專利名稱：含有栗子皮提取物的健康食品或藥學組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有栗子皮提取物的健康食品或藥學組合物。
背景技術：
瘙癢被定義為誘發想搔抓的欲望的不愉快的皮膚感覺，作為疼痛、觸覺、冷或熱之類的生理性自我防御機制，在皮膚被暴露于來自外部的有害刺激中時，對其進行認知而起到保護皮膚的作用。瘙癢癥是在多種皮膚疾病或全身疾病中經常表現的共同癥狀中的一種，實際情況是，蕁麻疹、各種藥物的副作用所致的急性瘙癢癥能夠容易地被治愈，但是膽道閉鎖、腎臟疾病或特應性疾病之類的重癥慢性瘙癢癥的治療非常困難。瘙癢由炎癥、癌、代謝性疾病、感染、精神科疾病、藥物給藥或壓力等多種原因誘發，在最近的若干研究結果中，明確了皮膚與末梢神經系統及中樞神經系統的有機連接與針對誘發瘙癢的刺激的反應、調節密切相關。最近，明確了特定的感覺神經細胞及其受體對瘙癢特異性地反應，已經接受了瘙癢不是疼痛的下位狀態，而是作為感覺神經系統的個別感覺，認為互不相同的瘙癢介質及其受體與多種誘發瘙癢的疾病相關(Steinhoff et al.，Journal of Investigative Dermatology, 126，ppl705_1718，2006)。在迄今為止的用于瘙癢癥研究的實驗中，主要使用組胺，但是提出以下主張，即特應性之類的慢性瘙癢癥與其說是由組胺依賴性通路(pattway)導致，不如說是由神經性原因導致，這說明為什么抗組胺對特應性疾病的瘙癢癥不起效(Stander et al., Experimental Dermatology, 11，ppl2~24,2002)。另外，已知第1代抗組胺劑主要用于全身給藥，但具有抗副交感作用而顯示鎮靜作用，作為第1代抗組胺劑的撲爾敏在局部給藥時，無法抑制特應性皮炎患者的瘙癢 (Munday et al.，Dermatology, 205, pp40_45，2002)，由于存在皮膚過敏反應的危險，因此不鼓勵對特應性皮炎使用局部抗組胺劑。作為沒有鎮靜作用的第2代抗組胺劑的依巴斯汀、特非那定與阻礙細胞色素(cytochrome)P450活性的藥物(酮康唑、紅霉素)一起服用時，有時引起心律不齊(Hey et al.，Arzneimittelforschung, 46, ppl59_163，1996)，而引起與其相關的副作用。因此，目前迫切需要開發在有效的同時副作用小且安全的瘙癢癥治療劑，特別是對特應性之類的慢性瘙癢癥有效的治療藥。

發明內容
因此，本發明的目的是解決一直以來所要解決的技術課題。具體而言，本發明的一個實施例的目的是提供含有栗子皮提取物的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物、用于改善皮膚屏障的健康食品或藥學組合物、以及用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物。
根據這樣的目的，本發明一個實施例涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物，其既減少以往的瘙癢癥治療藥具有的副作用、又具有優異的抑制或緩和瘙癢癥的效果。本發明一個實施例涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于改善皮膚屏障功能的健康食品或藥學組合物。本發明一個實施例涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物。本發明的一個實施例涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于改善或治療特應性皮炎的健康食品或藥學組合物。本發明的組合物含有栗子皮提取物作為有效成分，從而可通過抑制作為瘙癢刺激源的蛋白分解酶活性受體-2 (Proteinase-Activated Rec印tor_2 :PAR-2)的活性而發揮優異的瘙癢癥抑制或緩和效果，不僅可以顯著地改善由瘙癢癥誘發的皮膚屏障破壞，而且還可以通過栗子皮提取物的免疫抑制活性而根本性地治療能夠成為誘發瘙癢癥的原因的免疫過敏性反應。


圖1是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物的PAR-2活性抑制效果(胰蛋白酶處理)的測定結果的圖表。圖2是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物的PAR-2活性抑制效果(SLIGKV 處理)的測定結果的圖表。圖3是示出本發明的一個實施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的PAR-2活性抑制效果(胰蛋白酶，SLIGKV處理)的測定結果的圖表。圖4是示出本發明的一個實施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的瘙癢癥(胰蛋白酶處理)抑制效果的圖表。圖5是示出本發明的一個實施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的瘙癢癥 (SLIGRL處理)抑制效果的圖表。