專利名稱：在無谷氨酰胺的細胞培養基中的蛋白質生產的制作方法
技術領域：
本發明大體上涉及無谷氨酰胺的細胞培養基。本發明還涉及在無谷氨酰胺的哺乳動物細胞培養物中生產重組蛋白質，例如抗體。
背景技術：
哺乳動物細胞已成為生產用于臨床應用的哺乳動物蛋白質的主要系統，這主要是由于其產生正確折疊和組裝的異源蛋白質的能力，及其翻譯后修飾能力。通常在異源蛋白質(包括抗體)的重組生產期間，在細胞培養基中含有谷氨酰胺。L-谷氨酰胺是一種必需氨基酸，認為其是培養細胞的主要能量和氮來源。大多數市售的培養基的配方中含有游離的 L-谷氨酰胺，其或者包含在基礎配方中，或在使用時加入液體培養基制劑。因此，所有哺乳動物細胞培養基包含谷氨酰胺，但轉染了谷氨酰胺合成酶的細胞系，例如GS NSO和GS CHO 細胞系例外，其中細胞自身生產生長所需的谷氨酰胺。谷氨酰胺以多種濃度被廣泛使用，一般在基礎培養基中為從1至20mM，在用于補料分批方法的飼料中濃度高得多。例如，L-谷氨酰胺的濃度在Ames’培養基中為0. 5mM，在MCDP培養基131中為10mM。DMEM/Ham營養混合物F-12(50 50)經常被用作用于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的專用培養基的起始制劑。 在DMEM/Ham營養混合物F-12中的L-谷氨酰胺是2. 5mM。在無血清/無蛋白質的雜交瘤細胞培養基中的L-谷氨酰胺濃度是2. 7mM。在DMEM，GMEM，IMDM和H-Y培養基中的L-谷氨酰胺是4mM，其中IMDM經常被用作雜交瘤細胞專用培養基的起始制劑。一般認為，雜交瘤細胞在高于培養基中可見的平均水平的L-谷氨酰胺濃度中生長得更好(Dermis R. Conrad, Glutamine in Cell Culture, Sigma-Aldrich Media Expert)。據顯示，谷氨酰胺是在細胞培養物中積累的氨的主要來源(見Markus Schneider, et. al. 1996, Tournal of Biotechnology 46 161-185 的綜述)。因此，降低細胞培養基中的谷氨酰胺顯著減少NH4+水平的積累，導致較低的細胞毒性(見Markus Schneider, et. al. 1996，同上)。減少的NH4+細胞毒性導致較高的細胞活力，因此延長了培養壽命。基于使用CHO細胞的估計的谷氨酰胺消耗研究，提出細胞可能以0. 3-0. 4mM/天的速度消耗谷氨酰胺(Miller, et. al. 1988，Biotechnol. Bioeng. 32 :947-965)。Altamirano 等人(2001,1. Biotechnol. 110 :171-9)研究了用谷氨酸替換谷氨酰胺的效果、和谷氨酸和葡萄糖代謝之間的平衡對生產重組人組織纖溶酶原激活物(rhut-PA)的CHO細胞的再分配的影響。當用谷氨酸替換谷氨酰胺和用葡萄糖分解代謝平衡(碳氮比，C/N比)時，發現細胞代謝發生再分配，且不得不以更有利于產生rhut-PA的方式利用碳和能量來源。也有報導， 在粘附培養中的CHO細胞可在缺乏外加的谷氨酰胺的情況下生長，這是由于允許細胞從培養基中的谷氨酸合成谷氨酰胺的內源谷氨酰胺合成酶活性(Sanfeliu和M^hanopoulos， 1999，Biotechnol. Bioeng. 64 :46-53)。然而，相比在含有谷氨酰胺的培養基中的對照培養物，在無谷氨酰胺的培養基中的細胞生長率較低，且分布在G0/G1期的細胞比例提高。谷氨酰胺和谷氨酸二者的耗盡的確導致細胞死亡。發明概述本發明是基于，至少部分基于以下意料之外的發現，S卩，使用無谷氨酰胺的生產培養基不僅可在哺乳動物宿主細胞中無任何顯著副作用地生產重組蛋白質，而且實際上在生產期中使用無谷氨酰胺的培養基顯著提高了細胞活力、培養壽命、單位生產率和/或最終的重組蛋白質滴度。本發明也基于以下意料之外的發現，S卩，在使用無谷氨酰胺的生產培養基的哺乳動物宿主細胞中，對無谷氨酰胺的生產培養基加入天冬酰胺可進一步增強細胞活力、培養壽命、單位生產率和/或最終的重組蛋白質滴度，而無任何顯著的副作用。在一個方面，本發明涉及在表達多肽的哺乳動物宿主細胞中生產所述多肽的方法，其包括在補充天冬酰胺的無谷氨酰胺生產培養基中培養處于培養生產期中的哺乳動物宿主細胞。在一個實施方案中，哺乳動物宿主細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在另一個實施方案中，哺乳動物宿主細胞是dhfr_CH0細胞。在另一個實施方案中，生產培養基是無血清的。在另外的實施方案中，生產培養基包含一種或多種選自下述的成份1)能量來源；2)必需氨基酸；3)維生素；4)游離的脂肪酸；和5)微量元素。在另外的實施方案中，其中生產培養基另外包含一種或多種選自下述的成份a)激素和其他生長因子；b)鹽和緩沖液；和c)核苷。在所有實施方案中，生產期可例如為分批或補料分批培養期。在所有實施方案中，所述方法可另外包括分離所述多肽的步驟。在另外的實施方案中，在分離后可測定分離后的細胞活力、培養壽命、單位生產率和最終的重組蛋白質滴度中的一項或多項。在另外的實施方案中，相比在含有谷氨酰胺的相同組成的生產培養基中生產的相同多肽，細胞活力、培養壽命、單位生產率和最終的重組蛋白質滴度中的至少一項提高。在另外的方面，本發明涉及用于在生產期生產多肽的立即可用的無谷氨酰胺細胞
