餾水
2、轉印緩沖液
IOx電泳緩沖液 100 mL 甲醇200 mL
蒸餾水700 mL
3、封閉液含0.2% Tween-20U0 %脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液
4、洗液含0.2 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液
取 NuPAGE 4% 12% Bis-Tris 膠板，用 1 χ SDS Running Buffer 洗膠孔三次；將膠 板正面朝前放在Mini-Cell垂直電泳儀核心架內，鎖緊。在電泳槽內加入200 mL 1 χ SDS Running Buffer 和 500 μ NuPAGE Antioxidant，混合均勻。下槽內加入 600 mL 1 χ SDS Running Buffer。向膠孔內加入7μ 10μ 蛋白分子量標準標記物(Marker)和實施例1 所得抗原樣品，抗原蛋白的工作濃度為1:1000，200V 350mA跑膠1小時，得到含有抗原蛋 白的膠板。 之后將抗原蛋白轉移至硝酸纖維膜
先將膠、硝酸纖維膜、轉印夾、濾紙、纖維墊用轉印緩沖液浸泡，然后在轉印夾的黑面 上，依次放上纖維墊、濾紙、膠塊、纖維膜、濾紙、纖維墊，壓走氣泡，扣緊轉印夾。將轉印夾裝在轉印槽內，向槽內倒入先前置于冰箱中冷藏的轉印緩沖液，將槽放于磁力攪拌器上，150 V 350 mA轉印1小時。將轉印有抗原蛋白的膜在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.3)中沖洗，然后放在含有封閉 液的容器中，置搖床上孵育1小時。將膜取出剪成若干條，正面朝下，放在裝有用封閉液按 1 500稀釋好的血清樣品的容器中，在振蕩器上振蕩感作30分鐘。結束后用洗液洗3次，每 次5分鐘。倒掉洗液，然后加入用封閉液按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗馬二 抗結合物中，振蕩感作30分鐘。用洗液洗3次，每次5分鐘。倒掉洗液，力口入peroxide solution+Luminol enhancer solution底物，避光感作 5分鐘。用吸水紙吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，將膜正面朝上擺好放在暗夾中置暗 室中，紅燈下，取1張感光膠片，放在膜上，扣上暗夾，曝光30s-60秒。在紅燈下取出膠片，放入顯影機中顯影。得顯影感光膠片。應用例 結果判定方法
取實施例2所得顯影感光膠片，顯示陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現一個條帶， 位置約在33kDa處，與陽性對照相同，判定為陽性樣品。
10
權利要求
1.一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒，其特征在于包括(1)駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷抗原(2)辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗馬結合物(3)陽性對照血清、陰性對照血清(4)底物(5)蛋白分子量標準標記物(6)4 -12 % Bis-Tris膠(7)硝酸纖維膜(8)MOPS SDS Running Buffer(9)NuPAGE Antioxidant(10)轉印緩沖液(11)磷酸鹽緩沖液(12)封閉液(13)洗液(14)感光膠片(15)使用說明書所述底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution) 根據權利要求1所述一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒，其特征在于試劑盒中的 駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷抗原通過下述方法制備(1)制備蟲體培養用紅細胞無菌采集健康馬血，離心處理后用VYM’ S緩沖液洗滌、懸浮得到； 離心條件:4°C _8°C，低速，30士5 min ；(2)建立及擴大駑巴貝斯蟲體外培養無菌采集感染駑巴貝斯蟲病馬的抗凝血，經離心處理，用3x VYM’ s緩沖液洗滌、懸浮 獲得染蟲紅細胞后，采用HL-I組織培養液培養，當染蟲率達到1. 5%- 時即進行分代培養； 之后每當染蟲率達到m或以上時即擴大培養；培養環境為93%N2，2. 0%02, 5%C02 ；一個培養周期為24小時；(3)制備駑巴貝斯蟲病免疫印跡雜交診斷抗原當步驟(2)培養物的染蟲率超過3%時，收集培養物，經離心、洗滌，最后以PI buffer+l%NP40 溶解至清亮，再力口入 LDSsample buffer (4x) 、ample Reducing Agent (10x)，充分混勻；煮沸，迅速冷卻，即得駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷抗原。
2.根據權利要求1所述一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒，其特征在于底物是 peroxide solution+Luminol enhancer solution。
3.根據權利要求1所述一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒，其特征在于試劑盒中 的陽性對照血清通過下述方法制備將25mL用等量10%常規異源馬血清磷酸鹽緩沖液混合的駑巴貝斯蟲紅細胞培養物，靜 脈注射至脾未切除的小型馬體內，3天后用大約10000個蜱(約0. 5克)未飼喂的蜱幼蟲，裝 在一個布袋中，放置在小型馬上。
4.13天后拿走已變成飽滿的蛹的蜱，蜱養6天，第6天將蜱放到實驗用小型馬匹上8天，兩個星期后采集血清，補體結合試驗可檢測到駑巴貝斯蟲抗體，即獲得陽性對照血清。
5.一種駑巴貝斯蟲病血清抗體免疫印跡檢測方法，是建立在權利要求1基礎之上的血 清抗體免疫印跡檢測方法，其特征在于包括步驟(1)取4 12% Bis-Tris膠板，洗滌干凈；(2)以SDSRunning Buffer和NuPAGE Antioxidant為溶劑，采用電泳法分離抗原蛋 白得到含有抗原蛋白的膠板；(3)用冷藏的轉印緩沖液將抗原蛋白轉移至纖維膜；(4)血清與抗原孵育將轉印有抗原蛋白的膜置于封閉液中在搖床上孵育；之后將膜取出再置于以封閉液按 1:100 1:500稀釋的血清樣品中，振蕩感作；(5)酶結合物孵育將膜轉置于以封閉液按1:5000 1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗馬二抗 結合物，振蕩感作；(6)底物孵育將膜移置于底物中，避光感作；得含底物孵育物的膜；(7)曝光，顯影:吸干膜上的水，用保鮮膜將膜包好，置暗夾中，紅燈下，取感光膠片放在膜上，扣上暗 夾，曝光；在紅燈下取出膠片，放入顯影機中顯影；得顯影感光膠片；(8)結果判斷:當陽性血清對照在25kDa和37kDa間出現一個條帶，位置約在33kDa處時，陽性對照 成立；當陰性血清對照無條帶出現時，陰性對照成立；這時可進行檢測樣品的判定當在 25kDa和37kDa間出現一個條帶，條帶位置與陽性對照相同時，判定為陽性樣品；當在25kDa 和37kDa間無條帶出現時，判定為陰性樣品。
6.根據權利要求5所述一種駑巴貝斯蟲病血清抗體免疫印跡檢測方法，其特征在于抗 原蛋白的工作濃度是1:1000。
全文摘要
本發明公開了一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒，本發明駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法，是以辣根過氧化物酶標記的羊抗馬二抗結合物、化學發光底物在獲得診斷抗原和陽性對照血清的基礎上建立的；本發明方法試劑用量少成本低、特異性高、靈敏度高操作更快捷且無毒無害，所需條件低、試驗結果易判定和長期保存，特異性比ELISA更強，用本發明檢測均未發現假陽性和假陰性的結果。
文檔編號G01N33/569GK102062776SQ20101059133
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者侯艷梅, 左鋒, 柴宏森, 王乃福, 王建華, 王玉玲, 趙林立, 趙祥平 申請人:中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局