專利名稱：一種牛巴貝斯蟲lamp檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，尤其涉及牛巴貝斯蟲LAMP檢測方法。
背景技術：
牛巴貝斯蟲是一類經蜱傳播，紅細胞內寄生的原蟲，屬于復頂亞門，由該類寄生蟲 引起的巴貝斯蟲病，在世界上許多地區發生和流行，我國各地也常有發生，給畜牧業和國民 經濟造成巨大損失。牛感染該蟲后，常出現貧血、發熱、血紅蛋白尿、共濟失調等癥狀，嚴重 時引起死亡。該病已經造成了巨大的經濟損失，并呈范圍擴大趨勢，因而引起國內外學者的 廣泛關注。目前，血液樣品的血涂片鏡檢技術仍是診斷牛巴貝斯蟲病最合適的方法，但是該 方法具有很大的一個缺點-低敏感性，因此不能應用于外周血內寄生蟲含量很低動物以及 感染耐過后的帶蟲動物的檢測。血清學檢查也是牛巴貝斯蟲流行病學研究行之有效的方 法，但是該類方法不能區別動物是正處于感染中還是已經感染耐過，不能鑒定帶蟲動物以 及貯存宿主。而且在檢測牛的巴貝斯蟲病過程中發現，牛巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲之間常 出現交叉反應。敏感性更高的方法，例如常規PCR檢測技術、反向線性斑點雜交技術(RBL) 以及PCR-ELISA等也已經見諸于報道，但是這些方法存在假陽性率高的缺點。另外，出于 經濟和實際應用等原因，大部分方法并不適合于流行病學的實驗室診斷，尤其是實時定量 PCR技術，必須使用較昂貴的實驗條件以及需要較高的專業技術，而且由于PCR儀需處于高 溫度、高濕度，甚至多灰塵的環境中，往往使得結果缺乏穩定性和規律性。基于DNA水平的 分子診斷，其敏感性與靶基因擴增的數目是息息相關的。因此選擇一個在基因組中高拷貝 數的基因作為靶基因將會大大提高現有PCR方法的敏感性。Salem等報道，他們在利用細 胞色素b基因作為靶基因建立的PCR方法檢測牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲時發現，該方法 要比利用ISSrRNA作為靶基因建立的方法靈敏20%。本研究根據LAMP的基本原理，針對 B. bovis的細胞色素b為靶基因的6個特異性區域，結合其它巴貝斯蟲cytb基因的相關信 息，設計4條特異性引物，建立一種簡便、高效、實用的DNA檢測方法。該方法可用于牛巴貝 斯蟲病現場快速檢測，應用前景廣闊。

發明內容
本發明提供一種牛巴貝斯蟲的LAMP檢測方法，通過以下技術方案實現(1)被檢標本DNA提取取200 μ 1無菌抗凝血液，Trizol試劑裂解后常規的酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4°C保存備用；(2)設置LAMP檢測試劑盒由Dof管、陽性對照、陰性對照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I 染料、dNTP、甜菜堿、10 X LAMP Buffer 組成；(3) LAMP擴增在Dof管中加入處理后的標本DNA，同時設陰、陽性對照，每管反應 體系為lmmol/L FIP, lmmol/L ΒΙΡ,Ο. 2mmol/L F3,0. 2mmol/LB3,4mmol/L MgS04,0. 8mmol/ L dNTP,0. 8mmol/L betaine, 10 X LAMP Buffer，1 μ LDNA 模板；加入 8U Bst DNA 聚合酶大 片段，混勻后稍離心；置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為62°C水浴反應60min，接著80°C終止 5min ；(4)擴增產物分析將擴增產物中加入1 10稀釋的SYBR GREEN I (IOOOOX)I μ L，肉眼觀察顏色變化，被檢標本出現的顏色變化與陽性對照和陰性對照比 對，以判定標本為牛巴貝斯焦蟲陽性或陰性。所述步驟(2)中Dof管含10 X LAMP Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物 F3、引物B3、引物FIP、引物BIP及MgS04。引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分別是按下 述堿基序列由DNA合成儀合成的DNA片段
引物F3 引物B3 引物FIP
引物BIP
5’ > GGTTGGGCAATGCGTTAT < 3’ 5’ > TGTCCGTAAGGAAGAACAT < 3’ 5' > CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCA GGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC < 3’ 5' > GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA < 3’ 所述步驟(3)中陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，所述陰性對照為雙重

蒸餾水。發明的優點是提供了一種檢測牛巴貝斯蟲的標準方法，可快速、準確地檢測出被 檢標本中的牛巴貝斯蟲，也可用于牛巴貝斯蟲的分子流行病學調查及療效監測。本方法的 模板DNA制備步驟簡單費用低，常規的方法需經溶菌酶、蛋白酶K、SDS(十二烷基硫酸鈉)、 CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)等試劑處理，時間長費用高。本方法檢測非常方便快捷，并 能提高檢測方法的特異性及敏感性。通過加入適量SYBR GREEN I染料即可通過肉眼觀測結 果，反應體系呈綠色為陽性，橙色則為陰性，同時該方法成本低廉，儀器要求簡單，耗時短， 結果判定簡單，特異性和靈敏度高，可滿足臨床檢測的需要，前景廣闊


