本發明涉及實時熒光PCR領域，尤其涉及一種通用熒光探針及其檢測方法和應用。

背景技術：

現有技術中，熒光素標記方法在PCR中的應用，主要體現在熒光引物或熒光探針兩個方面。

其中，熒光引物的方法，主要有直接標記引物或者標記接頭引物，而PCR產物采用遺傳分析儀，如ABI遺傳分析儀310、3130、3130xl、3730等，通常用于檢測微衛星及基因分型，例如中國專利公告號為CN104178566的發明專利，即公開了一種可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭及檢測方法和應用，其引物設計圖和檢測流程圖分別如圖1和圖2所示。該技術的缺點包括：a)不能實現實時檢測；b)圖譜結果分析難，易誤判；c)PCR產物需后處理，易污染檢測環境。

熒光探針又可分為水解探針和雜交探針，其熒光信號檢測主要通過實時熒光定量PCR儀進行。其中，1)水解探針：如圖3所示，以TaqMan探針為例進行說明，水解探針的5'端和3'端分別標記了一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，在探針完整時，系統激發供體而產生的熒光信號被臨近的淬滅基團吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當PCR過程中Taq DNA聚合酶擴增到探針結合模版的位點時，其5'-3'核酸外切酶的活性切割掉探針5'端的報告基團——游離的報告基團遠離淬滅基團，打破能量的傳遞，激發報告基團產生的熒光信號就可以被熒光檢測系統檢測到，檢測的是信號的積累。這種TaqMan探針技術，需要針對目的基因或突變位點設計特異性探針，不同基因或突變位點需重新設計、合成，存在成本高且費時的問題。2)雜交探針，復性時兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產生檢測信號，到升溫變性探針遠離模板，無信號，檢測的是實時熒光信號。

分子信標(Molecular beacon，MB)是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近，在復性溫度下，模板不存在時，形成莖環結構，當加熱變性會使互補配對的莖環雙鏈解開，如圖4所示，如果有模板存在環序列，分子信標將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，淬滅作用被解除，發出激發光子。這種分子信標技術，需要針對目的基因或突變位點設計特異性探針，不同基因或突變位點需重新設計、合成，存在成本高且費時的問題；另外需通過熔解曲線Tm峰值進行檢測，檢測靈敏度有限。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種實現實時檢測、無需PCR后續處理、節省設計和合成時間、降低成本、結果穩定性好且易于分析的通用熒光探針及其檢測方法和應用。

本發明第一方面提供一種通用熒光探針，包括正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物；其中，

所述正鏈探針包括由5’端至3’端依次相連的寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)、連接序列和特異性上游引物序列(ASO)；

所述負鏈探針包括與寡聚核苷酸正鏈序列互補的寡聚核苷酸負鏈序列，所述寡聚核苷酸負鏈序列的5’端和3’端分別連接有熒光基團(R)和淬滅基團(Q)；

所述特異性上游引物序列(ASO)和特異性下游引物(LSO)與目標基因的靶點序列相互互補。

進一步的，所述連接序列包括TA Box序列，所述TA Box序列為包括但不限于AA、TT、AAA、TTT、AT、TA、ATA、TAT、AAT、TAA、ATTT、TAAA、TATT、AATA、TTAT、TATA、ATAT、ATATA、TATATA、TTTAA、TATTT、TTATT、TTTAT、TAATT、TTAAT、AAATT、ATAAA、AATAA或AAATA的序列。

應當說明的是，為了實現通用熒光探針在某一類目的生物中的通用檢測，所述寡聚核苷酸正鏈序列與采用該通用熒光探針進行檢測的目的生物的序列相比無同源性或序列相似度小于30％。

應當說明的是，同源性是指進化過程中源于同一祖先的分支之間的關系，同源性是來描述物種之間的進化關系的，所謂同源序列，是指從某一共同祖先經趨異進化而形成的不同序列。相似性是指序列比對過程中用來描述檢測序列和目標序列之間相同DNA堿基或氨基酸殘基順序所占比例的高低。一般認為，序列之間的相似性(similarity)越高，序列之間同源的可能性越大。當相似程度高于50％時，比較容易推測檢測序列和目標序列可能是同源序列；而當相似性程度低于20％時，就難以確定或者根本無法確定兩者具有同源性。

關于通用熒光探針的設計，若目的生物為真核生物，則所述寡聚核苷酸正鏈序列可根據酵母菌基因組序列設計而成。

進一步的，所述寡聚核苷酸正鏈序列采用如SEQ ID NO：1-6中任一項所示的核苷酸序列，相應的，所述寡聚核苷酸負鏈序列采用如SEQ ID NO：7-12中所示的核苷酸序列。其序列信息具體如下：

GCGTGTTGAGTGTGCGGCGTAGA(SEQ ID NO：1)