培養基。在另一個實施方案中，多肽是哺乳動物糖蛋白。在其他實施方案中，多肽選自抗體、抗體片段和免疫粘附素。在所有實施方案中，多肽可為例如抗體，或抗體的生物學功能片段。代表性抗體片段包括Fab，Fab' ,F(ab' )2，scFv, (scFv)2, dAb，互補決定區(CDR)片段，線性抗體，單鏈抗體分子，微型抗體(minibody)，雙抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。在另外的實施方案中，抗體或抗體片段是嵌合的、人源化的或人的。治療抗體包括，但不限于，抗HER2抗體抗⑶20抗體；抗IL_8抗體；抗VEGF抗體； 抗CD40抗體，抗CDlla抗體；抗CD18抗體；抗IgE抗體；抗Apo_2受體抗體；抗組織因子 (TF)抗體；抗人α 4β 7整聯蛋白抗體；抗EGFR抗體；抗⑶3抗體；抗⑶25抗體；抗⑶4抗體；抗CD52抗體；抗Fc受體抗體；抗癌胚抗原(CEA)抗體；針對乳腺上皮細胞的抗體；結合結腸癌細胞的抗體；抗⑶38抗體；抗⑶33抗體；抗⑶22抗體；抗EpCAM抗體；抗GpIIb/ IIIa抗體；抗RSV抗體；抗CMV抗體；抗HIV抗體；抗肝炎抗體；抗CA 125抗體；抗α ν β 3 抗體；抗人腎細胞癌抗體；抗人17-1Α抗體；抗人結直腸腫瘤抗體；針對GD3神經節苷脂的抗人黑色素瘤抗體R24;抗人鱗狀細胞癌；和抗人白細胞抗原(HLA)抗體，和抗HLA DR抗體。在其他實施方案中，治療抗體是結合HER受體，VEGF, IgE, CD20，CDl la，CD40，或 DR5的抗體。在其他實施方案中，治療抗體是抗BR3抗體或BR3-FC免疫粘附素。在本發明的方法的其他實施方案中，在重組宿主細胞中表達的多肽是治療多肽。 例如，治療多肽可選自生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原； 促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，組織因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白質C ；心房利鈉因子(atrial natriuretic factor)；肺表面活性物質；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子- α和- β ；腦啡肽酶；RANTES (受活化調節，由正常T細胞表達和分泌的因子)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，如β -內酰胺酶；DNA酶；IgE ；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4;抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白質A或D ；類風濕因子；神經營養因子如骨源神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3，-4，-5，或-6 (ΝΤ-3，ΝΤ-4，ΝΤ-5，或ΝΤ-6)，或神經生長因子如NGF- β ；血小板源生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF ；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF) 如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β 1，TGF- β 2，TGF- β 3，TGF- β 4，或 TGF- β 5 ；胰島素樣生長因子-I和-II (IGF-I和IGF-II) ；des (1-3) -IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD3, CD4, CD8,⑶19，⑶20，CD34，和CD40 ；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β，和-Y ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF,GM-CSFjP G-CSF ；白介素(IL)，例如，IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白如⑶11a，⑶11b，⑶11c，⑶18，ICAM，VLA-4和VCAM ；腫瘤相關抗原如HER2，HER3或HER4受體；和所述多肽的片段。在所有實施方案中，重組宿主細胞可為真核宿主細胞，如哺乳動物宿主細胞，包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。這些和其他方面從包括實施例的以下描述和隨附的權利要求書中將是顯而易見的。附圖簡述

