專利名稱：一種丙型肝炎病毒基因分型熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種生物檢測技術，尤其涉及一種用于檢測丙型肝炎病毒基因型的檢測試劑盒。
背景技術：
丙型病毒性肝炎是由多種丙型肝炎病毒(HCV)引起的，以肝臟損害的一組全身性傳染病。丙型肝炎主要是通過輸血或血制品、血透析、單采血漿還輸血球、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。丙型病毒性肝炎分布較廣，容易演變為慢性、肝硬化和肝癌。基因分型在HCV感染、傳播、診斷、診療、預防等方面均有重要意義。目前臨床上常用的HCV基因分型的檢測方法主要有1.測序法采用特異性PCR引物擴增部分病毒基因組區域，聯合多部位的測序結果進而描繪系統進化樹。直接測序法的優點是可提供被測區域的全部信息，包括病毒基因組內部的多態性，并可以發現新的基因變異形式，缺點是操作繁瑣，成本較高，對混合感染不易確定。2.型特異性RT-PCR方法通過對套式RT-PCR引物設計的優化，使擴增片斷大小不同，達到分型目的。改良后的方法可將6個基因型完全分開，并可以區分混合感染。該方法的優點是成本較低，不需要特殊設備，缺點是有時會出現較弱的擴增條帶，難以判斷。3.型特異性探針雜交法通過將生物素或熒光素標記型特異性探針固相化在膜或芯片上，與RT-PCR擴增的病毒產物進行雜交后，經掃描判讀出HCV基因型，代表性試劑為 Inno-LiPA II。該方法準確性和靈敏性較高，在國外報道的HCV基因分型研究中常用。4.基因芯片法近來開發的新方法，與測序法的符合率在90%以上，適用于大量樣本的檢測，需要專用檢測分析設備。

發明內容
本發明的目的在于針對上述現有HCV基因分型檢測存在的問題，利用PCR-熒光探針法，使丙型病毒性肝炎的基因分型有更為科學、便捷的檢測診斷手段，可為醫院、病人普遍接受。為了達到上述發明目的，本發明的技術方案為提供一種丙型肝炎病毒基因分型檢測方法及試劑盒，采用一步熒光RT-PCR技術對丙型肝炎病毒進行檢測。在核酸提取后， 直接配制反應體系進行擴增，反應體系配制方便，擴增程序步驟簡便，擴增時間短。本發明方法操作簡便、敏感度高、結果明晰。本發明提供的試劑盒包括=RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶、引物探針、陰性對照、 HCV 1型陽性對照、HCV 2型陽性對照。其中所述的RT-PCR反應液為1Tris-HCl (pH8. 3) 20mM、 KCl lOOmM、明膠 0. 2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 0. 4mM、MgCl26mM 的混合液；所述的 RT-PCR混合酶為逆轉錄酶和Taq酶的混合物；所述的引物探針為HCV特異性引物、HCV 1型特異性探針及HCV 2型特異性探針的混合液；所述的陰性對照為無HCV RNA的人血清；所述的HCV 1型陽性對照為含有HCV 1型基因片段的非傳染性體外轉錄RNA的人血清；所述的 HCV 2型陽性對照為含有HCV 2型基因片段的非傳染性體外轉錄RNA的人血清。檢測用的HCV片段特異性引物分上游引物和下游引物，上游引物序列<SEQ ID No. 3> 為5，-TGAGTACACCGGAATTGCC-3，下游引物序列<SEQ ID No. 4> 為5，-CTACTCGGCTAGCAGTCT-3，HCV 1型特異性探針序列<SEQ ID No. 5>為5，-CAACCCGCTCAATGCCTGGAG-3，。HCV 2型特異性探針序列<SEQ ID No. 6>為5，-AAACCCACTCTRTGCCCGGTC-3，本發明提供的試劑保存于-20°C，盡量減少反復凍融。本發明試劑盒使用方法每次檢測均應設立HCV 1型陽性對照、HCV 2型陽性對照和陰性對照。擴增檢測a、按反應樣本數(反應樣本數=待檢樣品數+對照品3個+l)n配制反應液取 RT-PCR反應液ηΧ12. 5μ 1、引物探針ηΧ2μ 1、RT-PCR混合酶ηΧΟ. 5 μ 1于一離心管中混勻；低速離心數秒，按15 μ 1/管分裝到反應管中。b、取樣本提取物、陰性對照提取物、HCV 1型陽性對照提取物和HCV 2型陽性對照各IOy 1分別加入反應管中，低速離心數秒，取出置全自動熒光PCR儀上。c、50°C反應 15min，然后 95°C保溫 anin，再按 94°C IOs — 60°C 45s，循環 45 次， 60°C采集FAM、HEX熒光通道的信號。d、儀器PCR程序運行完成后按儀器及軟件要求進行結果保存和數據分析。以取高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值。分析軟件自動計算各樣品提取物的陰陽性結果。本發明方法原理是基于TaqMan水解探針熒光PCR原理，以病毒RNA為模板，采用病毒基因組特異性引物探針，輔以逆轉錄酶和Taq酶，經一步法熒光RT-PCR實驗，可快速、 準確對丙型肝炎病毒RNA模板進行分析；從逆轉錄到熒光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本發明的檢測方法及試劑盒特異性強、敏感度高、操作簡便、結果明晰，可用于血清或血漿中丙型肝炎病毒的基因分型檢測。非常適合醫院檢驗科室、傳染病防治中心以及各級丙型肝炎檢測單位使用。