圖1為本發明方法獲得的產物加入適量SYBR GREEN I染料通過肉眼觀測結果。圖2為應用本發明進行牛巴貝斯蟲病的流行病學調查結果。
具體實施例本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例一 設置LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包括(I)Dof管反應管內含10XLAMP Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物F3、 引物B3、引物FIP、引物BIP及MgS04。引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分別是按下述 堿基序列由DNA合成儀合成的DNA片段引物 F3 5，> GGTTGGGCAATGCGTTAT < 3，引物 B3 5，> TGTCCGTAAGGAAGAACAT < 3，引物 FIP 5，> CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCAGGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC < 3’引物 BIP 5，> GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG
GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA < 3’(2)陽性對照該對照為含有目的基因片段的重組質粒，構建方法是將擴增產物 克隆至pUCm-T轉化DH5- α感受態細胞，經酶切鑒定及測序后獲得陽性重組質粒，該質粒含 牛巴貝斯蟲1092bp基因片段。(3)陰性對照，該對照為雙重蒸餾水；(4) Bst DNA 聚合酶；(5) SYRB GREEN I 染料；(6)甜菜堿溶液(IOM)。實施例二1.標本的采集嚴格無菌采集可疑病牛的血樣不少于500μ 1，4°C或冷凍保存；2.被檢標本DNA提取取200 μ 1無菌抗凝血液，加入100 μ 1 Trizol試劑，充分 混勻后加入等體積的Tris飽和酚/氯仿混合液抽提，上清用2倍體積的無水乙醇沉淀2小 時，70%的乙醇洗滌后干燥，沉淀用10-20μ 1 TE緩沖液溶解后，4°C保存備用；3.參照實施例一設置LAMP檢測試劑盒；4. LAMP擴增在Dof管中加入處理后的標本DNA，同時設陰、陽性對照，每管反應體 系為lmmol/L FIP, lmmol/L ΒΙΡ,Ο. 2mmol/L F3,0. 2mmol/LB3,4mmol/L MgS04,0. 8mmol/L dNTP,0. 8mmol/L betaine, 10 X LAMP Buffer，1 μ LDNA 模板。加入 8U Bst DNA 聚合酶大片 段，混勻后稍離心。置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為62°C水浴反應60min，接著80°C終止 5min。5.擴增產物分析將擴增產物中加入1 10稀釋的SYBRGREEN I(IOOOOX)IyL, 肉眼觀察顏色變化，被檢標本出現的顏色變化與陽性對照和陰性對照比對，以判定標本為 牛巴貝斯蟲陽性或陰性。結果參見圖1，其中1為陽性對照，6為陰性對照，2為被檢標本陽 性，3、4、5為被檢樣標本陰性。實施例三方法基本同實施例一，隨機無菌采集牛血樣，提取DNA，LAMP方法擴增，電泳觀察。 結果參見圖2，其中1為陽性對照，2為陰性對照，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、 18、19、20、21、22、23、24為被檢標本陰性，16為被檢標本陽性。陽性率為4. 55 %。
權利要求
一種牛巴貝斯蟲LAMP檢測方法，其特征在于，通過以下技術方案實現(1)被檢標本DNA提取取200μl無菌抗凝血液，Trizol試劑裂解后常規的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷 乙二胺四乙酸溶解，4℃保存備用；(2)設置LAMP檢測試劑盒由Dof管、陽性對照、陰性對照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I染料、dNTP、甜菜堿、10×LAMP Buffer組成；(3)LAMP擴增在Dof管中加入處理后的標本DNA，同時設陰、陽性對照，每管反應體系為1mmol/L FIP，1mmol/L BIP，0.2mmol/L F3，0.2mmol/LB3，4mmol/L MgSO4，0.8mmol/L dNTP，0.8mmol/L betaine，10×LAMP Buffer，1μLDNA模板，加入8U Bst DNA聚合酶大片段，混勻后稍離心，置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為62℃水浴反應60分鐘，接著80℃終止5分鐘；(4)擴增產物分析將擴增產物中加入1∶10稀釋的SYBR GREEN I(10000×)1μL，肉眼觀察顏色變化，被檢標本出現的顏色變化與陽性對照和陰性對照比對，以判定標本為牛巴貝斯焦蟲陽性或陰性。
2.根據權利要求1所述的一種牛巴貝斯蟲LAMP檢測方法，其特征在于，所述步驟⑵ 中Dof管含10XLAMP Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸、引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP 及MgSO4，引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分別是按下述堿基序列由DNA合成儀合成的 DNA片段引物 F3 5，> GGTTGGGCAATGCGTTAT < 3，引物 B3 5，> TGTCCGTAAGGAAGAACAT < 3，引物 FIP 5' > CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCA < 3' GGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC < 3’引物 BIP 5’ > GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG， GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA < 3’
3.根據權利要求1所述的一種牛巴貝斯蟲LAMP檢測方法，其特征在于，所述步驟(3) 中陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，所述陰性對照為雙重蒸餾水。
全文摘要
本發明提供一種牛巴貝斯蟲的LAMP檢測方法，通過被檢標本DNA提取、設置LAMP檢測試劑盒、LAMP擴增、擴增產物分析，通過被檢標本出現的顏色變化與陽性對照和陰性對照比對判定。本發明提供的方法，可非常方便快速、準確地檢測出被檢標本中的牛巴貝斯蟲，也可用于牛巴貝斯蟲的分子流行病學調查及療效監測。本方法的模板制備步驟簡單費用低，并能提高檢測方法的特異性及敏感性。通過加入適量SYBR GREEN I染料即可通過肉眼觀測結果，儀器要求簡單，耗時短，結果判定簡單，特異性和靈敏度高，可滿足臨床檢測的需要，前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK101974621SQ20101028558
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月17日 優先權日2010年9月17日
發明者周前進, 李群, 杜愛芳, 王素華 申請人:浙江大學