圖1.評估不同濃度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子實驗設計(DOE)的滴度結果的Apomab抗體立方圖分析。模型預測，在補充IOmM天冬酰胺、 IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺的培養基中獲得最高滴度。
圖2.評估不同濃度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子實驗設計的滴度結果的BR3-FC免疫粘附素立方圖分析。模型預測，在補充IOmM天冬酰胺、 IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺的培養基中獲得最高滴度。圖3.評估不同濃度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子實驗設計的滴度結果的抗VEGF抗體立方圖分析。模型預測，在補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺的培養基中獲得最高滴度。圖4.在無谷氨酰胺、低谷氨酸和高天冬氨酸的條件下，天冬酰胺對Apomab抗體滴度的影響。在無谷氨酰胺的培養基中，相比無天冬酰胺的無谷氨酰胺培養，2. 5-15mM天冬酰胺的存在顯著提高了 Apomab抗體滴度。在這些條件下，存在或缺乏谷氨酸對滴度沒有影響。圖5.在無谷氨酰胺和低谷氨酸條件下，在不同天冬酰胺和天冬氨酸濃度下產生的Apomab抗體滴度。當在這些條件下將天冬氨酸從O提高至IOmM時，觀察到正向滴定效^ ο圖6. A-C.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺培養基對滴度的影響。相比含有谷氨酰胺的培養基，在無谷氨酰胺的培養基中Apomab抗體、抗 VEGF抗體和BR3-Fc免疫粘附素的最終滴度顯著更高。圖7A和B.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的DMEM/F12無谷氨酰胺培養基對滴度的影響。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培養基，在無谷氨酰胺的DMEM/ F12培養基中Apomab抗體和抗VEGF抗體的最終滴度顯著更高。圖8A-C.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺培養基對細胞單位生產率(Qp)的影響。相比含有谷氨酰胺的培養基，在無谷氨酰胺的培養基中 Apomab抗體、抗VEGF抗體和BR3_Fc免疫粘附素的細胞單位生產率顯著更高。圖9A和B.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的DMEM/F12無谷氨酰胺培養基對細胞單位生產率(Qp)的影響。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培養基，在無谷氨酰胺的DMEM/F12培養基中Apomab抗體和抗VEGF抗體的細胞單位生產率顯著更高。圖10A-C.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺培養基對細胞活力的影響。相比含有谷氨酰胺的培養基，在無谷氨酰胺的培養基中對于Apomab抗體、抗VEGF抗體和BR3-Fc免疫粘附素的細胞活力顯著更高。圖IlA和B.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的DMEM/F12無谷氨酰胺培養基對細胞活力的影響。在DMEM/F12培養基中，細胞活力在無谷氨酰胺的培養基中沒有被一致地改善。相比含有谷氨酰胺的培養基，對于Apomab抗體，細胞活力較高，但對于抗VEGF抗體，細胞活力較低。圖12A-C.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的無谷氨酰胺培養基對氨形成的影響。相比含有谷氨酰胺的培養物，在無谷氨酰胺的培養物中氨通常較低。圖13A和B.補充IOmM天冬酰胺、IOmM天冬氨酸和ImM谷氨酸的DMEM/F12無谷氨酰胺培養基對氨形成的影響。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培養基，在無谷氨酰胺的 DMEM/F12培養基中氨顯著減少。發明詳述A.定義