圖6是示出本發明的一個實施例的栗子皮乙醇提取物的瘙癢癥(SLIGRL處理)抑制效果的圖表。圖7是示出本發明的一個實施例的栗子皮乙醇提取物口服給藥的瘙癢癥(SLIGRL 處理)抑制效果的圖表。圖8是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少TNF- α分泌的效果的圖表。圖9是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少IL -6分泌的效果的圖表。圖10是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少IL-I α分泌的效果的圖表。圖11是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少IL-8分泌的效果的圖表。圖12是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少GM-CSF分泌的效果的圖表。圖13是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少胰蛋白酶與活性肽 (SLIGKV)所致IL-6分泌的效果的圖表。
圖14是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少胰蛋白酶與活性肽 (SLIGKV)所致IL-8分泌的效果的圖表。圖15是示出本發明的一個實施例的栗子皮提取物減少胰蛋白酶與活性肽 (SLIGKV)所致GM-CSF分泌的效果的圖表。圖16是示出本發明的一個實施例的栗子皮乙醇提取物的皮膚保濕效果的測定結果的圖表。圖17是示出本發明的一個實施例的栗子皮乙醇提取物的改善角化過度的效果的測定結果的圖表。圖18是示出本發明一個實施例的栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中的瘙癢癥改善效果的測定結果的圖表。圖19是示出本發明一個實施例的栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中的IgE減少效果的測定結果的圖表。圖20是示出本發明的一個實施例的栗子的內皮(嫩皮)和外皮(外殼)提取物導致的PAR-2活性抑制效果的測定結果的圖表。
具體實施例方式本發明涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物。本申請的發明人等將蛋白分解酶活性受體KProteinase-Activated Receptor-2 :PAR-2)作為瘙癢癥治療的目標，測定栗子皮提取物導致的PAR-2活性抑制的程度，結果如后述實施例中所證實的那樣，確認了在試管內顯示出優異的PAR-2拮抗作用， 另外，在作為使PAR-2特異性地活化的肽的SLIGRL、SLIGKV或作為蛋白分解酶的胰蛋白酶 (Trypsin)誘發的瘙癢抑制實驗中，確認了顯著地抑制PAR-2的活性，顯示非常優異的瘙癢抑制效果。上述瘙癢癥也被稱為搔癢癥，這種瘙癢癥的誘發原因或形態沒有特別限制，例如， 由包括炎癥性皮炎、特應性皮炎、肌膚皸裂所致的皮炎、痱子、潰瘍、凍傷、接觸性皮炎、脂溢性皮炎、銀屑病及副銀屑病的皮炎中的一種以上誘發。在瘙癢癥的情況下，會由于連續性瘙癢而持續地對皮膚進行擦、搔抓或掐。由此， 誘發皮膚的潰瘍、擦傷、苔癬、癢疹、過度色素沉著或色素沉著減少等二次性皮膚損傷，分泌誘導皮膚中炎癥反應的各種物質，這樣的分泌再次增加瘙癢，而形成瘙癢-搔抓的循環。但是，本發明的健康食品或藥學組合物中所含的栗子皮提取物顯示有效的皮膚屏障功能改善效果，結果可以有效地預防或治療瘙癢誘發的二次性皮膚損傷。上述組合物對例如由來自特應性皮炎的瘙癢而產生的2次性皮膚損傷在緩和皮膚屏障損傷或改善皮膚屏障恢復力方面顯示顯著的效果，由此，可以顯著地改善皮膚屏障。特別是，上述組合物可以通過增進皮膚保濕、防止皮膚角化過度而改善皮膚屏障， 如通過后述實施例而證實的那樣，本申請的發明人等利用對無毛小鼠(Hairless mice)用 ρ惡唑酮(oxazolon)進行處理的過敏模型進行實驗，測定經表皮水分損失(trans印idermal water loss，TEWL)和皮膚厚度(skin thickness)，結果確認了栗子皮提取物顯示有效的增進皮膚保濕或防止其角化過度的效果。進而，本發明涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物。上述組合物可以是用于治療例如特應性、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)或克羅恩病(Crohn，s disease)的健康食品或藥學組合物，其中，可以是用于預防或治療作為免疫過敏性反應的特應性疾病的組合物。在特應性疾病從皮膚損傷等導致的急性階段向慢性疾病階段發展時，觀察到免疫介質的多種分泌狀態的變化，但在患有特應性疾病的患者的損傷皮膚中，多數白細胞介素 (Interleukin)的濃度變得增加。