GCGAAAGCCTGACGGAGCGAG(SEQ ID NO：2)

AGATGTAGCGATAGCCTGAGCGAGCGA(SEQ ID NO：3)

GATGAGTGTGTTGCGGCGTAGATGAGTG(SEQ ID NO：4)

TAGCGATAGCCTGAGCGAGCGA(SEQ ID NO：5)

GCGATGCGTGACGGAGAGTGAG(SEQ ID NO：6)

R-TCTACGCCGCACACTCAACACGC-Q(SEQ ID NO：7)

R-CTCGCTCCGTCAGGCTTTCGC-Q(SEQ ID NO：8)

R-TCGCTCGCTCAGGCTATCGCTACATCT-Q(SEQ ID NO：9)

R-CACTCATCTACGCCGCAACACACTCATC-Q(SEQ ID NO：10)

R-TCGCTCGCTCAGGCTATCGCTA-Q(SEQ ID NO：11)

R-CTCACTCTCCGTCACGCATCGC-Q(SEQ ID NO：12)

其中，R代表熒光基團，Q代表淬滅基團。

進一步的，所述熒光基團包括但不限于FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，所述淬滅基團包括但不限于BHQ1或BHQ2。

本發明第二方面提供一種采用前述通用熒光探針的檢測方法，包括以下步驟：

S1、提取樣品的基因組DNA；

S2、將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合；

S3、配制PCR反應體系，進行實時熒光PCR擴增；

S4、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析。

應當說明的是，對于低豐度目標樣品或者低回收率的核酸樣本，在步驟S1之后還包括采用上游引物(FP)和下游引物(RP)對樣品的基因組DNA預擴增的步驟，然后再將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合，然后進行PCR擴增；對于高豐度目標樣品或者高回收率的核酸樣本，可以直接將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合，然后進行PCR擴增。

進一步的，所述上游引物和下游引物、以及通用熒光探針均設置為多組以同時檢測多個目標基因，或者，所述通用熒光探針設置為多組以檢測多個目標基因、或單個目標基因的多個基因型。

本發明第三方面提供一種前述通用熒光探針，在基因分型和突變基因檢測上的應用。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：

1)通用熒光探針序列特異，通用性較高；

2)通用熒光探針可用于SNP位點檢測；

3)UAP序列和ASO序列引入TA Box，消除熒光基團與相鄰模板堿基引起的熒光淬滅效應，避免影響檢測；

4)UAP序列靈活變動，消除引物自身二級機構對檢測結果的影響；

5)一步法檢測，無需后續處理即可獲得實時檢測結果，快速、準確，無污染。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1是現有技術中多重熒光PCR通用接頭引物設計圖；

圖2是現有技術中用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭的檢測方法流程圖；

圖3是現有技術中TaqMan探針的工作原理圖；

圖4是現有技術中分子信標的工作原理圖；

圖5是本發明第一實施例中通用熒光探針設計圖；

圖6是本發明第一實施例中通用熒光探針PCR擴增原理；

圖7是采用BIO-RAD熒光定量PCR儀和通用熒光探針對等位基因中的突變型基因位點檢測結果圖；

圖8是采用ABI7500熒光定量PCR儀和通用熒光探針對等位基因中的突變型基因位點檢測結果圖；

圖9是本發明第二實施例中基因分型結果圖；

圖10是本發明第三實施例中基因分型結果圖；

圖11是本發明第四實施例中基因分型結果圖；

圖12是本發明第五實施例中基因分型結果圖；

圖13是本發明第六實施例中基因分型結果圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例一

本發明一較佳實施例提供一組通用熒光探針，如圖5所示，包括正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物；其中，正鏈探針包括由5’端至3’端依次相連的寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)、連接序列(TA Box)和特異性上游引物序列(ASO)；負鏈探針包括與寡聚核苷酸正鏈序列互補的寡聚核苷酸負鏈序列(UP)，寡聚核苷酸負鏈序列的5’端和3’端分別連接有熒光基團(R)和淬滅基團(Q)，熒光基團可選用FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，淬滅基團可選用BHQ1或BHQ2；特異性上游引物序列(ASO)和特異性下游引物(LSO)與目標基因的靶點序列相互互補。

采用該通用熒光探針的檢測方法，包括以下步驟：

S1、提取樣品的基因組DNA；

S2、將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合；

S3、配制PCR反應體系，進行實時熒光PCR擴增；

S4、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析。

通用熒光探針的PCR擴增原理，如圖6所示：

第一步：正鏈探針UAP-TA Box-ASO與特異性下游引物LSO分別以基因組DNA為模板擴增，產生互補鏈；

第二步：特異性下游引物LSO以第一步擴增產物為模板，延伸至負鏈探針UP位置，水解負鏈探針5’端的熒光基團，產生游離的熒光基團；

第三步：熒光檢測，分析檢測結果。

對于低豐度目標樣品或者低回收率的核酸樣本，在步驟S1之后還包括采用上游引物(FP)和下游引物(RP)對樣品的基因組DNA預擴增的步驟，然后再將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合，然后進行PCR擴增；對于高豐度目標樣品或者高回收率的核酸樣本，可以直接將通用熒光探針中正鏈探針、負鏈探針以及特異性下游引物按一定比例混合，然后進行PCR擴增。