具體實施例方式實施例1 一種丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒1.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取。使用硅膠柱離心法進行提取。2.逆轉錄及實時熒光PCR擴增(每人份25ul體系)a、一步基因分型RT-PCR反應液的配制RT-PCR 反應液12. 5ulRT-PCR 混合酶(Taq 酶 1. 5U/ul，逆轉錄酶 0. 5U/ul) 0. 5ul引物探針2ul
_反應液體積15ulb、基因分型一步法RT-PCR反應程序[1]50°C15min[2] 95 °C2min[3]94°CIOs[4]60 °C45s[5]Go to[3],45cycles在第五步采集熒光。[6] End3.檢測本發明使用ABI Prism 7500實時基因分型PCR儀進行檢測。4.結果判斷儀器PCR程序運行完成后按儀器及軟件要求進行結果保存和數據分析。以取高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值。分析軟件自動計算各樣品提取物的陰陽性。實施例2臨床檢測用上述方法對200例HCV陽性臨床樣品進行檢測，其中HCV 1型患者168例，HCV 2型患者32例，準確率100%，能對丙型肝炎病毒進行準確基因分型分析，遠遠優于酶聯免疫。本發明的檢測方法及試劑盒特異性強、敏感度高、操作簡便、可重復度高，可對丙型肝炎病毒進行快速定性檢測，并可替代一直沿用的傳統測序方法。同時，利用一步法熒光RT-PCR 技術。在核酸提取結束后直接加入到反應體系中，cDNA的合成和PCR反應在一管，無需增加額外步驟。該操作既確保了擴增結果的準確性，靈敏度，又縮短了時間、減少了污染，提高了基因分型PCR檢測方法的簡便性，不僅可用于HCV基因分型，也可作為臨床實驗室對HCV 感染的輔助診斷方法和臨床治療效果的監測手段。
權利要求
1.一種丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于本發明通過考察人體丙型肝炎病毒各個亞型序列之間特異位點的差異，設計出一對HCV特異性引物、一條HCV 1型特異性熒光探針和一條HCV 2型特異性熒光探針，采用實時PCR方法擴增目的基因。
2.—種丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于本發明采用一步 RT-PCR技術對丙型肝炎病毒進行基因分型檢測。在核酸提取后，直接配制反應體系進行擴增，反應體系配制方便，擴增程序步驟簡便，擴增時間短。該方法操作簡便、敏感度高、結果明晰，非常適合血清或血漿中丙型肝炎病毒的基因分型檢測。
3.如權利要求2中所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于 所述的RT-PCR反應液的配制和擴增程序如下a、一步基因分型RT-PCR反應液的配制將RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶(Taq酶1. 5U/ul，逆轉錄酶0. 5U/ul)、引物探針按照 12. 5 0.5 2的比例混合，反應液體積為15ul。b、一步基因分型RT-PCR反應程序[1]50°C15min[2]95 °C2min[3]94°CIOs[4]60 °C45s[5]Goto[3],45cycles在第四步采集熒光。[6]End
4.如權利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶、引物探針、陰性對照、HCV 1型陽性對照、HCV 2型陽性對照。
5.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的 RT-PCR 反應液為 Tris-HCl (pH8. 3)20mM、KCl 100mM、明膠 0. 2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、 dTTP各0. 4mM、MgCl26mM的混合液；所述的RT-PCR混合酶為逆轉錄酶和Taq酶的混合物； 所述的引物探針為一對HCV特異性引物、HCV 1型特異性探針及HCV 2型特異性探針的混合液；所述的陰性對照為無HCV RNA的人血清；所述的1型陽性對照為含有HCV 1型基因片段的非傳染性體外轉錄RNA的人血清；所述的2型陽性對照為含有HCV 2型基因片段的非傳染性體外轉錄RNA的人血清。