另外，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)已知在特應性皮膚疾病患者的損傷皮膚中，其分泌量增加，引起慢性炎癥反應，而會引起特應性患者免疫體系的不均衡(Matsubara et al.，FEBS Letters, 566，ppl95_200，2004)。與此相關，本申請的發明人等確認了栗子皮提取物可以顯著減少與免疫過敏性反應相關的腫瘤壞死因子-a (Tumor Necrosis Factor- α :TNF_ α )、白細胞介素-6 (IL-6)、 白細胞介素-Ια (IL-la)、白細胞介素-8(IL_8)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor =GM-CSF)的表達，結果栗子皮提取物適于作為用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物的有效成分。特別是，本發明含有栗子皮提取物作為有效成分，適合用于改善或治療特應性皮炎的化妝料組合物的有效成分。另外，上述白細胞介素-6(IL_6)和白細胞介素-8(IL-8)還被已知是在特應性疾病中誘發瘙癢的因子，栗子皮提取物可以有效地用于預防和治療來自特應性疾病的瘙癢癥預防。上述栗子皮是指覆蓋栗子樹果實的深褐色皮，本說明書中使用的栗子皮提取物是指選自栗子的內皮(嫩皮)、外皮及其混合物中的一種以上的提取物。上述栗子皮可以是來自任一種類的栗子的皮，沒有特別限制，例如可以是選自 ^ (Castanea crenata S. et Z.，Castanea mollissima Bi.，Castanea bulgaris) (Castanea Bungeana Bi.)禾口卓月鮮栗(Castanea crenata for. multicarpa (Uyeki) Chung) 中的一種以上的栗子的皮。作為栗子皮，可以使用栗子的內皮(嫩皮)，也可以使用栗子的外皮(外殼)，但特別確認了在經栗子外皮(外殼)提取物處理的組中可呈現優異的PAR-2 拮抗作用。上述栗子皮提取物的提取方法沒有特別限制，例如可以通過選自水、碳原子數為 1 4的低級醇、1，3- 丁二醇及其混合溶劑中的一種以上溶劑進行提取，上述溶劑例如可以是選自水、甲醇、乙醇、1，3_ 丁二醇、丁醇及其混合物中的一種以上，例如，上述栗子皮提取物可以由10 100%的醇水溶液或10 100%的1，3-丁二醇提取，具體而言，可以是栗子皮的20 90%乙醇水溶液提取物或10 70%的1，3-丁二醇提取物，更具體而言，可以是栗子皮的40 90%乙醇水溶液提取物或10 50%的1，3-丁二醇提取物，進一步具體而言，可以是栗子皮的60 90%乙醇水溶液提取物或20 40%的1，3-丁二醇提取物。上述組合物中所含的栗子皮提取物的含量沒有特別限制，但以組合物的總重量為基準，能以0. 005 80重量％的含量含有，優選能以0. 01 30重量％含有。若上述栗子皮提取物的含量過少，則效果變得甚微，若過多，則劑型的穩定度會變低。根據情況，為了緩和或抑制瘙癢癥、改善皮膚屏障、以及抑制免疫，栗子皮提取物也可以與抗組胺劑、類固醇劑、局部麻醉劑、免疫抑制劑中的一種或一種以上的物質并用。以往，用于緩和特應性皮炎和瘙癢癥的技術是服用抗組胺劑、將類固醇制劑作為外用劑進行涂布，但這些制劑具有即使呈現暫時的治療效果也很快復發這樣的缺點，進而， 報告了服用這些藥物時的中樞神經障礙、消化器官障礙等副作用。作為腎上腺皮質激素的類固醇制劑由于高效的消炎作用和免疫抑制作用而效果優異，但副作用也嚴重，報告了作為免疫抑制劑的他克莫司水合物軟膏對特應性皮炎的治療有效，但可能誘發皮膚癌，或者在皮膚損傷部位大量吸收到體內時誘發腎臟障礙，實際情況是在安全性方面考慮，難以長期使用。因此，將含有栗子皮提取物作為有效成分的組合物與抗組胺劑、類固醇劑、局部麻醉劑、免疫抑制劑中的一種或一種以上適當地并用時，能夠對瘙癢癥的緩和或抑制、皮膚屏障改善、以及免疫抑制等不伴有副作用而安全地顯示顯著的效果。上述藥學組合物還可以進一步含有防腐劑、穩定劑、水合劑或乳化促進劑、用于調節滲透壓的鹽和/或緩沖劑等藥用輔料以及其他在治療上有用的物質，除了常用的無機或有機載體以外，還能夠以固體、半固體或液狀的形態進行口服給藥，或者以非口服、直腸、局部、經皮、靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下等進行給藥，特別優選口服給藥。上述口服給藥制劑有例如片劑、丸劑、硬質和軟質膠囊劑、液體制劑、懸浮劑、乳齊U、糖漿劑、顆粒劑等，這些劑型除了有效成分以外還可以含有稀釋劑(例乳糖、葡萄糖、 蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素和甘氨酸)、潤滑劑(例二氧化硅、滑石、硬脂酸及其鎂或鈣鹽、以及聚乙二醇)。片劑還可以含有硅酸鋁鎂、淀粉糊、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷酮之類的結合劑，根據情況，可以含有淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽之類的崩解劑、吸收劑、著色劑、香味劑和甜味劑等藥劑學添加劑。