進一步的，所述上游引物和下游引物、以及通用熒光探針均設置為多組以同時檢測多個目標基因，或者，所述通用熒光探針設置為多組以檢測多個目標基因、或單個目標基因的多個基因型。

以通用熒光探針設置為多組以檢測單個目標基因的多個基因型為例，作進一步說明，熒光基團和淬滅基團標記在UP序列的5’端和3’端，并可與其任意組合，但是同時使用的不同通用熒光探針的熒光基團和淬滅基團不能重復，需建立一一對應關系。現有的熒光基團(FAM、TET、Texas Red、VIC、Cy5等)和淬滅基團(BHQ1、BHQ2等)，根據儀器檢測通道及檢測類型進行選擇，避免光譜重疊。

以檢測等位基因中的突變型基因位點為例，具體實驗流程如下：

S1、設計通用熒光探針，包括正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、特異性上游引物(FP)以及特異性下游引物(RP/LSO)；

S2、特異性上游引物(FP)以及特異性下游引物(RP)配置反應體系，進行DNA模板預擴增；

S3、將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按一定比例混合為混合引物，配置反應體系，以預擴增產物進行實時熒光定量PCR檢測；

反應體系為10μL，包括2X TaKaRa Taq^TM HS Perfect Mix 5ul、混合引物1.2μL、熒光標記接頭0.5μL、去離子水1μL、DNA 20ng。

S4、結果分析，生成檢測報告，基于現有熒光定量PCR儀器，通過檢測熒光信號強度，進行基因型檢測，不同儀器分型圖7和8所示，分別為BIO-RAD熒光定量PCR儀和ABI7500熒光定量PCR儀，可以準確檢測等位基因中的突變型基因位點。

其中，寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)和寡聚核苷酸負鏈序列(UP)的序列可分別設計如表1所示。

表1 UAP和UP序列表

其中，TA Box序列組合方式如表2所示。

表2 TA Box序列設計圖

實施例二

本發明提供一種實時熒光PCR儀運用通用熒光探針進行rs2294008位點基因分型的方法，具體步驟如下：

S1、合成正鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、與正鏈探針相互補的負鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)以及特異性下游引物(LSO)；

表3 rs2294008基因分型檢測引物設計表

表中，標記下劃線的部分為寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)，方框標記的為連接序列(TA Box)，未標記的為特異性上游引物序列(ASO)，對應檢測rs2294008位點的野生型和突變型。

S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DNA；

S3、選取新合成的rs2294008位點的上游引物(FP)及下游引物(RP)對DNA模板進行預擴增；

S4、采用表3中的通用熒光探針，將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按照一定比例(摩爾比)混合，在渦旋混合器上混勻組成混合引物；

S5、將混合引物配置成PCR反應體系，以預擴增產物進行實時熒光PCR擴增；

S6、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析；根據熒光檢測結果進行基因分型，其結果如圖9所示，可見通用熒光探針可以很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開。

實施例三

本發明提供一種實時熒光PCR儀運用通用熒光探針進行rs6010620位點基因分型的方法，具體步驟如下：

S1、合成正鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、與正鏈探針相互補的負鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)以及特異性下游引物(LSO)；

表4 rs6010620基因分型檢測引物設計表

表中，標記下劃線的部分為寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)，方框標記的為連接序列(TA Box)，未標記的為特異性上游引物序列(ASO)，對應檢測rs6010620位點的野生型和突變型。

S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DNA；

S3、選取新合成的rs6010620位點的上游引物(FP)及下游引物(RP)對DNA模板進行預擴增；

S4、采用表4中的通用熒光探針，將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按照一定比例(摩爾比)混合，在渦旋混合器上混勻組成混合引物；

S5、將混合引物配置成PCR反應體系，以預擴增產物進行實時熒光PCR擴增；

S6、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析；根據熒光檢測結果進行基因分型，其結果如圖10所示，可見通用熒光探針可以很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開。

實施例四

本發明提供一種實時熒光PCR儀運用通用熒光探針進行rs339331位點基因分型的方法，具體步驟如下：

S1、合成正鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、與正鏈探針相互補的負鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)以及特異性下游引物(LSO)；