術語“細胞培養基”、“培養基”和“營養混合物”指用于培養哺乳動物細胞的營養液，其一般提供一種或多種以下類別中的至少一種成分1)能量來源，通常以碳水化合物的形式，如葡萄糖；2) 一些或所有必需氨基酸，和通常是20個氨基酸的基本集合加上胱氨酸；3)維生素和/或其他一般以低濃度需要的有機化合物；4)游離的脂肪酸；和5)微量元素，其中將微量元素定義為一般以極低濃度(通常在微摩爾范圍內)需要的無機化合物或天然存在的元素。可任選地對營養混合物補充任意以下類別的一種或多種成分a)激素和其他生長因子，例如胰島素、轉鐵蛋白和表皮生長因子；b)鹽和緩沖液，例如鈣、鎂和磷；和c)核苷，例如腺苷和胸苷。當培養基基本上不含任何哺乳動物來源的血清(例如胎牛血清(FBQ )時，細胞培養基大體上是“無血清的”。“基本上不含”是指細胞培養基包含約0-5%之間的血清，優選地約0-1%之間的血清，和最優選地約0-0. 之間的血清。有利地，可使用無血清的“成分明確的”培養基，其中培養基中的每種成分的身份和濃度是已知的(即在培養基中不存在如牛垂體提取物(BPE)的不明確的成分)。在本發明的上下文中，措辭“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，且所有這些名稱包括后代。因子，詞語“轉化體”和“轉化的(宿主)細胞”包括原代所述細胞和源自其的培養物，與轉移次數無關。也應當理解，由于故意或無意突變，所有后代在DNA含量上可能不完全相同。包括具有與用于篩選原始轉化細胞的功能或生物學活性相同的突變的后代。當旨在表示不同的定義時，從上下文中將是顯而易見的。術語“動物宿主細胞”、“動物細胞”、“動物重組宿主細胞”等等包含無脊椎動物、 非哺乳動物脊椎動物(例如鳥、爬行動物和兩棲動物)和哺乳動物細胞。無脊椎動物細胞的實例包括以下昆蟲細胞草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果妮)禾口家香(Bombyx mori)。見，例如 Luckow 等人，Bio/Technology，6 47-55(1988) ；Miller 等人，in Genetic EnRineering, Setlow, J. K.等人，編，卷 8 (Plenum Publishing, 1986)，第 277-279 頁；和 Maeda 等人，Nature, 315 :592-594 (1985)。術語“哺乳動物宿主細胞”、“哺乳動物細胞”、“哺乳動物重組宿主細胞”等等指源自哺乳動物的細胞系，當其被置于單層培養或懸浮培養中時能夠在含有合適的營養物和生長因子的培養基中生長和存活。用于特定細胞系的必需營養物和生長因子是容易根據經驗確定的，不需要過度的實驗，如在例如Mammalian Cell Culture (Mather, J. P.編，Plenum Press, N. Y. (1984))，和 Barnes 和 Sato (Cell, 22 :649 (1980))中描述。一般細胞能夠表達和分泌大量特定目的蛋白(一般是重組蛋白質)至培養基中，并為了此目的培養所述細胞。 然而，也可為了多種其他目的培養細胞，且本發明的范圍不局限于僅為了生產重組蛋白質培養細胞。能夠在本發明的培養基中生長的合適的哺乳動物細胞系包括用SV40轉化的猴腎 CVI 系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系 (Graham 等人，J. Gen. Virolo.，36 59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC (R)CCL 10)；小鼠塞爾托利細胞(TM4, Mather, Biol.Reprod. ,23 :243(1980))；猴腎細胞(CVI_76，ATCC (R)CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76， ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34) ；Buffalo 大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(Wl38, ATCC CCL 75)； 人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤細胞(MMT 060562，ATCC (R)CCL 51)；大鼠肝細胞瘤細胞(HTC，MI. 54，Baumann 等人，J. Cell Biol. ,85 :1(1980))和 TR-I 細胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 :44(1982))以及雜交瘤細胞系。中國倉鼠卵巢細胞⑴rlab 和Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,77 :4216(1980))是實踐本發明的優選細胞系。在以下文檔中也描述了適用于本發明的方法的CHO細胞1989年8月四日公開的EP 117，159 ； 美國專利號 4，766，075 ；4，853，330 ；5，185，259 ；Lubiniecki 等人，在 Advances in Animal Cell BioloRY and TechnoloRY for Bioprocesses, Spier 等人，編(1989)，第 442-451 頁中。