上述片劑可以通過通常的混合、顆粒化或涂布方法而制備。另外，上述非口服給藥劑例如可以是皮膚外用劑，也可以是洗劑、軟膏、凝膠、霜、 貼劑或噴霧劑的劑型，但并不限于這些。上述健康食品組合物沒有特別限定劑型，例如可以制成片劑、顆粒劑、飲劑、糖蜜、 餐棒(diet bar)等劑型。對各劑型的健康食品組合物，除了有效成分以外，本領域技術人員可以毫無困難地將該領域通常使用的成分根據劑型或使用目的而適當地選定配合，與其它原料同時使用的情況下，能夠起到協同效果。上述有效成分的給藥量的確定在本領域技術人員的水準內，藥物的1日給藥用量根據要給藥的對象的進展程度、發病時期、年齡、健康狀態、合并癥等多種因素不同而異，但若以成人為基準，則一般可以將上述組合物1 500mg/kg、優選為30 200mg/kg按照1日分成1 2次進行給藥，上述給藥量無論用任何方法也不限定本發明的范圍。以下，通過實施例進一步詳細說明本發明，但下述實施例是用于例示本發明，本發明的范圍不被它們所限定。[實施例1]栗子皮提取物的制備1-1)栗子皮1，3_ 丁二醇提取物的制備利用30%的1，3_ 丁二醇(l，3-buthylene glycol)，使栗子皮在室溫下浸出3天。 接著，用250目、34!11、14111、0.54111大小的過濾器依次進行過濾。然后，在0 4°C下放置 6tanding)3天后，用0. 5μπι、0. 3μπι、0. 2μπι大小的過濾器依次進行過濾，得到栗子皮1， 3-丁二醇提取物。1-2)栗子皮乙醇提取物的制備
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利用70%乙醇，使栗子皮在室溫下浸出3天。接著，用250目、3 μ m、1 μ m、0. 5 μ m、 0. 3μπι、0. 2μπι大小的過濾器依次進行過濾。然后，在60°C下濃縮溶液后，在30°C下實施 18小時的真空干燥，得到粉末形態的栗子皮乙醇提取物。[試驗例1]栗子皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果(體外，胰蛋白酶處理，HEK 人表皮角質細胞)實驗前一天，將角質形成細胞(細胞株名HaCaT，獲取地點ATCC)在96孔(well) 板中以成為4X IO4細胞/孔的方式進行分株，然后在37°C、5% CO2的培養箱(incubator) 中培養M小時。24小時后，將96孔板用HBSS(Hanks，Balanced Salt solution)緩沖液清洗(washing) 2 次后，將反應緩沖液(reaction buffer :2uM Fluo-4-AM, 20 % Pluronic 酸，2. 5mM丙磺舒)加入細胞中。在37°C、5% CO2的培養箱(inciAator)中反應30分鐘， 在室溫下反應30分鐘后，用HBSS緩沖液清洗(washing) 2次，將栗子皮乙醇提取物分別以 lppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm和50ppm的濃度對細胞進行處理。反應10分鐘后， 用2U/ml胰蛋白酶(Trypsin)進行處理，測定80秒鐘的細胞內Ca2+濃度變化。細胞內Ca2+ 濃度變化的測定利用Fledtation 3(分子器件，美國)。在栗子皮乙醇提取物與胰蛋白酶 (Trypsin)處理后，求出測定80秒鐘的屈曲(flex)而得到的值中的最小值與最大值之差后，將該值與胰蛋白酶(Trypsin)處理時的最小值與最大值之差進行比較而求出抑制率。參照圖1，可以確認利用胰蛋白酶在PAR-2的N-末端剪切絲氨酸序列(sequence) 而使PAR-2活化的情況下，鈣離子流入細胞內，但經栗子皮提取物處理的組的情況下， PAR-2活化被抑制，鈣離子的流入顯著減少。[試驗例2]栗子皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果(體外，SLIGKV處理，HEK 人表皮角質細胞)實驗前一天，將角質形成細胞(細胞株名HaCaT，獲取地點ATCC)在96孔(well) 板中以成為4X IO4細胞/孔的方式進行分株，然后在37°C、5% CO2的培養箱(incubator) 中培養M小時。24小時后，將96孔板用HBSS(Hanks，Balanced Salt solution)緩沖液清洗(washing) 2 次后，將反應緩沖液(reaction buffer :2uM Fluo-4-AM, 20 % Pluronic 酸，2. 5mM丙磺舒)加入細胞中。在37°C、5% CO2的培養箱(inciAator)中反應30分鐘， 在室溫下反應30分鐘后，用HBSS緩沖液清洗(washing) 2次，將栗子皮乙醇提取物分別以 lppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm和50ppm的濃度對細胞進行處理。反應10分鐘后，用 5uMPAR-AP (SLIGKV)進行處理，測定80秒鐘的細胞內Ca2+濃度變化。細胞內Ca2+濃度變化的測定利用Fledtation 3 (分子器件，美國)。