表5rs339331基因分型檢測引物設計表

表中，標記下劃線的部分為寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)，方框標記的為連接序列(TA Box)，未標記的為特異性上游引物序列(ASO)，對應檢測rs339331位點的野生型和突變型。

S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DNA；

S3、選取新合成的rs339331位點的上游引物(FP)及下游引物(RP)對DNA模板進行預擴增；

S4、采用表5中的通用熒光探針，將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按照一定比例(摩爾比)混合，在渦旋混合器上混勻組成混合引物；

S5、將混合引物配置成PCR反應體系，以預擴增產物進行實時熒光PCR擴增；

S6、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析；根據熒光檢測結果進行基因分型，其結果如圖11所示，可見通用熒光探針可以很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開。

實施例五

本發明提供一種實時熒光PCR儀運用通用熒光探針進行rs17728461位點基因分型的方法，具體步驟如下：

S1、合成正鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、與正鏈探針相互補的負鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)以及特異性下游引物(LSO)；

表6 rs17728461基因分型檢測引物設計表

表中，標記下劃線的部分為寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)，方框標記的為連接序列(TA Box)，未標記的為特異性上游引物序列(ASO)，對應檢測rs17728461位點的野生型和突變型。

S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DNA；

S3、選取新合成的rs17728461位點的上游引物(FP)及下游引物(RP)對DNA模板進行預擴增；

S4、采用表6中的通用熒光探針，將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按照一定比例(摩爾比)混合，在渦旋混合器上混勻組成混合引物；

S5、將混合引物配置成PCR反應體系，以預擴增產物進行實時熒光PCR擴增；

S6、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析；根據熒光檢測結果進行基因分型，其結果如圖12所示，可見通用熒光探針可以很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開。

實施例六

本發明提供一種實時熒光PCR儀運用通用熒光探針進行rs11903757位點基因分型的方法，具體步驟如下：

S1、合成正鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、與正鏈探針相互補的負鏈探針(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)以及特異性下游引物(LSO)；

表7 rs11903757基因分型檢測引物設計表

表中，標記下劃線的部分為寡聚核苷酸正鏈序列(UAP)，方框標記的為連接序列(TA Box)，未標記的為特異性上游引物序列(ASO)，對應檢測rs11903757位點的野生型和突變型。

S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DNA；

S3、選取新合成的rs11903757位點的上游引物(FP)及下游引物(RP)對DNA模板進行預擴增；

S4、采用表7中的通用熒光探針，將正鏈探針(UAP-TA Box-ASO)、負鏈探針(UP)、和特異性下游引物(LSO)按照一定比例(摩爾比)混合，在渦旋混合器上混勻組成混合引物；

S5、將混合引物配置成PCR反應體系，以預擴增產物進行實時熒光PCR擴增；

S6、根據實時檢測的熒光信號強度進行結果分析；根據熒光檢測結果進行基因分型，其結果如圖13所示，可見通用熒光探針可以很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 健路生物科技（蘇州）有限公司

<120> 一種通用熒光探針及其檢測方法和應用

<130> 2016

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgtgttgag tgtgcggcgt aga 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgaaagcct gacggagcga g 21

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatgtagcg atagcctgag cgagcga 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgagtgtg ttgcggcgta gatgagtg 28

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagcgatagc ctgagcgagc ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgatgcgtg acggagagtg ag 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctacgccgc acactcaaca cgc 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcgctccgt caggctttcg c 21

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcgctcgctc aggctatcgc tacatct 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cactcatcta cgccgcaaca cactcatc 28

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcgctcgctc aggctatcgc ta 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcactctcc gtcacgcatc gc 22

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgtgttgag tgtgcggcgt agaatataca gcccaccagt gaccac 46

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgaaagcct gacggagcga gatatacaca gcccaccagt gaccat 46

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccaagcctg ccatcaaca 19

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tagcgatagc ctgagcgagc gaatacaacc agatcatgca aagcaggt 48

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcgatgcgtg acggagagtg agataaccag atcatgcaaa gcaggc 46

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgttttccc tttttgagac ctggg 25

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agatgtagcg atagcctgag cgagcgaaat cctcctagtc actaaagata aacctcata 59

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gatgagtgtg ttgcggcgta gatgagtgaa tcctcctagt cactaaagat aaacctcatg 60

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtacactttg catgaactct ctctccc 27

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgtgttgag tgtgcggcgt agataacctc agtggagaag ttttatctgc ac 52

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gcgaaagcct gacggagcga gtaacctcag tggagaagtt ttatctgcag 50

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtacactttg catgaactct ctctccc 27

<210> 25

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agatgtagcg atagcctgag cgagcgattt ctggacttgt aactggtgtt tgca 54

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gatgagtgtg ttgcggcgta gatgagtgtt ttggacttgt aactggtgtt tgcg 54

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtacactttg catgaactct ctctccc 27