6.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于丙型肝炎病毒特異性PCR擴增的基因序列為<SEQ ID No. 1> :5’-TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAG-3’ (HCV 1 型)和 <SEQ ID No. 2> -TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTG2GTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATAAACCCACTCTRTGCCCGGTCATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAG-3， (HCV 2型)。丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒擴增序列全長16^p，屬5’非編碼區，為單拷貝序列。
7.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，一對HCV特異性引物序列中一條序列與SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中所示的部分序列相同，另一條序列與 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中所示的部分序列互補；HCV 1型特異性探針與SEQ ID No. 1 中所示的部分序列相同或互補；HCV 2型特異性探針與SEQ ID No. 2中所示的部分序列相同或互補。
8.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的一對HCV特異性引物，其序列可以選自SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4<SEQ ID No. 3> 為5’ TGAGTACACCGGAATTGCC 3，<SEQ ID No. 4> 為5’ CTACTCGGCTAGCAGTCT 3，一對HCV特異性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10 20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
9.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的HCV 1型特異性探針，可以選自SEQ ID No. 5的序列，<SEQ ID No. 5> 為5’ -CAACCCGCTCAATGCCTGGAG-3，。其中探針5’端標記FAM熒光基團，探針3’端標記淬滅基團。HCV 1型特異特異性探針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10 20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
10.如權利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的HCV 2型特異性探針，可以選自SEQ ID No. 6的序列，<SEQ ID No. 6> 為5，-AAACCCACTCTRTGCCCGGTC-3，。其中探針5’端標記HEX熒光基團，探針3’端標記淬滅基團。HCV 2型特異性探針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10 20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于 85%以上。
全文摘要
本發明提供了一種丙型肝炎病毒(HCV)基因分型熒光PCR檢測試劑盒，試劑盒包括RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶、引物探針、陰性對照、1型陽性對照、2型陽性對照。本發明通過提取HCV RNA，通過一步法RT-PCR，檢測樣本中HCV RNA的基因類型。本發明的試劑盒一步法擴增方法簡單、程序簡短、操作簡便，檢測結果特異性強、敏感度高、結果明晰，可用于血清或血漿中丙型肝炎病毒的基因分型檢測，非常適合臨床及科研單位使用。
文檔編號C12R1/93GK102534045SQ20101062190
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者吳大治, 夏懿, 陳碩 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司