在栗子皮乙醇提取物與5uM PAR-AP (SLIGKV) 處理后，求出測定80秒鐘的屈曲(flex)而得到的值中的最小值與最大值之差后，將該值與 5uM PAR-AP(SLIGKV)處理時的最小值與最大值之差進行比較而求出抑制率。參照圖2，可以確認如果屬于活化肽的SLIGKV(人)作為直接配體發揮作用而使 PAR-2活化，則細胞內流入鈣離子，但經栗子皮提取物處理的組的情況下，PAR-2活化被抑制，鈣離子的流入顯著減少。[試驗例3]栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物的PAR-2活性抑制效果(體外，SLIGKV 處理，HEK:人表皮角質細胞)實驗前一天，將角質形成細胞(細胞株名HaCaT，獲取地點ATCC)在96孔(well) 板中以成為4X IO4細胞/孔的方式進行分株，然后在37°C、5% CO2的培養箱(incubator)中培養M小時。24小時后，將96孔板用HBSS (Hanks'Balanced Salt solution)緩沖液清洗(washing) 2 次后，將反應緩沖液(reaction buffer :2uM Fluo_4_AM，20% Pluronic 酸， 2. 5mM丙磺舒)加入細胞中。在37°C、5% CO2的培養箱(incubator)中反應30分鐘，在室溫下反應30分鐘后，用HBSS緩沖液清洗(washing) 2次，將栗子皮1，3- 丁二醇(BG)提取物分別以0. lw/v%,0. 5 八％和lw/v%的濃度對細胞進行處理。反應10分鐘后，用2U/ml 胰蛋白酶CTrypsin)或5uM PAR-AP(SLIGKV)進行處理，測定80秒鐘的細胞內Ca2+濃度變化。細胞內Ca2+濃度變化的測定利用FlexMation 3 (Molecular Device, USA) 經過栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物與2U/ml胰蛋白酶CTrypsin)或5uM PAR-AP (SLIGKV)處理后， 求出測定80秒鐘的屈曲(flex)而得到的值中的最小值與最大值之差后，將該值與經2U/ml 胰蛋白酶或5uM PAR-AP(SLIGKV)處理時的最小值與最大值之差進行比較而求出抑制率。參照圖3，可以確認胰蛋白酶或PAR-2活性肽(SLIGKV)導致的細胞內鈣離子的流入隨著栗子皮提取物的濃度變高而顯著減少。[試驗例4]栗子皮1，3_丁二醇(BG)提取物對由胰蛋白酶誘發的瘙癢癥的抑制效果觀察到在無毛小鼠(Hairless mice)中，將栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物(在 PBS緩沖液中)分別以lw/v^UOw/v1^和20W/V%的濃度同時進行注入，而使皮內(ID)注射胰蛋白酶(在PBS緩沖液中)200 μ g/部位所致的搔抓行為特性(scratching behavior) 按濃度得以抑制。各測定值以相對于2次基線(Baseline)測定平均值的百分率變化進行表示，將其結果示于圖4。參照圖4，1，3- 丁二醇(BG ；載體)處置組與1 %栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物處置組被觀察到沒有抑制由胰蛋白酶誘發的瘙癢的效果，但在10%、20%栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物處置組中觀察到抑制效果非常大。[試驗例5]栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物對由SLIGRL誘發的瘙癢的抑制效果觀察在無毛小鼠(Hairless mice)中，將栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物(在PBS 緩沖液中)分別以1%、10%和20%的濃度同時注入，而使皮內(ID)注射SLIGRL(小鼠 PAR-2活性肽，在PBS緩沖液中)50 μ g/部位所致的搔抓行為特性(scratching behavior) 按濃度得以抑制。各測定值用相對于2次基線(Baseline)測定平均值的百分率變化進行表示，將其結果示于圖5。參照圖5，可以觀察到從栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物處置組開始至10%、 20%栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物處置組，隨著栗子皮提取物的濃度增加，由SLIGRL誘發的瘙癢得以抑制的程度增加。[試驗例6]栗子皮乙醇提取物的皮膚涂布導致的抑制由SLIGRL誘發的瘙癢癥的效果對各試驗組進行皮膚涂布處理的栗子皮提取物均是溶解于將水、乙醇、1，3 丁二醇以5 3 2的比例進行混合的溶液中而使用，試驗濃度是將粉末形態的栗子皮乙醇提取物以1、3和10W/V%的濃度使用。