適用于本文的已知CHO衍生物包括，例如CH0/-DHFR(Urlaub和Chasin，Proc. Nati. Acad. Sci. USA,77 :4216 (1980)),CH0-K1DUX Bll(Simonsen和 Levinson，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :2495-2499 (1983) ；UrIaub 和 Chasin，同上)，和 dp 12. CHO 細胞(1989 年 3 月15日公開的EP 307，M7)。優選的宿主細胞包括CH0-K1 DUX Bll和dp 12. CHO細胞。"dhfrXHO細胞”指二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的CHO細胞。在哺乳動物細胞中生產重組蛋白質允許制造許多用于臨床應用的大的、復雜糖基化的多肽。中國倉鼠卵巢 (CHO)DHFR-細胞和可擴增的選擇標記物DHFR被常規地用于建立生產臨床有用的大量產物的細胞系(Urlab，G.和 Chasin，L. Α. (1980)Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77,4216-4220 ； Kaufman, R. J.禾口 Sharp，P. (1982) J. Mol. Biol. , 159,601-621 ；Gasser, C. S. ， Simonsen, C. S.，Schilling, J. W.和 Schmike, R. Τ. (1982) Proc. NatlSci. USA, 79,6522-6526)。“時期”指技術人員熟知的細胞培養的特定時期。細胞培養的“生長期”指細胞通常快速分裂的指數細胞生長期(對數期)。在這期間，在使細胞生長最大化的條件下培養細胞一段時間，通常在1-4天之間。無需過度實驗可對預想的特定宿主細胞測定宿主細胞的生長周期。在生長期間，一般在約30-40°C，優選約 37°C下，在潮濕的受控環境下，在含有必需添加劑的營養培養基中培養細胞，以致獲得對特定細胞系的最優生長。在生長期維持細胞約1-4天之間，通常約2-3天之間的時期。細胞培養的“過渡期(Transition phase) ”指這樣的時期，期間采用生產期的培養條件。在過渡期間，將環境因素如溫度從生長條件轉變為生產條件。細胞培養的“生產期”指這樣的時期，期間細胞生長達到穩定。在生長期間，對數細胞生長結束且蛋白質生產是主要的。在此時期中一般補充培養基以維持連續的蛋白質生產和獲得預期的蛋白質產物。詞組“補料分批細胞培養”當在本文中使用時指分批培養，其中最初對培養容器提供動物(例如哺乳動物)細胞和培養基，并在培養期間對培養物連續地或以不連續的增量供應另外的培養營養物，在培養終止前進行或不進行周期性的細胞和/或產物收獲。補料分批培養包括“半連續補料分批培養”，其中周期性地移除全部培養物(包括細胞和培養基)并用新鮮培養基替換。補料分批培養與簡單的“分批培養”有區別，在后者中在培養過程的開始對培養容器提供用于細胞培養的所有成分(包括動物細胞和所有培養營養物)。 在培養過程期間不從培養容器中取出上清的情況下，補料分批培養還可有別于灌注培養 (在灌注培養中，通過例如過濾、封裝、錨定在微載體上等等在培養中約束細胞，并連續或間歇地引入和從培養容器中取出培養基)。考慮，設想在補料分批細胞培養期間為了檢測的目的取出樣品。當在本文中使用時，術語“谷氨酰胺”指氨基酸L-谷氨酰胺(又被稱為“Gin”和 “Q”，分別為三字母和單字母名)，其被公認為用于蛋白質合成的氨基酸構件和在細胞培養中的能量來源二者。因此，術語“谷氨酰胺”和“L-谷氨酰胺”在本文中可互換使用。詞語“葡萄糖”指單獨或組合的α -D-葡萄糖或β -D-葡萄糖。值得注意的是，α 和β葡萄糖形式在溶液中可互相轉化。措辭“滲透壓摩爾濃度”是在水溶液中溶解的溶質顆粒的滲透壓的測量。溶質顆粒包括離子和非電離的分子二者。滲透壓摩爾濃度以溶解在Ikg水中的滲透活性顆粒(即滲透壓摩爾)的濃度(在38°C的ImOsm/kg H2O相當于19mm kg的滲透壓)。“滲透壓摩爾濃度”指在IL溶液中溶解的溶質顆粒數。可加入培養基從而增加其滲透壓摩爾濃度的溶質包括蛋白質、肽、氨基酸、非代謝的聚合物、維生素、離子、鹽、糖、代謝物、有機酸、脂，等等。在優選的實施方案中，提高培養基中的氨基酸和NaCl濃度以獲得本文陳述的預期滲透壓摩爾濃度范圍。當在本文中使用時，縮寫“mOsm”描述“毫滲透壓摩爾/kg H20”。如本文使用的術語“細胞密度”指在給定體積的培養基中存在的細胞數。如本文使用的術語“細胞活力”指在給定的培養條件或實驗變量的組合下培養細胞的存活能力。如本文使用的該術語也指相對在特定時間的培養中的活的和死的總細胞數，在該時間存活的細胞部分。術語“氨基酸”指所有天然存在的其D和L立體異構型二者的α氨基酸，及其類似物和衍生物。將類似物定義為將氨基酸中的原子取代為通常具有類似性能的不同原子。 將衍生物定義為這樣的氨基酸，其具有與其連接的另一種分子或原子。衍生物將包括，例如氨基的乙酰化，羧基的胺化或2個半胱氨酸分子的硫殘基的氧化以形成胱氨酸。術語“蛋白質”旨在指這樣的氨基酸序列，其鏈長度足以產生更高水平的三級和/ 或四級結構。其與不具有這樣的結構的“肽”或其他小分子量藥物有區別。本文的蛋白質一般具有至少約15_20kD，優選至少約20kD的分子量。