載體(vehicle)組使用不添加實施例1的提取物而制作的制劑，作為瘙癢誘發物質，將PAR-2活性肽(Activating Peptide (SLIGRL，來自嚙齒類的肽))溶解于PBS緩沖液中，以50 μ g/處的濃度進行皮內注射。取栗子皮乙醇提取物的各試樣200 μ 1，以在無毛小鼠的背部部位廣泛伸展涂布的方式進行處理。分為上午和下午，1天2次，處理4天，第5天的上午，在瘙癢誘發物質注射 30分鐘前，進行最后的處理。為了比較瘙癢誘發物質(PAR-2活性肽、SLIGRL)所致瘙癢的增加和栗子皮乙醇提取物導致的瘙癢減少的有無，測定栗子皮乙醇提取物的皮膚涂布前2天每次測定40分鐘的搔抓次數，將計算2天的平均值而得到的值與刺激源注入后40分鐘的搔抓次數進行比較， 用百分比變化值表示。瘙癢的實驗從將無毛小鼠在注射瘙癢誘發物質20分鐘前裝入觀察用透明欄中而給予20分鐘適應時間開始。適應時間結束時，將瘙癢誘發物質(PAR-2活性肽；SLIGRL)對適應結束的試驗無毛小鼠的背部部位的皮膚進行皮內注射(intradermal injection)。注射結束時，直接將無毛小鼠再次裝入觀察用欄中后，測定40分鐘的后肢搔抓注射有瘙癢誘發物質的部位的次數。將用前足搔抓或者用嘴咬的行為排除在外，僅將用后足搔抓注射部位的行為作為瘙癢行為的指標進行測定。參照圖6，可以確認將栗子皮乙醇提取物(Chestnut Inner Bark Extract)涂布于皮膚后，在為10%的濃度時，即使在沒有給與瘙癢刺激的通常狀態下，搔抓次數也減少，在給與瘙癢刺激的情況下，從濃度開始搔抓次數減少。[試驗例7]栗子皮乙醇提取物的口服給藥導致的抑制由SLIGRL誘發的瘙癢癥的效果將實施例1中獲得的提取物對8周齡的雌性無毛小鼠(Hariless mice)進行口服給藥，觀察瘙癢抑制效果。對各試驗組進行口服給藥處理的栗子皮提取物均與蒸餾水混合而作為懸濁液使用，試驗濃度是將粉末形態的栗子皮乙醇提取物分別以200和500mg/Kg的濃度進行口服給藥。載體(vehicle)組沒有添加實施例1的提取物而使用純蒸餾水，作為瘙癢誘發物質，將 PAR-2活性肽(Activating P印tide (SLIGRL，來自嚙齒類的肽))溶解于PBS緩沖液中，以 50 μ g/處的濃度進行皮內注射。口服給藥是取適當量的上述試樣，以1日1次給藥5天，第5天的上午，在瘙癢誘發物質注射30分鐘前，進行最后的給藥。為了比較瘙癢誘發物質(PAR-2活性肽、SLIGRL)所致瘙癢的增加和栗子皮乙醇提取物口服給藥導致的瘙癢減少的有無，測定栗子皮乙醇提取物的口服給藥前2天每次測定 40分鐘的搔抓次數，將計算2天的平均值而得到的值與刺激源注入后40分鐘的搔抓次數進行比較，用百分比變化值表示。瘙癢實驗從將無毛小鼠在注射瘙癢誘發物質20分鐘前裝入觀察用透明欄中而給予20分鐘適應時間開始。適應時間結束后，將瘙癢誘發物質(PAR-2活性肽；SLIGRL)對適應結束的試驗無毛小鼠的背部部位的皮膚進行皮內注射(intradermal injection)。注射結束后，直接將無毛小鼠再次裝入觀察用欄中后，測定40分鐘的用后肢搔抓注射有瘙癢誘發物質的部位的次數。將用前足搔抓或者用嘴咬的行為排除在外，僅將用后足搔抓注射部位的行為作為瘙癢行為的指標進行測定。參照圖7，可以確認將栗子皮乙醇提取物進行口服給藥后，栗子皮對瘙癢刺激的抑制效果隨濃度而減少。[試驗例8]栗子皮提取物導致TNF-α的分泌減少
實驗前一天，將皮膚角化上皮細胞(Normalhuman skin IceratinocyteiNHEKjffI 售商L0nza)以成為5X104細胞/孔的方式在96孔(well)板中進行分株，然后在37°C、5% CO2的培養箱(incubator)中培養M小時。M小時后，用PBS清洗2次細胞，換成無血清 KBM(serum free KBM(角質形成細胞基底介質))。對各個孔(well)經栗子皮按濃度進行處理(10、25、50 111)，反應30分鐘后，分別用？654(10、50 111)、1^5(1 111)處理。在 37°C、5% CO2的培養箱(incubator)中培養M小時后，取出培養液，進行對TNF-α的ELISA。ELISA 利用制造公司(BD science)的實驗方法。參照圖8，可以觀察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的TNF- α分泌顯著減少。[試驗例9]栗子皮提取物導致IL-6的分泌減少進行對IL-6的ELISA，除此以外，利用與試驗例8實質上相同的方法。參照圖9，可以觀察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL_6分泌得到懸殊的抑制。[試驗例10]栗子皮提取物導致IL-Iα的分泌減少進行對IL-I α的ELISA，除此以外，利用與試驗例8實質上相同的方法。參照圖10，可以觀察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL-I α分泌量隨濃度增加而減少。[試驗例11]栗子皮提取物導致IL-8的分泌減少進行對IL-8的ELISA，除此以外，利用與試驗例8實質上相同的方法。參照圖11，可以觀察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL_8分泌顯著減少。[試驗例12]栗子皮提取物導致GM-CSF的分泌減少進行對GM-CSF的ELISA，除此以外，利用與試驗例8實質上相同的方法。參照圖12，可以觀察到隨著栗子皮的濃度增加，因PGSA和LPS而分泌的GM-CSF的量減少。[試驗例13]栗子皮提取物對胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致IL_6分泌的抑制效果實驗前一天，將皮膚角化上皮細胞(Normal human skin keratinocyte，NHEK，獲取地點L0nza)以成為5X104細胞/孔的方式在96孔(well)板中進行分株，然后在37°C、 5% CO2的培養箱(inciAator)中培養M小時。M小時后，用PBS清洗2次細胞，換成無血清KBM(serum free KBM(角質形成細胞基底介質))。用栗子皮提取物對各個孔(well)按濃度進行處理(10、50ppm)，反應30分鐘后，分別用胰蛋白酶(IOnM)或PAR-2活化肽(SLIGKV， 50uM)進行處理。在37°C、5% CO2的培養箱(inciAator)中培養M小時后，取出培養液， 進行對IL-6的ELISA。ELISA利用制造公司(BD science)的實驗方法。參照圖13，可以觀察到栗子皮提取物濃度依賴性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)導致的IL-6分泌。[試驗例14]栗子皮提取物對胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致IL_8分泌的抑制效果進行對IL-8的ELISA，除此以外，利用與試驗例13實質上相同的方法。參照圖14，可以觀察到栗子皮提取物濃度依賴性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)導致的IL-8分泌。
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[試驗例15]栗子皮提取物對胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致GM-CSF分泌的抑制效果進行對GM-CSF的ELISA，除此以外，利用與試驗例13實質上相同的方法。參照圖15，可以觀察到栗子皮提取物濃度依賴性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)導致的GM-CSF分泌。[試驗例16]測定栗子皮乙醇提取物的皮膚保濕效果評價實施例1的栗子皮乙醇提取物對長時間皮膚損傷的皮膚屏障功能恢復能力。 首先，在出生后經7 8周的年輕無毛小鼠(Orient，韓國)的背部(back)每日涂布1次口惡唑酮(oxazolone)，周期性地涂布6天，使實驗動物的皮膚屏障受到損傷。然后，用蒸發計(Delf in，芬蘭)測定經皮水分損失量CTrans印idermal Water Loss :TEWL)，將具有每小時顯示50g/m2以上經皮水分損失的皮膚的實驗動物進行分組，將1和5w/V%的栗子皮提取物分別以每5cm2皮膚面積為100 μ 1的容量，每日2次，連續涂布10天后，測定實驗動物的經皮水分損失量(TEWL)，將其結果示于圖16。如圖16所示，可知在對無毛小鼠進行ρ惡唑酮處理的過敏模型(Allergy model) 中，通過涂布栗子皮提取物，對由唑酮誘導的皮炎(特應性皮炎，atopic dermatitis)而導致增加的經皮水分損失量具有使損傷的屏障功能恢復而回到正常皮膚的功能。[試驗例17]測定栗子皮乙醇提取物改善角化過度的效果在實施例1中，評價栗子皮乙醇提取物改善皮膚角化過度的效果。首先，在出生后經7 8周的年輕無毛小鼠(Orient，韓國)的背部(back)每日涂布1次“惡唑酮(oxazolone)，周期性地涂布6天，使實驗動物的皮膚屏障受到損傷。然后，用蒸發計 (Delf in，芬蘭)測定經皮水分損失量CTrans印idermal Water Loss :TEWL)，將具有每小時顯示50g/m2以上經皮水分損失的皮膚的實驗動物進行分組，將試驗物質以每5cm2皮膚面積為100 μ 1的容量，每日2次，連續涂布10天后，夾起背部(back)的測定部位左右(雙折疊測量，two-folding measurement)，利用測微計(三菱，日本)測定皮膚厚度，將其結果示于圖17。參照圖17，可以確認通過使用栗子皮提取物的粉末，對由0悉唑酮(oxazolon)誘發的皮炎而導致增加的皮膚厚度顯示出抑制皮膚角化過度的效果。[試驗例18]測定栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中減少IgE和改善瘙癢癥的效果在實施例1中，用NC/Nga小鼠模型評價栗子皮乙醇提取物的血清內IgE減少和瘙癢改善效果。首先，將出生后經7 8周的年輕NC/Nga小鼠的背部(back)部位利用剪毛機(clipper)進行脫毛，將殘余的毛利用脫毛膏完全除去。