在本文的定義中包含的蛋白質的實例包括所有哺乳動物蛋白質，特別是治療和診斷蛋白質，例如治療和診斷抗體，和一般含有一個或多個二硫鍵的蛋白質，包括包含一個或多個鏈間和/或鏈內二硫鍵的多鏈多肽。術語“治療蛋白質”或“治療多肽”指在疾病的治療中使用的蛋白質，不考慮其適應癥(indication)或作用機制。為了使治療蛋白質可用于臨床，其必須被大量制造。取決于生產的蛋白質和需求，治療蛋白質或其他蛋白質的“制造規模”的生產利用范圍從約400L 至約80，000L的細胞培養物。一般這樣的制造規模生產利用從約400L至約25，000L的細胞培養規模。在此范圍內，利用特定的細胞培養規模，如4，000L,約6，000L,約8，000,約 10，000，約 12，000L,約 14，000L,或約 16，OOOL0如本文使用的，“目的多肽”一般指具有大于約10個氨基酸的肽或蛋白質。多肽對宿主細胞可為同源的，或優選地可為外源的，這表示其對利用的宿主細胞是異源的，即外來的，例如由非人哺乳動物，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產的人蛋白質。優選地，使用哺乳動物多肽(最初來源于哺乳動物生物的多肽)，更優選地所述多肽被直接分泌進培養基。 術語“多肽”或“目的多肽”特別地包括抗體，特別是結合哺乳動物多肽，如以下列出的任意哺乳動物多肽或其片段的抗體，以及免疫粘附素(多肽-Ig融合物)，如包含以下列出的任意哺乳動物多肽或其片段的那些。哺乳動物多肽的實例包括，但不限于，跨膜分子(例如受體)和配體，如生長因子。示范性多肽包括以下分子，如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；干擾素如干擾素-α，- β，和-Y ；脂蛋白； α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素； 胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，組織因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白質C ；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，包括t-PA變體；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(受活化調節，由正常T細胞表達和分泌的因子)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質；松弛素A 鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，如β-內酰胺酶；DNA酶； IgE ；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4 ；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白質A或D ；類風濕因子；神經營養因子如骨源神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3，-4，-5，或-6(ΝΤ-3，ΝΤ-4，ΝΤ-5，或ΝΤ-6)，或神經生長因子如NGF-β ；血小板源生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)如 TGF-α 禾口 TGF-β，包括 TGF-β 1，TGF-β 2，TGF-β 3， TGF-β 4，或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II(IGF-I 和 IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；⑶蛋白如CD3, CD4, CD8,⑶19，⑶20，CD34，和CD40 ； 紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β， 和-Y ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF, GM-CSF,和G-CSF ；白介素(IL)，例如，IL-I 至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如，例如， AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白如⑶11a，⑶11b， CDllc，CD18，ICAM，VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關抗原如 HER2，HER3 或 HER4 受體；Apo2L/TRAIL， hedgehog，分裂原活化蛋白激酶(MARK)和任意上述列出的多肽的片段。在例如美國申請
發明者C·T·彼得拉格利亞, M·加夫利特澤克, S·羅 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司