對露出的背部部位和耳廓部位， 將Df (粉塵螨(dermatophagoides farinae)) IOOmg以一周2次在3周中均勻地涂布4次， 而誘發特應性疾病。以一周5次在3周中將栗子皮提取物分成100mg/kg和250mg/kg的2 組進行給藥后，為了測定瘙癢癥，將NC/Nga小鼠裝入觀察用欄后，測定在2小時之間用后肢搔抓背部部位的次數。將用前足搔抓或者用嘴咬的行為排除在外，僅將用后足搔抓的行為作為瘙癢行為的指標進行測定。血清IgE的測定為從通過眼窩靜脈叢進行采血的血液樣品分離血清，利用BD科學(BD science)的Opt IgE試劑盒(Opt IgE kit)實施ELISA而進行測定。圖18中表示在250mg/kg給藥組中瘙癢與非處理組相比減少，參照圖19，可以確認在250mg/kg的給藥組中顯著地表現出IgE的減少。[試驗例19]栗子外皮乙醇提取物與栗子內皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果的比較(體外，SLIGKV處理，HEK 人表皮角質細胞)將栗子的外皮和內皮進行分離而干燥后，按照與實施例1-2)相同的方法制備栗子外皮提取物，栗子內皮提取物也按照與實施例1-2)相同的方法制備。使用與試驗例2相同的方法來測定栗子外皮乙醇提取物與栗子內皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果，并示于下述表2和圖20中。表權利要求
1.一種用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物，其中，含有栗子皮提取物作為有效成分。
2.根據權利要求1所述的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物緩和或抑制由包括炎癥性皮炎、特應性皮炎、肌膚皸裂所致的皮炎、痱子、潰瘍、凍傷、接觸性皮炎、脂溢性皮炎、銀屑病及副銀屑病的皮炎中的任一種以上誘發的瘙癢癥。
3.根據權利要求1所述的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物緩和或抑制由特應性皮炎誘發的瘙癢癥。
4.一種用于改善皮膚屏障功能的健康食品或藥學組合物，其中，含有栗子皮提取物作為有效成分。
5.根據權利要求4所述的用于改善皮膚屏障的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物用于緩和來自特應性皮炎的皮膚屏障損傷或者改善皮膚屏障的恢復力。
6.根據權利要求4所述的用于改善皮膚屏障的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物用于增進皮膚保濕或防止皮膚角化過度。
7.一種用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物，其中，含有栗子皮提取物作為有效成分。
8.根據權利要求7所述的用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物用于特應性疾病的預防或治療。
9.根據權利要求7所述的用于抑制免疫的健康食品或藥學組合物，其中，所述組合物用于特應性的治療。
10.一種用于改善或治療特應性皮炎的健康食品或藥學組合物，其中，含有栗子皮提取物作為有效成分。
11.根據權利要求1 10中任一項所述的健康食品或藥學組合物，其中，以組合物的總重量為基準，以0. 005 80重量％的含量含有所述栗子皮提取物。
12.根據權利要求1 10中任一項所述的健康食品或藥學組合物，其中，所述栗子皮是選自栗子的內皮、外皮及它們的混合物中的一種以上。
13.根據權利要求12所述的健康食品或藥學組合物，其中，所述栗子皮是栗子的外皮， 即外殼。
14.根據權利要求1 10中任一項所述的健康食品或藥學組合物，其中，所述栗子皮提取物是通過選自水、碳原子數為1 4的低級醇、1，3_丁二醇及它們的混合溶劑中的一種以上的溶劑進行提取的。
15.根據權利要求14所述的健康食品或藥學組合物，其中，所述栗子皮提取物是通過選自水、甲醇、乙醇、丁醇、1，3_ 丁二醇及它們的混合物中的溶劑進行提取的。
全文摘要
本發明涉及含有栗子皮提取物作為有效成分的用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物。本發明涉及的健康食品或藥學組合物中所含的栗子皮提取物在本發明的一個實施例中被確認通過抑制作為瘙癢刺激源的蛋白分解酶活性受體-2(Proteinase-Activated Receptor-2PAR-2)的活性，從而可以發揮優異的緩和或抑制瘙癢癥的效果，結果可以適合用作用于緩和或抑制瘙癢癥的健康食品或藥學組合物的有效成分。
文檔編號A23L1/30GK102458156SQ201080035903
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月18日 優先權日2009年6月18日
發明者尹偵訓, 尹晙源, 徐姃我, 朱泳協, 樸永鎬, 李昌錫, 林慶珉, 沈范, 金善暎, 金赫, 高在濚 申請人:株式會社愛茉莉太平洋